Esta pesquisa foi financiada em parte pelo NIH RO3-EB007299-02 e Prêmio NSF EPSCoR First.

1. Preparação Construct tecido O tecido construir processo de preparação consiste em três etapas principais: expansão da população de células, semeando de células sobre um andaime biomaterial, e diferenciação através da utilização de moléculas químicas de sinalização. O procedimento para a preparação de construção baseia-se métodos conduzidos por Dennis et al., Et Hong ai., E Marion e Mao 8,9,10. <ol><li> Após o cultivo e expansão da linha de células, as sementes das células estaminais mesenquimais humanas (h MSCs) sobre uma esponja de gelatina (4 mm de diâmetro, 3,5 mm de espessura) com uma densidade de 1x10 6 células / ml para o osso e 3x10 6 células / ml para formação adiposo. </li><li> Para a diferenciação de h MSCs em adiposo, aplicam-se os meios de comunicação adiposos de indução que consistem em 1 a dexametasona uM, 0,5 uM isobutil-metilxantina, 10 ug / ml de insulina humana recombinante, e 200 uM de indometacina em meio de expansão celularuma vez que as células aparecem confluente no cadafalso. Após três dias, substituir o meio com 10 ug / ml de insulina humana recombinante em meios de dilatação para 24 horas depois voltar para meios de indução. Repetir o ciclo de três vezes e, em seguida, trocar apenas em meio de manutenção de dois em dois dias. </li><li> Para induzir a osteogénese, preparar meios de indução osteogénicas fazendo uma concentração final de 0,1 mM a dexametasona, 50 mM de ácido L-ascórbico 2phosphate-, e 10 mM de β-glicerofosfato em meio de expansão celular. Substituir por novos meios de comunicação osteogênicas a cada dois dias. </li></ol> 2. Caracterização do atuador Caracterização do atuador é um passo vital para o experimento MRE. MRE baseia-se na propagação de ondas mecânicas de cisalhamento para avaliar os valores locais de propriedades mecânicas e, portanto, estas vibrações mecânicas precisam de ser gerado e caracterizado no tecido de interesse usando um actuador piezoeléctrico. Um exa ilustradomple no processo de caracterização é mostrado na Figura 3. O objectivo deste procedimento é a de optimizar o movimento do actuador, a fim de gerar uma onda de cisalhamento inofensivos com amplitudes significativas (~ 250 micra). <ol><li> Antes do experimento, aplicar 0,5% de gel de agarose para delimitar o construto num tubo de ensaio de 10 mm. A temperatura do gel deverá ser de aproximadamente 37 ° C para minimizar os danos ao construir. </li><li> Depois de permitir que as de gel de agarose cinco minutos para definir a temperatura ambiente, introduzir a ponta do motor piezoeléctrico de flexão para dentro da superfície do gel. </li><li> Ligar o tubo contendo a amostra e para o actuador de um suporte rígido, e orientar o feixe do laser Doppler Vibrometer para a ponta do actuador mecânico. Ajustar o posicionamento do sistema para optimizar o sinal reflectido, utilizar fita reflectora, se necessário. </li><li> Com base na frequência de ressonância esperada do actuador mecânico, definir o gerador de função para varrer o dgama de frequências esired (isto é, 20 a 2000 Hz nesta experiência), utilizando uma voltagem de funcionamento de 20 Vpp com um sinal de ruído branco. </li><li> Ver o espectro caracterizado sobre o programa de Vibrosoft Polytec para identificar a frequência de ressonância do sistema e definir o programa para FFT e velocidade como o eixo y. </li><li> Para a medição do deslocamento, definir o actuador para entregar uma sinusóide contínua na frequência de ressonância indicado utilizando uma tensão de funcionamento de 200 Vpp, e observe o deslocamento gerado a ser entregue à superfície do gel. Definir Vibrosoft para exibir a FFT com deslocamento como o eixo y. </li></ol> 3. Aquisição de Imagem <ol><li> Depois de completar a caracterização do actuador, colocar a amostra eo actuador no centro do aparelho de ressonância magnética. Para as experiências de estrutura de tecido, utilizar um pequeno e mais sensível bobina RF (isto é, 10 mm nesta experiência) para a transmissão e recepção do sinal de RF. (O procedimento mostrado usa um T 9,4ímã furo vertical, equipado com gradientes de eixo triplo, 100 g / cm). </li><li> Adquirir uma imagem batedor para a identificação do local de construção. </li><li> Defina os parâmetros para a aquisição. Um típico in vitro sagital scan terá um tempo de repetição de 1000 ms, tempo de eco de ms 20-40, a espessura da fatia de 0,5-1,0 mm, eo campo de visão de 12x10 mm 2 com um tamanho de matriz de 128x128 pixels. </li><li> Para os parâmetros elastografia, ajustar a frequência do actuador ao valor determinado pela caracterização Vibrometer laser Doppler. No presente estudo, um par bipolar foi necessário com uma amplitude de gradiente de 50 g / cm. Outros parâmetros para ajustar incluem o atraso que deve ser ajustado para zero milissegundos para a aquisição inicial. </li><li> Alterar o gerador de função de modo a romper e ajustar os parâmetros do gerador de função para que correspondam aos parâmetros de aquisição de elastografia incluindo a frequência eo número de ciclos. Além disso, defina a funçãogerador ção para ser externamente disparado. </li><li> Para uma imagem sagital, defina a sensibilização movimento para a direção fatia positivo e iniciar a digitalização. Após a aquisição, verificar a imagem e mudar a sensibilização para a direção fatia negativo. </li><li> Executar o programa MATLAB que irá executar a divisão complexo para geração de imagem de onda de cisalhamento. </li><li> Avaliar a imagem para a presença de