Agradecemos a membros do laboratório Alto para discussões úteis. Agradecemos também a Facilidade Imagem Molecular e Celular da UT Southwestern Medical Center, especificamente o Dr. Chris Gilpin, Januszewski Tom, e Mueller Laurie para perícia técnica e aconselhamento. Agradecemos também o Dr. Xionan Dong para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho é apoiado pelo NIH concessão AI083359 a NMA

1. Cultura de Células de mamífero <ol><li> Rim de Rato Normal (NRK), imortalizada cancro cervical (HeLa), ou outras linhas celulares de mamífero adequadas são cultivadas a 37 ° C, 5% CO 2, em lamelas de vidro em grade photoetched afixados viver pratos de células (ver Tabela 1 para qualquer reagente ou aparelho utilizado neste protocolo) em DMEM + 10% FBS e 1% de Pen / Strep. Precauções devem ser tomadas para manter um ambiente estéril quando se trabalha com cultura de células de mamíferos. </li><li> Dependendo da sua linha de tempo experimental (0-5 horas após a injecção vs 1-2 dias), a confluência das células deve ser ajustado para ~ 50% ou ~ 25%, respectivamente. </li></ol> 2. Microinjeção <ol><li> Preparar proteína desejada, o DNA, ou de moléculas pequenas na sua escolha de tampão, de acordo com a sua receptividade para cultura celular, para um volume final de 50 ul ~. Inertes corantes fluorescentes como o Texas vermelho ou azul Cascadeestão incluídos, a fim de marcar as células microinjectados; escolha do corante de injecção e sonda fluorescente deve ter excitação não sobrepostos e comprimentos de onda de emissão. A concentração da molécula de interesse o necessário para microinjecção devem ser determinados empiricamente, e os corantes de rastreamento fluorescentes são comumente utilizados em 0,5-1,0 mg / ml. Tipicamente, rodamina ou outro fluoróforo é ligado de forma covalente à sua molécula de interesse utilizando um kit comercial, no entanto, outros métodos de detecção podem ser utilizados dependendo da sensibilidade. Para mais informações, consulte Considerações críticas abaixo. </li><li> Filtra-se a injectant (~ 50 ul) através de um filtro de 0,22 uM centrífuga. Filtros centrífugos são preferidos em relação a vácuo e / ou filtração de seringa, que tem associado volumes mortos. </li><li> Para gerar a agulha microinjeção, pipetas de vidro de borosilicato são puxados usando um Flaming-Brown Micropipeta Puller seguintes orientações dos fabricantes. Alternativamente microinjecção,agulhas podem ser adquiridos de fornecedores como Eppendorf que torna as agulhas microinjeção femtotip. </li><li> Cuidadosamente pipetar 4 ul de injectant no final unmolested da agulha microinjeção usando Eppendorf 20 Femtotips. Verifique se não há bolhas de ar no interior da agulha microinjeção puxado. Carregar agulha de microinjecção para o braço do micromanipulador Eppendorf FemptoJet InjectMan ligado a um microscópio invertido. Para uma boa revisão do procedimento de microinjeção, o leitor é direcionado para um Jornal anterior do artigo Experimentos visualizada 8. </li><li> Coloque prato de células vivas com lamela grade e células cultivadas no suporte prato do microscópio Zeiss invertido. Encontrar células em crescimento dentro de uma grade photoetched e observe o identificador alfanumérico grades, este será utilizado em todas as etapas subsequentes. Idealmente, localizar as células no centro da lamela como passos subsequentes irá limitar a transferência da amostra para as extremidades da lamela. </li><li> Braço injecção manualmente inferior no lugar sobre a lamela, e usando o joystick micromanipulador e controles, agulha de injecção inferior para baixo até que a ponta toque suavemente a superfície das células em cultura e do limite de press &quot;para impedir o movimento da agulha para além deste ponto e, assim, quebrar a frágil puxou o vidro de borosilicato. Todos os outros aspectos da microinjecção celular são realizados como por Eppendorf manual FemtoJet InjectMan. A técnica de microinjecção foi recentemente utilizada para compreender individuais de proteínas segregadas a partir de bactérias de virulência 9. </li><li> Microinject todas as outras células no interior da grelha escolhida. Com as células que cresceram em ~ 50% de confluência, pode-se esperar ~ 80 células por 600 | iM de grade 2 (exemplo mostrado na fig. 3A). Assim, após uma inspeção de microscopia de fluorescência e de electrões, haverá um n ~ experimental de 30-40 e células de controlo. </li><li> Coloque vivo de células prato de volta para a cultura de células de mamífero para a incubadora desejadotempo como ditado pela configuração experimental. Alternativamente, pode-se prosseguir directamente a partir de micro-injecção de lapso de tempo para análise por microscopia de aguardar o aparecimento de estruturas subcelulares particulares de interesse antes da fixação. </li></ol> 3. Microscopia fluorescente <ol><li> Se se desejar, realizar-vivo de células de