Agradecemos a partilha de código aberto do MATLAB código de rastreamento de partículas fornecido por Maria Kilfoil ( <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a> ), juntamente com o código anterior IDL e extensa documentação fornecida por John C. Crocker e Eric R. Weeks. Este trabalho foi possível graças ao financiamento do Instituto Nacional do Câncer (NCI / NIH), K99CA155045 e R00CA155045 (PI: JPC).

1. Esferóides Cultivar tumorais <ol><li> Misturar 10 ml de água de grau de cultura de células com 0,1 g de agarose para obter uma solução de agarose a 1%. </li><li> Solução de agarose de calor acima dos 70 ° C (cerca de 14 segundos num forno de microondas padrão ou usando uma placa de aquecimento) antes de alíquotas de 40 ul de solução de agarose a um poço numa placa de 96 poços. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C durante pelo menos 1 hora, enquanto a colheita de células utilizando técnicas padrão. </li><li> Usar um hemacitómetro para determinar a concentração de células na suspensão. </li><li> Dilui-se a suspensão de células a 1000 células / ml e adicionar 100 ul desta diluição para o poço que contém o leito de agarose curado. </li><li> Colocar a amostra num agitador durante a noite numa incubadora a 37 ° 5% de CO 2 e C. </li><li> Remova a amostra de agitador e adicionar 100 ml de meio de cultura celular. </li><li> Incubar esferóides até diâmetro desejado é atingido. Por exemplo, após 9 dias, um spHeroid será de cerca de 450 m de diâmetro. Durante este tempo, o meio de crescimento fresco pode ser adicionado aos poços de aspiração, mas deve ser evitado uma vez que isto irá resultar na remoção do esferóide. </li></ol> 2. Preparando Spheroids tumorais 3D incorporado em ECM <ol><li> Prepara-se uma estação de trabalho com materiais necessários dentro de uma câmara de fluxo laminar. </li><li> Prepara-se uma mistura diluída de 1 um de diâmetro sondas marcadoras fluorescentes modificadas com carboxilato adicionando sondas banco de 2 partes (2% de sólidos) a 25 partes de água estéril. </li><li> Remover uma garrafa de 3,1 mg / ml de colágeno bovino do frigorífico e coloque-o no gelo. </li><li> Alíquota de 125 mL de colágeno em um vazio frasco de 2 ml. </li><li> Adicionar 50 ul de solução diluída de sonda traçador para o frasco contendo o colagénio e vortex brevemente para distribuir sondas. </li><li> Adicionar 235 ul de meio de cultura de células apropriado contendo vermelho de fenol (o qual vai ficar amarelo) para um volume total de 410 ml e vortex brevemente antes de retirar 205 ml (metade do volume total) e colocá-lo em um novo frasco de 2 ml. Frasco 1 conterá o esferóide de tumor e Frasco 2 será uma mistura de controlo. </li><li> Adicionar ~ 2 mL de NaOH a 1 M para o recipiente 1 para trazer novamente a solução até um pH neutro (meios de cultura contendo vermelho de fenol deve retornar a vermelho). Note-se que isto fará com que a mistura para iniciar a cura se não for mantido em gelo. Vortex brevemente para misturar, em seguida, retornar para rack de gelo imediatamente. NOTA: O esferóide é pouco visível a olho nu, após 9 dias de cultura e de sua retirada da cama de agarose é uma tarefa delicada. O uso de um microscópio de dissecção pode ser útil para alguns utilizadores. Manter a integridade do esferóide durante a transferência é primordial. </li><li> Usando uma pipeta de ponta em toda a boca, retire 40 mL de mídia do poço contendo o esferóide tumor. Guarde este 40 mL durante a realização da próxima etapa. </li><li> Verificar o poço para ver se o esferóidefoi removido no passo anterior. Se foi, adicionar 40 ul contendo o esferóide para o recipiente 1. Se não, colocar os 40 ul de volta para dentro do poço e repetir o passo anterior. </li><li> Agitar suavemente Vial 1 (não arrisque vórtex, pode danificar o esferóide) antes de transferir a mistura em 60 porções ul em três poços separados de uma placa de 96 poços. Inspeccionar cada poço com um microscópio, após a adição de mistura para determinar o que também contém o esferóide. </li><li> Adicionar ~ 2 mL de NaOH 1 M e 40 ul de meio de cultura de células para o frasco de 2 e vórtice antes aliquotamento 60 ul desta mistura a um poço vazio na placa de 96 poços e rotulagem como um controlo. </li><li> Colocar a placa numa incubadora a 37 ° C para curar durante pelo menos 1 hr. </li></ol> 3. Construir Rede de Pontos de exemplo e ter um vídeo em cada ponto <ol><li> Transfira a amostra a partir da placa da incubadora para a platina do microscópio. Permita 10 minutos para que a amostra Equilibrate com a temperatura ambiente, se uma fase aquecida não