ondas de cisalhamento e artefactos possíveis, tais como moldagem de fase. </li><li> Se não houver ajustes na imagem são necessárias, ajustar o tamanho da matriz de parâmetro para oito valores igualmente espaçados que variam de zero segundos a um período completo da freqüência de ressonância caracterizada. </li><li> Adquirir uma verificação em ambas as orientações de fatia positivos e negativos. </li><li> Uma vez adquiridas as imagens, use um programa MATLAB projetado para gerar os dados de ondas de cisalhamento de um conjunto de imagens. </li></ol> 4. MRE Processamento de Imagem Experiment <ol><li> The passo final de MRE é para calcular a rigidez de cisalhamento a partir das imagens de onda de cisalhamento. Colocar os dados no programa MATLAB que irá avaliar o conjunto de dados tridimensional (2 espacial, 1 temporal). </li></ol> Nota: Por assumindo uma onda de cisalhamento planar, as equações de dissociar o movimento permitindo a estimativa dos módulo complexo com valor de cisalhamento em função do deslocamento ea sua Laplaciano. O algoritmo de aproxima espaciais derivadas segundas com a diferença finita e calcula o módulo de cisalhamento numa base pixel-a-pixel. A partir deste número complexo, muitos parâmetros mecânicos podem ser deduzidas, tais como a velocidade da onda de cisalhamento, a atenuação das ondas, a rigidez de cisalhamento, a elasticidade de cisalhamento, a viscosidade de cisalhamento, etc O algoritmo também permite a selecção de regiões de interesse para o qual a média eo desvio padrão de cada parâmetro é calculado. <ol start="2"><li> Os parâmetros de imagem precisa ser especificado no início do programa. Além disso th,e limite superior da elastograma pode ser ajustado para optimizar contraste na amostra. </li></ol> Nota: O programa fornece resultados intermediários (onda após filtros passa-baixa, onda após filtragem direcional, FFT temporais, perfis de linha, etc) que ajudam o usuário a estimar a fidelidade da recuperação. <ol start="3"><li> Alguns parâmetros podem ser ajustados com base nesta informação, tais como os níveis de filtros passa-baixa, a frequência temporal do movimento, a direcção de propagação da onda, etc O desvio padrão de um parâmetro de uma região específica de interesse é também um indicador da qualidade do cálculo. </li></ol> 5. Os resultados representativos Figura 4 observa a mudança nas propriedades mecânicas ao longo de quatro semanas de desenvolvimento construção osteogênica e adipogênica. MRE foi realizado em 730-820 Hz. Embora ambas as esponjas semeadas começou a cerca de 3 kPa, osteogenitecidos c dirigidas resultou em uma rigidez de 22 kPa, e que, adiposo dirigido tecidos diminuição na rigidez de 1 kPa. Além disso, as construções de osteogénicas mostraram uma diminuição notável em tamanho, em comparação do início ao fim do estudo. As propriedades adicionais derivadas de estudo elastografia são mostrados na Tabela 1. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. O processo de aquisição de imagem para a elastografia por ressonância magnética. Durante a aquisição de imagem, uma sequência de impulsos (a) controla a sincronização (b) do gerador de função com a gradientes bipolar pulsos do aparelho de ressonância magnética. Após a aquisição de bipolar gradientes alternado em orientações positivos e negativos, (c) uma imagem de onda de cisalhamento é produzido usando a divisão complexo. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig2.jpg" alt="A Figura 2"/> Figura Diagrama 2. Do processo de MRE para o motor de tecidoderados construções. Primeiro, as células (uma) são primeiro cultivadas e expandidas para o tamanho da população essencial para o projecto concebido. Em seguida, as células são semeadas (b) para um andaime biomaterial e de reagentes químicos são aplicados para sinalizar a diferenciação. Andaimes são caracterizados com MRE, cujo primeiro passo (c) é a determinação da frequência de ressonância do actuador acoplado ao construto. Em seguida, imagens de ressonância magnética (d) são adquiridos para gerar uma imagem onda de cisalhamento (e). Finalmente, um algoritmo é aplicado para se obter um elastograma (f) que mapeia a rigidez do construto. Ao mesmo tempo, as construções são seccionados para avaliação histológica (g), a fim de validar diferenciação. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Procedimento caracterização do atuador. O andaime gelatina é delimitada por um gel de agarose a 0,5%. Para caracterizar o movimento sendo transferido para a amostra um ruído branco é primeiramente enviado para o sistema(1a) eo movimento resultante é detectado usando um laser Doppler Vibrometer (1b). Uma vez que a frequência de ressonância é determinada, um sinal contínuo de sinusóide em ressonância (2a) é enviada para determinar o deslocamento (2b) transferidos para o meio ambiente de gelatina. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Construa o mapa de desenvolvimento ao longo de quatro semanas. Adipogénicos (A) e osteogénico (O) construções são mostrados da esquerda para a direita com grandeza, correspondente e as imagens de onda de cisalhamento, elastograma, e rigidez ao cisalhamento média. O mapa de cores para os elastograma corresponde com o esquema de cores do gráfico de barras e barras de erro representam o desvio padrão dentro de cada região constructo de interesse. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618Table1.jpg" alt="Tabela 1"/&gt; Tabela 1. As propriedades mecânicas de tecido adiposo e osteo construções ao longo de um período de quatro semanas de crescimento.