lapso de tempo medições de fluorescência de células microinjectados, após o que, substituir o meio com glutaraldeído a 2,5% em tampão cacodilato 0,1 M (pH 7,4) e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. No entanto, se as medições em directo de células não são necessários, descartar meios de crescimento celular e de fixar as células com 5 ml de formaldeído a 3,7% em 1xPBS à temperatura ambiente durante 10 minutos. Descarte fixador e substituir com 5 ml 1xPBS, vá para o passo 3.2. Nota: Não é crítico para adicionar glutaraldeído até depois de microscopia de fluorescência é completa. </li><li> Colocar a cápsula ao vivo das células com a lamela gridded photoetched num microscópio fluorescente (confocal não é necessário para this passo) e recolher campo brilhante e as imagens fluorescentes 5-10 da grade apropriada para documentar a disposição das células (Fig. 4A). Identificar as células que foram microinjectados utilizando os comprimentos de onda de excitação e emissão do corante inerte injecção (Fig. 4B). É importante para obtenção de imagens em diferentes ampliações (por exemplo, 10x e 65x), a fim de facilitar a identificação de células microinjectados em passos subsequentes envolvendo microscopia electrónica. </li><li> Usando um microscópio confocal de fluorescência, recolher uma pilha de Z-microinjectados de células dentro da grade identificado no passo 2.5. Grande aumento (100x) é necessária de modo a correlacionar as imagens fluorescentes com as estruturas subcelulares que serão identificados em microscopia electrónica. </li><li> As lamelas de cobertura são removidas do fundo dos pratos de células vivas com o fluido disponível comercialmente lamela remoção de células e colocou-se de lado numa placa de cultura de células virgem contendo 5 ml1xPBS. A lamela é então processado para microscopia electrónica, como detalhado abaixo. </li></ol> 4. Microscopia Eletrônica de Transmissão <ol><li> Substituir 1xPBS tampão com 2 ml de 2,5% de glutaraldeído em tampão de cacodilato 0,1 M (pH 7,4) e incuba-se à temperatura ambiente durante 10 minutos. De incubação mais longo, enquanto que não é necessário, ajudará a manutenção das estruturas subcelulares. Nota: formaldeído por si só não é suficiente para um fixador de análise por ME. </li><li> Remover as células do fixador e da mancha, com a adição de 2 ml de tetróxido de ósmio a 1% em tampão cacodilato 0,1 M, durante 30 min seguido de três lavagens com tampão cacodilato e, finalmente, substituir todo o tampão com DDQ 2 O. </li><li> Seguindo protocolos padrão EM, desidratar a amostra de uma série (70% a 100%) graduada de etanol. Prepare Epon resina e lamínula lugar célula lado para baixo em cima de um tubo de resina Epon-cheia. Permitir que a polimerização durante 24 horas a 60 ° C. Ao colocar a lamela photoetched grade de células-side fazerwn sobre a resina Epon, tanto as células de interesse, bem como o padrão de grade é transferida para a resina Epon durante a polimerização (exemplo mostrado na fig. 3B). </li><li> Remover lamínulas de resina Epon por rapidamente imersão em nitrogênio líquido e / ou água fervente. Inspeccionar a superfície da resina no âmbito de um escopo de dissecação binocular para localizar a grelha de interesse (nota: o padrão de grade irá transferir como uma imagem de espelho). Usando uma lâmina de barbear esterilizada ou de bisturi, o corte de blocos Epon para baixo de tal forma que apenas a grelha de interesse está no vértice do bloco de resina Epon. </li><li> Usando um ultramicrótomo, adquirir cortes seriados do bloco recortada na espessura desejada (~ 70 nm de espessura por TEM convencional e espessura ~ nm 250 para tomografia TEM). Contraste das secções com acetato de uranilo e citrato de chumbo seguindo protocolos padrão. </li></ol> 5. Luz correlativa e Microscopia Eletrônica <ol><li> Realocar as células de interesse emo microscópio eletrônico utilizando imagens obtidas em etapas anteriores. Uma vez que as células de interesse microinjectados foram localizados, use as high-resolution confocal imagens fluorescentes para identificar regiões no interior da célula que eram de interesse. Imagem estes em alta resolução usando TEM. Use monumentos como a periferia da célula e do envelope nuclear para determinar qual imagem z-stack fluorescente corresponde à EM cortar. </li><li> Usando o programa de imagem de sua escolha (por exemplo, Image J, Adobe Photoshop, etc), reduzir a opacidade da imagem fluorescente de 50% e sobrepô-lo para a imagem TEM com o qual se correlaciona. Alinhar as imagens através do ajuste da escala (lembra a restringir as proporções) e a rotação da imagem confocal para coincidir com a imagem TEM. Os ajustes finos na nitidez, contraste, etc na imagem fluorescente pode ajudar no alinhamento. Nota: descobrimos que heterocromatina, o envelope nuclear, ea periferia das células representam uma marcos excelentes para ajudarna