está disponível. </li><li> Observar a amostra com baixas lentes objetivas movidos para ter certeza que está intacto e pronto para a imagem latente. Determinar a posição do tumor para dentro do poço. </li><li> Decida quantos pontos de amostragem para tomar. Normalmente, os 20 pontos de amostragem em cada poço, distribuídos em anéis concêntricos em torno do esferóide produzirá resultados adequadamente detalhados. </li><li> Mova o palco para cada posição desejada e usar microscópio interface de software para gravar as coordenadas xey (ou registro de coordenadas manualmente se a interface do software não estiver disponível). </li><li> Ligue o microscópio para uma lente objetiva de alta potência (tipicamente 100X) e selecione o cubo filtro apropriado para o comprimento de onda de excitação das sondas traçadores. Use a lista de pontos criados no passo 3,4 para passar para o primeiro ponto na grade. </li><li> Ajuste o foco para encontrar o fundo do poço, então mover-se para encontrar um campo de visão (FOV) contendo vários trac em focoer sondas. </li><li> Observe o histograma de intensidade e ajuste a intensidade e tempo de exposição para obter a maior gama dinâmica possível, assegurando que a imagem não fique saturada. </li><li> Obter uma seqüência de vídeo em uma taxa de quadros de 20-30 milissegundos por quadro (cerca de 800 quadros ou 16-24 seg de comprimento é recomendado para obter estatísticas suficientes para cálculo MSD robusto equilibrada com a necessidade de minimizar o tempo de aquisição em cada ponto de grade espacial) e salvar com uma convenção adequada. Durante a gravação, não toque no microscópio ou mesa. </li><li> Repita os passos de 3,6-3,9 para cada ponto de amostra na grade. </li><li> Repita os passos 3,3-3,10 para cada poço na experiência. </li></ol> 4. Analisar dados em vídeo para Calcular Propriedades reológicas em cada ponto amostral <ol><li> Copie todos os dados de vídeo para uma pasta de análise (possivelmente em um computador diferente). </li><li> Dados de imagem importar para MATLAB ou outro software de análise. NÃOTE: vasta documentação sobre o conjunto de rotinas de monitoramento de partículas MATLAB adotadas aqui está disponível em <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil</a> . Recomenda-se o uso de uma função de chamada personalizado para o processamento de múltiplos arquivos em diferentes posições automatizar. </li><li> Calibrar o software através da análise de vários frames do vídeo para determinar de forma adequada selecção e de rejeição de parâmetros (tamanho, passa-banda, etc) para a identificação de posições centrais sonda. Extensa fundo para estas etapas cruciais é descrito por Crocker e Grier. </li><li> Use o software para determinar automaticamente a cada posição da sonda para todos os quadros de vídeo e, em seguida, vincular essas posições em trajetórias. </li><li> Use os dados para calcular a trajetória quadrado médio de deslocamento (MSD) em função do tempo de atraso, sendo certo de aplicar o fator de calibração espacial adequada (mM por pixel) para a lente objetiva específica, qualquer binning pixels, etc (normalmente realizadoem meta-dados). </li><li> Calcule G * (usando a relação generalizada Stokes-Einstein levados em consideração os limites de aplicabilidade da GSER para um determinado amostra 24,28,43. Alternativamente, os usuários podem querer interpretar propriedades ECM diretamente do MSD pela simples comparação de escala lei de potência, planalto valores, índices de heterogeneidade ou de outros parâmetros. </li><li> Repita os passos 4.2 através de 4.6 para cada fov no experimento. </li><li> Co-registro de dados de posição a partir do passo 3.4 com respectivos módulos viscoelásticos em uma freqüência específica de interesse. Dependendo do fabricante do microscópio utilizado, este passo pode ser facilitada por uma rotina personalizada que lê metadados microscópio ou posição de dados podem ser tabulados manualmente. </li><li> Use funções de interpolação 3D para gerar um mapa de reologia espacial da ECM. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Neste protocolo, apresentamos uma estratégia robusta e amplamente aplicável para longitudinalmente rastreamento de alterações locais na ECM rigidez em modelos de tumores em 3D. Nós prevemos que esta metodologia poderia ser adotada por biólogos câncer e biofísicos interessadas em comportamento mechanosensitive implicados na remodelação da matriz durante o crescimento de tumores e processos de invasão. A quantificação precisa da cinética de degradação da matriz poderia ser particularmente útil para aquele...