<ol>
	<li>Xu, H., Othman, S. F., Magin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+tissue+engineering+using+magnetic+resonance+imaging.">Monitoring tissue engineering using magnetic resonance imaging.</a> J. Biosci. Bioeng. 106, 515-527 (2008).</li><li>Xu, H., Othman, S. F., Hong, L., Peptan, I. A., Magin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+microscopy+for+monitoring+osteogenesis+in+tissue-engineered+construct+in+vitro.">Magnetic resonance microscopy for monitoring osteogenesis in tissue-engineered construct in vitro.</a> Phys. Med. Biol. 51, 719-732 (2006).</li><li>Othman, S. F., Xu, H., Royston, T. J., Magin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+magnetic+resonance+elastography+(microMRE.">Microscopic magnetic resonance elastography (microMRE.</a> Magn. Reson. Med. 54, 605-615 (2005).</li><li>Muthupillai, R., Lomas, D. J., Rossman, P. J., Greenleaf, J. F., Manduca, A., Ehman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+elastography+by+direct+visualization+of+propagating+acoustic+strain+waves.">Magnetic resonance elastography by direct visualization of propagating acoustic strain waves.</a> Science. 269, 1854-1857 (1995).</li><li>Othman, S. F., Curtis, E. T., Plautz, S. A., Pannier, A. P., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+elastography+monitoring+of+tissue+engineered+constructs.">Magnetic resonance elastography monitoring of tissue engineered constructs.</a> NMR Biomed. , (2011).</li><li>Oliphant, T. E., Manduca, A., Ehman, R. L., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex-valued+stiffness+reconstruction+for+magnetic+resonance+elastography+by+algebraic+inversion+of+the+differential+equation.">Complex-valued stiffness reconstruction for magnetic resonance elastography by algebraic inversion of the differential equation.</a> Magn. Reson. Med. 45, 299-310 (2001).</li><li>Ringleb, S. I., Chen, Q., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L., An, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+shear+wave:+comparison+to+a+dynamic+shear+material+test.">Quantitative shear wave: comparison to a dynamic shear material test.</a> Magn. Reson. Med. 53, 1197-1201 (2005).</li><li>Hong, L., Peptan, I., Clark, P., Mao, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+adipose+tissue+engineering+by+human+marrow+stromal+cell+seeded+gelatin+sponge.">Ex vivo adipose tissue engineering by human marrow stromal cell seeded gelatin sponge.</a> Ann. Biomed. Eng. 33, 511-517 (2005).</li><li>Dennis, J. E., Haynesworth, S. E., Young, R. G., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenesis+in+marrow-derived+mesenchymal+cell+porous+ceramic+composites+transplanted+subcutaneously:+effect+of+fibronectin+and+laminin+on+cell+retention+and+rate+of+osteogenic+expression.">Osteogenesis in marrow-derived mesenchymal cell porous ceramic composites transplanted subcutaneously: effect of fibronectin and laminin on cell retention and rate of osteogenic expression.</a> Cell Transplant. 1, 23-32 (1992).</li><li>Marion, N. W., Mao, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+and+tissue+engineering.">Mesenchymal stem cells and tissue engineering.</a> Methods Enzymol. 420, 339-361 (2006).</li><li>Rydberg, J., Grimm, R., Kruse, S., Felmlee, J., McCracken, P., Ehman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+spin-echo+magnetic+resonance+elastography+of+the+brain.">Fast spin-echo magnetic resonance elastography of the brain.</a> , 1647-1647 (2001).</li><li>Kruse, S. A., Grim, R. C., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+EPI+based+3D+MR+elastography+of+the+brain.">Fast EPI based 3D MR elastography of the brain.</a> , 3385-3385 (2006).</li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse em divulgar.

Neste procedimento, o processo de MRE para construções da engenharia de tecidos é demonstrada a partir de preparação de células para a geração de um elastograma. Através da aplicação de um método de avaliação não destrutiva mecânica para o oleoduto engenharia de tecidos, é agora possível para avaliar alterações na construções de engenharia ao longo múltiplos estágios de desenvolvimento. Além disso, MRE complementa outros métodos de RM para o tecido de monitorização engenharia constrói tais c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do material </td><td> Tipo </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> MSCGM Bala-Kit </td><td> Reagente </td><td> Lonza </td><td> PT-3001 </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> DPBS 1X </td><td> Reagente </td><td> Invitrogen </td><td> 21600-010 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% de tripsina-EDTA </td><td> Reagente </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td> Armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Dexametasona </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2915 </td><td></td></tr><tr><td> 3-isobutil-1-metilxantina </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I5879 </td><td> Armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> A insulina bovina-pâncreas </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td><td> Armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Indometacina </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I7378 </td><td></td></tr><tr><td> Β-glicerofosfato </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9891 </td><td></td></tr><tr><td> L-ascórbico ácido 2-fosfato </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8960 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Andaime </td><td> Pharmacia &amp; Upjohn Co. </td><td> 09-0315-08 </td><td></td></tr><tr><td> Mesenquimais humanas células estaminais </td><td> Linha de células </td><td> Lonza </td><td> PT-2501 </td><td></td></tr><tr><td> 9.4T MR Scanner </td><td> Equipamento </td><td> Agilent </td><td></td><td> 400MHz WB </td></tr><tr><td> Bobina de 10 milímetros Litz </td><td> Equipamento </td><td> Doty Científico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laser Doppler Vibrometer </td><td> Equipamento </td><td> Polytec </td><td> PDV-100 </td><td></td></tr><tr><td> Vibrosoft (20) </td><td> Software </td><td> Polytec </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gerador de função </td><td> Equipamento </td><td> Agilent </td><td> AFG 3022B </td><td></td></tr><tr><td> Amplificador </td><td> Equipamento </td><td> Piezo inc </td><td> EPA-104-115 </td><td></td></tr><tr><td> Piezo flexão do motor </td><td> Equipamento </td><td> Piezo inc. </td><td> T234-A4Cl-203X </td><td></td></tr><tr><td> Computer-Linux </td><td> Equipamento </td><td> Processador: Intel Core 2 Duo E8400 Memória: 2G </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Computador-Windows </td><td> Equipamento </td><td> Processador: Intel Core 2 Duo E8400 Memória: 2G </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MATLAB </td><td> Software </td><td> Mathworks, inc </td><td></td><td> 2009b </td></tr></tbody></table>