Fica claro a partir de um crescente corpo de evidências na literatura de que as células cancerosas, como acontece com as células epiteliais de mamíferos não-malignas, são altamente sensíveis às propriedades mecânicas e biofísicos da matriz extracelular circundante (ECM) e outros componentes do microambiente 1-9. Estudos sobre os mecanismos elegantes forneceram insights sobre o papel da rigidez extracelular como um parceiro de sinalização mechanosensitive complexo que regula o comportamento crescimento maligno e morfogênese 2,3,10,11. Este trabalho foi facilitado, em especial, pelo desenvolvimento de 3D ​​em modelos tumorais in vitro que restauram biologicamente arquitectura dos tecidos relevantes e podem ser cultivadas em materiais de andaime com mecânicos ajustáveis ​​e fotografada por microscopia óptica 12-19. No entanto, o outro lado dessa caixa de diálogo mechanoregulatory entre tumor e microambiente, através do qual as células cancerosas, por sua vez alterar a reologia de seu entorno, permanece um tantomais difíceis de estudar. Por exemplo, durante os processos de invasão, as células na periferia do tumor podem sofrer epitelial para mesenquimal (EMT) e aumentar a expressão de metaloproteases de matriz (MMPs), que provocam a degradação do local ECM 20-22, que por sua vez influenciam o comportamento de crescimento de mechanosensitive outras células tumorais proximais. Através de uma variedade de processos bioquímicos, células cancerosas discar continuamente a rigidez local do seu meio ambiente para cima e para baixo para se adequar a diferentes processos em momentos diferentes. A metodologia descrita aqui é motivado pela necessidade de ferramentas analíticas que relatam alterações locais na rigidez e conformidade do ECM durante o crescimento, que podem ser integrados com modelos de tumor 3D e correlatos longitudinalmente com alterações bioquímicas e fenotípicas sem terminar a cultura. Em busca de uma técnica adequada para implementar neste contexto, microrheology partícula-tracking (PTM) emerge como um forte candidato.Este método, foi pioneira originalmente por Mason e Weitz 23,24, usa o movimento de sondas de rastreamento incorporado em um fluido complexo para relatar o complexo módulo dependente da freqüência viscoelástico de cisalhamento, G * (ω) em escalas de comprimento micro. Esta abordagem geral foi desenvolvido com múltiplas variações adequadas para diferentes aplicações em soft-Matéria Condensada, colóides, biofísica e física polímero 25-31. PTM tem certas vantagens em relação a outros métodos, uma vez que as leituras da viscoelasticidade local são fornecidos pela imagem de vídeo não-destrutiva das sondas marcadoras bioquimicamente inactivos que são incorporados no momento da preparação da cultura e permanecem no lugar durante longos períodos de crescimento. Isto está em contraste com as medições padrão de ouro com um reómetro de cisalhamento oscilatório a granel, o que requer, necessariamente, de terminação da cultura e relata a reologia macroscópica volume da amostra, em vez de medições pontuais dentro do tumor microenvir 3D complexoente. De fato, vários estudos têm ilustrado a utilidade de interpretar as medições dos movimentos da sonda tracer ou em torno de células de câncer ou não câncer de medir deformações associadas com a migração de células 32, estresse mecânico induzido por um esferóide expansão 33, reologia intracelular 34,35, e mapear tensões mecânicas e deformações em tecidos artificiais 36, e relação entre o tamanho dos poros e velocidade invasão 37. Outras técnicas adequadas para microrheology, como a microscopia de força atômica (AFM) pode ser implementado, mas principalmente para os pontos de sondagem na superfície da amostra e também podem representar problemas de esterilidade da cultura que complicam medições longitudinais 38. Aqui, nós descrevemos um protocolo abrangente que inclua métodos