magnetic resonance elastography methodology for the evaluation of tissue engineered construct growth

Testes mecânicos tradicional muitas vezes resulta na destruição da amostra, e, no caso do tecido de longo prazo de engenharia construir estudos, o uso de avaliação destrutiva não é aceitável. Uma alternativa proposta é a utilização de um processo de imagem chamado elastografia por ressonância magnética. Elastografia é um método não destrutivo para determinar o resultado de engenharia medindo locais valores de propriedades mecânicas (isto é, complexo módulo de cisalhamento), que são marcadores essenciais para identificar a estrutura ea funcionalidade de um tecido. Como um meio não-invasivos para avaliação, o acompanhamento de construções de engenharia, com modalidades de imagem, como ressonância magnética (RM) tem visto um interesse crescente na última década 1. Por exemplo, os ressonância magnética (MR) técnicas de difusão e relaxometry têm sido capazes de caracterizar as alterações na química e as propriedades físicas durante o desenvolvimento da engenharia de tecidos 2. O método proposto nao seguinte protocolo utiliza elastografia ressonância magnética microscópica (μMRE) como uma técnica não invasiva MR base para a medição das propriedades mecânicas de pequenas tecidos moles 3. MRE é conseguida por acoplamento de um actuador sónica mecânica com o tecido de interesse e de registo da propagação da onda de cisalhamento com um scanner de ressonância magnética 4. Recentemente, μMRE tem sido aplicada em engenharia de tecidos para adquirir a informação essencial para o crescimento que é tradicionalmente medida utilizando técnicas mecânicas destrutivas macroscópicas 5. No procedimento a seguir, elastografia é conseguida através da criação de imagens de construções artificiais, com uma sequência modificada Hahn spin echo-acoplado com um actuador mecânico. Como mostrado na Figura 1, a sequência modificada sincroniza a aquisição da imagem com a transmissão de ondas de cisalhamento externos e, posteriormente, o movimento é sensibilizado por meio do uso de oscilar pares bipolares. Após recolha de imagens com movimento positivo e negativo sensitizadivisão ção, complexa dos dados produzir uma imagem de onda de cisalhamento. Em seguida, a imagem é avaliada usando um algoritmo de inversão para gerar um mapa de rigidez de cisalhamento 6. As medições resultantes em cada voxel têm sido mostrados para correlacionar fortemente (R 2&gt; 0,9914) com os dados recolhidos usando análise mecânica dinâmica 7. Neste estudo, elastografia é integrado no processo de desenvolvimento de tecido para a monitorização de células estaminais mesenquimais humanas (h MSC) diferenciação em construções adipogénicos e osteogénico como mostrado na Figura 2.

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Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

O procedimento demonstra a metodologia de elastografia de ressonância magnética para monitorar o resultado de engenharia de tecidos adiposo e construções osteogénicas engenharia através da avaliação não invasiva locais das propriedades mecânicas, utilizando elastografia ressonância magnética microscópica (μMRE).

Metodologia Elastografia por Ressonância Magnética para a Avaliação de engenharia de tecidos Crescimento Construct

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

magnetic-resonance-elastography-methodology-for-evaluation-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.4K visualizações.  University of Nebraska-Lincoln. O procedimento demonstra a metodologia de elastografia de ressonância magnética para monitorar o resultado de engenharia de tecidos adiposo e construções osteogénicas engenharia através da avaliação não invasiva locais das propriedades mecânicas, utilizando elastografia ressonância magnética microscópica (μMRE).

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Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or bioartificial scaffold materials, entrapment of cardiac myocytes in hydrogels such as fibrin or collagen and stacking of myocyte monolayers 1. These concepts aim at restoration of compromised cardiac function (e.g. after myocardial infarction) or as experimental models (e.g. predictive toxicology and substance screening or disease modelling). Precise monitoring of cell survival after implantation of engineered heart tissue (EHT) has now become possible using in-vivo bioluminescence imaging (BLI) techniques 2. Here we describe the generation of fibrin-based EHT from a transgenic rat strain with ubiquitous expression of firefly luciferase (ROSA/luciferase-LEW Tg; 3). Implantation is performed into the greater omentum of different rat strains to assess immune responses of the recipient organism following EHT implantation. Comparison of results generated by BLI and the Enzyme Linked Immuno Spot Technique (ELISPOT) confirm the usability of BLI for the assessment of immune responses.

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue EHT

This video demonstrates the use of in vivo bioluminescence imaging to study immune responses after implantation of Engineered Heart Tissue (EHT) in rats.

Imagem bioluminescência para avaliação das respostas imune após o implante do tecido do coração Engineered (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or ...

Bioengenharia

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

Protocolo Relativo Avaliação hidrodinâmica de Tri-folheto polímero Válvulas

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

Técnica Cirúrgica para a Implantação de engenharia de tecidos enxertos vasculares e Subsequente<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

Atímica Rat Modelo de Avaliação da Engineered Ligamento Cruzado Anterior Enxertos

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

Baseada em Silk-colágeno Engineered 3D Model of Tissue polarizada Neural

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

Complexo polielectrólito de ligação à heparina de entrega osteogénica Factor de Crescimento Domínio

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these procedures in basic research and preclinical drug development, it is important to develop protocols for automated generation and analysis under standardized conditions. Here, we present a technique to generate engineered heart tissue (EHT) from cardiomyocytes of different species (rat, mouse, human). The technique relies on the assembly of a fibrin-gel containing dissociated cardiomyocytes between elastic polydimethylsiloxane (PDMS) posts in a 24-well format. Three-dimensional, force-generating EHTs constitute within two weeks after casting. This procedure allows for the generation of several hundred EHTs per week and is technically limited only by the availability of cardiomyocytes (0.4-1.0 x 106/EHT). Evaluation of auxotonic muscle contractions is performed in a modified incubation chamber with a mechanical interlock for 24-well plates and a camera placed on top of this chamber. A software controls a camera moved on an XYZ axis system to each EHT. EHT contractions are detected by an automated figure recognition algorithm, and force is calculated based on shortening of the EHT and the elastic propensity and geometry of the PDMS posts. This procedure allows for automated analysis of high numbers of EHT under standardized and sterile conditions. The reliable detection of drug effects on cardiomyocyte contraction is crucial for cardiac drug development and safety pharmacology. We demonstrate, with the example of the hERG channel inhibitor E-4031, that the human EHT system replicates drug responses on contraction kinetics of the human heart, indicating it to be a promising tool for cardiac drug safety screening.

Here, we show the generation of human engineered heart tissue from induced pluripotent stem cells (hiPSC)-derived cardiomyocytes. We present a method to analyze contraction force and exemplary alteration of contraction pattern by the hERG channel inhibitor E-4031. This method shows high level of robustness and suitability for cardiac drug screening.

Automated Análise contração do Coração Humano engenharia de tecidos para Screening Cardiac Drug Safety

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic resonance (MR) microscopy data. While it is possible to perform MR collections on living, excised mammalian tissue, such experiments have traditionally been constrained by resolution limits and are thus incapable of visualizing tissue microstructure. Conversely, MR protocols that did achieve microscopic image resolution required the use of fixed samples to accommodate the need for static, unchanging conditions over lengthy scan times. The current protocol describes the first available MR technique that enables imaging of living, mammalian tissue samples at microscopic resolutions. Such data is of great importance to the understanding of how pathology-based contrast changes occurring at the microscopic level influence the content of macroscopic MR scans such as those used in the clinic. Once such an understanding is realized, diagnostic methods with greater sensitivity and accuracy can be developed, which will translate directly to earlier disease treatment, more accurate therapy monitoring and improved patient outcomes.
While the described methodology focuses on brain slice preparations, the protocol is adaptable to any excised tissue slice given that changes are made to the gas and perfusate preparations to accommodate the tissue&#39;s specific metabolic needs. Successful execution of the protocol should result in living, acute slice preparations that exhibit MR diffusion signal stability for periods up to 15.5 h. The primary advantages of the current system over other MR compatible perfusion apparatuses are its compatibility with the MR microscopy hardware required to attain higher resolution images and ability to provide constant, uninterrupted flow with carefully regulated perfusate conditions. Reduced sample throughput is a consideration with this design as only one tissue slice may be imaged at a time.