para o crescimento do tumor de esferóides 3D aptos a serem transferidos em ECM com sondas fluorescentes embutidas para vídeo partícula de rastreamento e análise de métodos para o mapeamento confiável espacialmudanças na microrheology mais tempo em cultura. Na presente implementação, modelos de tumores em 3D são cultivadas em formato de vários poços com vistas à incorporação de medidas microrheology com outros ensaios tradicionais (por exemplo, de citotoxicidade), que este formato é propício para. Nesta ilustração representativa de essa metodologia de cultura in vitro esferóides 3D utilizando PANC-1 de células, de uma linha celular de cancro pancreático estabelecido conhecido para formar esferóides 39, mas todas as medições aqui descritas são amplamente aplicável ao estudo de tumores sólidos utilizando uma variedade de linhas celulares adequado para cultura 3D. Como esse método é baseado em imagem latente inerentemente é ideal para co-registro de dados microrheology de alta resolução com grandes campos de luz transmitida de vista que relatam alterações no crescimento celular, migração e fenótipo. A implementação da PTM integrado com microscopia de luz transmitida desta forma assume posicionamento reprodutível dos wh estágio do microscópioich está normalmente disponível em epifluorescência widefield comercial microscópios biológicos motorizados. O protocolo desenvolvido abaixo pode ser implementado com qualquer fluorescência automatizada microscópio biológico a equipados. Este é um método intensivo de dados inerente, o que exige a aquisição de gigabytes de dados de microscopia de vídeo digitais para processamento offline. No seguinte protocolo, Protocolo 1 refere-se a uma preparação inicial de esferóides de tumor que é descrito aqui, utilizando sobreposição de agarose, mas podem ser substituídos com uma variedade de outros métodos, tais como a gota em suspensão 40, ou cultura rotativa 41 técnicas. Protocolo 2 descreve o processo de incorporação de esferóides de um andaime do colagénio embora alternativamente, in vitro tumores 3D pode ser cultivada por encapsulação ou a incorporação de células ressuspensas em ECM 12,15, em vez de simples esferóides não aderentes pré-formados. Protocolos subsequentes descrevem os procedimentos para obtaining medições microrheology resolvida no tempo através da aquisição e processamento de dados de microscopia de vídeo, respectivamente. O processamento de dados é descrito usando MATLAB, fazendo uso de rotinas de código aberto para a PTM construído em algoritmos originalmente descritos por Crocker e Grier 42, que também foram amplamente desenvolvidos para diferentes plataformas de software (ver http://www.physics.emory.edu/ ~ semanas / IDL /).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:177px;">Bovine type 1 collagen</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, San Jose, California</td>
			<td style="width:100px;">354231</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PANC-1</td>
			<td>American Type Cell Culture, Manassas, VA</td>
			<td>CRL1469</td>
			<td>or other appropriate cell type</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, California</td>
			<td>906906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences, Bedford MA</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>C12H18O9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>NC0480985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Imaging plates</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Hyclone, Waltham, MA</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>or appropriate&#160; cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Zeiss AxioObsever Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>includes high-speed camera and imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB software</td>
			<td>The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology

O microambiente mecânica tenha sido mostrado que actua como um regulador essencial do comportamento de crescimento tumoral e a sinalização, que é em si remodelada e modificada como parte de um conjunto de interacções, bidireccional mechanosensitive complexos. Enquanto o desenvolvimento de modelos de tumor 3D biologicamente relevantes tenham facilitado os estudos mecanísticos sobre o impacto da reologia da matriz sobre o crescimento do tumor, o problema inverso de alterações de mapeamento do ambiente mecânica induzida por tumores permanece um desafio. Aqui, descrevemos a implementação de rastreamento de partículas microrheology (PTM), em conjunto com modelos 3D de câncer de pâncreas, como parte de uma abordagem robusta e viável para monitorar longitudinalmente mudanças físicas no microambiente tumoral, in situ. Esta metodologia integra um sistema de preparação in vitro modelos 3D incorporados em uma matriz extracelular modelo (ECM) andaime de colágeno tipo I com sondas marcadas com fluorescência distribuída uniformemente para pomedições microrheology dependentes do tempo em todo o espécime ção-e. in vitro tumores são banhados e sondado em condições paralelas usando placas de imagem multipoços. Baseando-se em métodos estabelecidos, vídeos de movimentos sonda traçadores são transformados através da Relação Generalizada Stokes Einstein (GSER) para relatar o módulo de cisalhamento complexo viscoelástico dependente da freqüência, G * (ω). Como essa abordagem é baseada em imagem, caracterização mecânica também é mapeado sobre grandes campos espaciais de luz transmitida simultaneamente para relatar mudanças qualitativas no tamanho e fenótipo tumoral 3D. Os resultados representativos mostrando contrastante resposta mecânica em sub-regiões associadas com a degradação da matriz localizada induzida por invasão, bem como a calibração do sistema, dados de validação são apresentados. Também são apresentados os resultados indesejáveis ​​de erros experimentais comuns e solução de problemas dessas questões. O formato cultura chapeamento 3D de 96 poços implementado neste protocolo é conducive a correlação de medições microrheology com testes de rastreio terapêuticos ou de imagem molecular para ganhar novos insights sobre o impacto de tratamentos ou estímulos bioquímicos no microambiente mecânica.