The current protocol describes a method by which users can maintain viability of acute hippocampal and cortical slice preparations during the collection of magnetic resonance microscopy data.

Suporte metabólico de extirpado, tecidos de cérebro vivos durante a aquisição de microscopia de ressonância magnética

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

Custom Engineered Tissue Culture Molds from Laser-etched Masters

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue shape. Manipulating tissue shape on the micrometer to centimeter scale can direct cell alignment, alter effective mechanical properties, and address limitations related to nutrient diffusion. In addition, the vessel in which a tissue is prepared can impart mechanical constraints on the tissue, resulting in stress fields that can further influence both the cell and matrix structure. Shaped tissues with highly reproducible dimensions also have utility for in vitro assays in which sample dimensions are critical, such as whole tissue mechanical analysis.
This manuscript describes an alternative fabrication method utilizing negative master molds prepared from laser etched acrylic: these molds perform well with polydimethylsiloxane (PDMS), permit designs with dimensions on the centimeter scale and feature sizes smaller than 25 &#181;m, and can be rapidly designed and fabricated at a low cost and with minimal expertise. The minimal time and cost requirements allow for laser etched molds to be rapidly iterated upon until an optimal design is determined, and to be easily adapted to suit any assay of interest, including those beyond the field of tissue engineering.

Herein we present a rapid, facile, and low-cost method for fabricating custom polydimethylsiloxane molds that can be used for producing hydrogel-based engineered tissues with complex geometries. We additionally describe results from mechanical and histological assessments conducted on engineered cardiac tissues produced using this technique.

Custom Engineered moldes de cultura de tecidos de Masters gravados a Laser

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue ...

Manufacturing Abdominal Aorta Hydrogel Tissue-Mimicking Phantoms for Ultrasound Elastography Validation

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the tissue motion and infer or quantify the underlying biomechanical characteristics. For abdominal aortic aneurysms (AAA), biomechanical properties such as changes in the tissue's elastic modulus and estimates of the tissue stress may be essential for assessing the need for the surgical intervention. Abdominal aortic aneurysms US elastography could be a useful tool to monitor AAA progression and identify changes in biomechanical properties characteristic of high-risk patients.
A preliminary goal in the development of an AAA US elastography technique is the validation of the method using a physically relevant model with known material properties. Here we present a process for the production of AAA tissue-mimicking phantoms with physically relevant geometries and spatially modulated material properties. These tissue phantoms aim to mimic the US properties, material modulus, and geometry of the abdominal aortic aneurysms. Tissue phantoms are made using a polyvinyl alcohol cryogel (PVA-c) and molded using 3D printed parts created using computer aided design (CAD) software. The modulus of the phantoms is controlled by altering the concentration of PVA-c and by changing the number of freeze-thaw cycles used to polymerize the cryogel. The AAA phantoms are connected to a hemodynamic pump, designed to deform the phantoms with the physiologic cyclic pressure and flows. Ultra sound image sequences of the deforming phantoms allowed for the spatial calculation of the pressure normalized strain and the identification of mechanical properties of the vessel wall. Representative results of the pressure normalized strain are presented.

Here we describe a method to manufacture aneurysmal, aortic tissue-mimicking phantoms for the use in testing ultrasound elastography. The combined use of computer-aided design (CAD) and 3-dimensional (3D) printing techniques produce aortic phantoms with predictable, complex geometries to validate the elastographic imaging algorithms with controlled experiments.

Fabricação de Aorta Abdominal hidrogel tecido-imitando Phantoms por ultra-som Elastography validação

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the ...