Para verificar a validade do G * (ω) medições em posições localizadas dentro de um microambiente do tumor modelo complexo, dois experimentos de validação iniciais foram realizados. Em primeiro lugar, procurou-se validar nossas medidas contra o &quot;padrão ouro&quot; de reometria de cisalhamento oscilatório granel. Foram preparadas amostras idênticas de matriz de colagénio (sem células) a uma concentração de colagénio de 1,0 mg / ml. Estas amostras foram sondadas com um reómetro de massa (TA Ins...

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Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

-Tracking microrheology partícula pode ser usada para quantificar de forma não destrutiva e espacialmente mapear as alterações nas propriedades mecânicas da matriz extracelular em modelos de tumor em 3D.

Medição Longitudinal de Matriz Extracelular Rigidez em 3D tumorais modelos com o uso de rastreamento de partículas Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

longitudinal-measurement-extracellular-matrix-rigidity-3d-tumor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.4K visualizações.  University of Massachusetts Boston.  -Tracking microrheology partícula pode ser usada para quantificar de forma não destrutiva e espacialmente mapear as alterações nas propriedades mecânicas da matriz extracelular em modelos de tumor em 3D. 

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Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Sem contato, Monitoramento Label livre de células e matriz extracelular utilizando Espectroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Bioengenharia

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires microtubules that are stiff and straight enough to span a significant fraction of the cell diameter. As a result, the microtubule persistence length, a measure of stiffness, has been actively studied for the past two decades1. Nonetheless, open questions remain: short microtubules are 10-50 times less stiff than long microtubules2-4, and even long microtubules have measured persistence lengths which vary by an order of magnitude5-9.
	Here, we present a method to measure microtubule persistence length. The method is based on a kinesin-driven microtubule gliding assay10. By combining sparse fluorescent labeling of individual microtubules with single particle tracking of individual fluorophores attached to the microtubule, the gliding trajectories of single microtubules are tracked with nanometer-level precision. The persistence length of the trajectories is the same as the persistence length of the microtubule under the conditions used11. An automated tracking routine is used to create microtubule trajectories from fluorophores attached to individual microtubules, and the persistence length of this trajectory is calculated using routines written in IDL.
	This technique is rapidly implementable, and capable of measuring the persistence length of 100 microtubules in one day of experimentation. The method can be extended to measure persistence length under a variety of conditions, including persistence length as a function of length along microtubules. Moreover, the analysis routines used can be extended to myosin-based acting gliding assays, to measure the persistence length of actin filaments as well.

A method to measure the persistence length or flexural rigidity of biopolymers is described. The method uses a kinesin-driven microtubule gliding assay to experimentally determine the persistence length of individual microtubules and is adaptable to actin-based gliding assays.

Flexão Medidas rigidez de Biopolímeros usando ensaios de deslizamento

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

Em Situ Mapeamento das propriedades mecânicas de biofilmes por de rastreamento de partículas Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Melhorar 2D e 3D Pele<em&gt; In Vitro</em&gt; Models Usando Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Sintonizável hidrogéis a partir de Pulmonar Matriz Extracelular para Cultura Celular 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

Um protocolo para rastreamento em tempo real 3D única partícula

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Fabricando um rim córtex Extracellular Matrix-derivado hidrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Bioink extracelular derivado da matriz de tecido sipâncreas para a impressão de construções de tecidopanpático 3D Carregadas de células

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Um modelo de cultura de matriz-adipócito extracelular humano para estudar crosstalk metabólico de matriz e células

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes and therapeutic responses. Accounting for matrix effects earlier in the drug development pipeline is expected to increase the likelihood of clinical success of novel therapeutics. Biomaterial-based strategies recapitulating specific tissue microenvironments in 3D cell culture exist but integrating these with the 2D culture methods primarily used for drug screening has been challenging. Thus, the protocol presented here details the development of methods for 3D culture within miniaturized biomaterial matrices in a multi-well plate format to facilitate integration with existing drug screening pipelines and conventional assays for cell viability. Since the matrix features critical for preserving clinically relevant phenotypes in cultured cells are expected to be highly tissue- and disease-specific, combinatorial screening of matrix parameters will be necessary to identify appropriate conditions for specific applications. The methods described here use a miniaturized culture format to assess cancer cell responses to orthogonal variation of matrix mechanics and ligand presentation. Specifically, this study demonstrates the use of this platform to investigate the effects of matrix parameters on the responses of patient-derived glioblastoma (GBM) cells to chemotherapy.

The present protocol describes an experimental platform to assess the effects of mechanical and biochemical cues on chemotherapeutic responses of patient-derived glioblastoma cells in 3D matrix-mimetic cultures using a custom-made UV illumination device facilitating high-throughput photocrosslinking of hydrogels with tunable mechanical features.

Matrizes de hidrogel permitem aumento de rendimento para efeitos de triagem de componentes matriciais e terapêuticos em modelos de tumor 3D

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...