orientação das duas imagens. </li></ol> 6. Considerações críticas <ol><li> Para grande ajuda na localização da molécula de injecção pequeno, uma etiqueta fluorescente, tais como fluoresceína ou rodamina podem ser covalentemente ligados utilizando kits disponíveis comercialmente. A informação adicional é obtida por ectopicamente expressa uma proteína marcadora fluorescente localização subcelular antes da microinjecção. Por isso, a escolha de fluoróforos e de corantes de rastreamento inerte microinjecção é importante. </li><li> Escolha de células que estão aderentes a microinjecção, perto do centro da lamela e evitar a escolha de uma grelha perto da borda. Isto vai apresentar a maior probabilidade de que as células de interesse são transferidos para a resina Epon utilizado para microscopia electrónica. </li><li> Confluência de células is importante, tal como uma placa totalmente confluente vai fazer a identificação de células microinjectados no microscópio electrónico muito difícil. Em vez disso, as células semente de tal forma que eles atingem ~ 50% de confluência no dia da experiência de um curto, ou ~ 25% de confluência no dia de um tempo (1-2 dias) experimento. Utilizar a posição e forma das células, bem como o espaço vazio &quot;como pontos de referência para orientar a imagem de microscopia electrónica. </li><li> Espessura de corte óptica confocal deve ser sintonizado com as necessidades da experiência e deve, portanto, ser determinado empiricamente 10. </li><li> O formaldeído e glutaraldeído fixadores devem ser da mais alta qualidade disponível. Formaldeído irá fixar as células, no entanto, preservar as propriedades de fluorescência de ambas as proteínas e pequenas moléculas fluorescentes (tais como FITC ou rodamina). No entanto, ele não irá preservar as estruturas para permitir a resolução EM elevada. Glutaraldeído preserva membranas e estruturas subcelulares a um elevado grau de EM anásis, mas irá prejudicar significativamente a fluorescência. Portanto, a fixação de duas etapas é crítico para a fluorescência e microscopia de EM. O passo de fixação do formaldeído pode ser omitido se apresentar ao vivo de células medidas, como a fixação final pode ser realizada por tratamento com glutaraldeído. </li></ol> 7. Resultados representativos Este procedimento proporciona a capacidade de proporcionar uma molécula de interesse directamente para o citoplasma celular eucariótica e monitorizar a sua localização e / ou efeitos na arquitectura celular e organeller de milímetro a nanometros de multi-resolução. Uma ilustração esquemática da instalação experimental e procedimento é mostrado na Figura 2. Esta técnica baseia-se na micro-injecção de células crescidas em lâminas de vidro de laser gravado em grade (Fig. 3A), que depois de microscopia confocal, é capaz de transferir ambos as células de interesse, bem como o padrão de grelha para a resina Epon (Fig.3B). Um procedimento típico CLEM microinjeção produz imagens de fluorescência e micrografia eletrônica, que, quando correlacionados, permitem que tanto a localização subcelular e análise ultra-estrutural. As células cultivadas sobre uma lamela de vidro photoetched reticulada são microinjectados com uma molécula de interesse, após o que as imagens de campo brilhante são obtidos (Fig. 4A). Um corante de rastreio inerte é incorporada para distinguir as células a partir de não-microinjectados microinjectados células (Fig. 4B). Confocal z pilhas são obtidos utilizando um fluoróforo ou outro identificador ligado à molécula de interesse microinjectados pequeno (Fig. 4C). A amostra é fixado em glutaraldeído e processados ​​para microscopia eletrônica. Eletromicrografias são obtidos e colocado sobre as células para as quais eles correspondem (Fig. 4D). Áreas abrigam sinais fluorescentes são inspecionados em maior detalhe com maior ampliação (Fig. 4E </strong&gt;). <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Cronograma de procedimento CLEM microinjeção. Dependendo da configuração experimental, microinjecção e as medições de fluorescência podem ser realizadas no mesmo dia. Preparação da amostra para microscopia eletrônica é mais devido tempo consumindo a passos longos de incubação e irá durar 2-3 dias. TEM análise e correlação de sinais de fluorescência, com imagens de microscopia electrónica pode ser feita em um dia. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2 ilustração geral do método de microinjeção CLEM Passo 1:.. Localize células de crescimento em laser lamela de vidro jateado grade e microinject molécula de interesse Passo 2:.. Captura duas imagens de campo claro e confocal fluorescentes z pilhas de células microinjetados Passo 3: prepararlamela para EM análise e incorporar em resina Epon. Usando padrão de grade transferido, aparar bloquear tais que as células de interesse são o ápice Passo 4:. Corte cortes seriados com ultramicrótomo Passo 5:. Correlacionar imagens fluorescentes com EM imagens. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig3.jpg" alt="Figura 3"/> . Figura 3 padrão de grade facilita a identificação das células de interesse O painel A mostra a micro-injecção de células cultivadas para ~ 50% de confluência,. Observe a grade identificador aK. Barra de escala é 100 um. Painel B mostra o padrão de grade transferido da lamela para o bloco de resina polimerizada Epon que serão seccionados seriadamente após a grelha de interesse é identificado com um microscópio de dissecção. Painel C mostra o padrão de grade transferido, em preparação para o seccionamento . Note-se que o padrão de grade é transferido no sentido inverso sobre o bloco de resina; scalbar e é de 1200 m. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig4.jpg" alt="Figura 4"/> .. Figura 4 Os resultados representativos de luz microinjecção correlativa e microscopia electrónica O painel A mostra a micrografia de campo claro de células NRK em crescimento sobre uma lamela de vidro do laser gravado reticulada; setas indicam duas células que são visualizadas por CLEM em CD painéis O painel B mostra a fluorescência. de o corante de rastreio inerte, neste caso, Cascade Blue, usado para identificar as células que foram microinjectados. Painel C mostra a sobreposição do campo luminoso e a assinatura de fluorescência de uma molécula marcada com rodamina pequena. As duas células mostradas aqui são indicados por setas nos painéis A e B. O painel D representa CLEM de campo claro, microscopia de fluorescência e de electrões;. Cabeça da seta indica puncta fluorescente fotografada na maior ampliação em Painel E barras de escala são como folforma: Os painéis A e B, 100 um, c &amp; D, 50 mm; E, a 100 nm.

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Não há conflitos de interesse declarados.

O método aqui apresentado permite a entrega directa de proteínas purificadas, ácidos nucleicos, ou moléculas pequenas para o citoplasma eucariótico e permite a análise de alta resolução ultra através da correlação de microscopia de fluorescência e de electrões. A utilização deste método é simples e robusto e pode ser realizado in-house com muitas instalações nucleares existentes e / ou laboratórios adequadamente equipados de microscopia electrónica. A técnica é também passível de live-célula, q...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Coverslip Photoetched e Live-célula Placa </td><td> MatTek </td><td> P35G-2-14-CGRD </td><td></td></tr><tr><td> Texas Red </td><td> Invitrogen </td><td> D3329 </td><td></td></tr><tr><td> Cascata Azul </td><td> Invitrogen </td><td> D7132 </td><td></td></tr><tr><td> Rodamina Labeling Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 53002 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 unidade de filtração centrífuga uM </td><td> Millipore </td><td> UFC30GV00 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetas de vidro de borosilicato </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF100-50-10 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipeta Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modelo P-97 </td><td> Utilize o programa # 4 após a realização de teste de rampa </td></tr><tr><td> FemtoJet Sistema Microinjeção </td><td> Eppendorf </td><td> InjectMan NI2 </td><td></td></tr><tr><td> Lamela Fluid Remoção </td><td> MatTek </td><td> PDCF OS 30 </td><td></td></tr><tr><td> Technai microscópio eletrônico de transmissão </td><td> FEI </td><td> Technai G2 BioTWIN </td><td></td></tr><tr><td> Ultramicrotombe </td><td> Leica </td><td> EM UC6 </td><td></td></tr></tbody></table>

correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets

A célula eucariótica depende complexo, altamente regulado, e compartimentos da membrana acoplados funcionalmente distintos que preservam a polaridade bioquímico necessário para a função celular adequada. Entender como as enzimas, proteínas e componentes do citoesqueleto governar e manter esta segregação bioquímica é, portanto, de suma importância. A utilização de moléculas fluorescentes marcadas para localizar e / ou perturbam compartimentos subcelulares rendeu uma riqueza de conhecimentos e avanços na compreensão da regulação celular. Técnicas de imagiologia tais como a microscopia de fluorescência confocal e fazer a determinar a situação de uma molécula fluorescente etiquetado pequeno relativamente simples, no entanto a resolução de estruturas muito pequenas é limitada 1. Por outro lado, a microscopia electrónica revelou detalhes da morfologia subcelular com resolução muito elevada, mas a sua natureza estática torna mais difícil de medir pró altamente dinâmicosos com precisão 2,3. Assim, a combinação de microscopia de luz por microscopia de electrões de uma mesma amostra, denominado microscópio óptico e electrões (CLEM) 4,5, proporciona as vantagens duplas de ultra imagem fluorescente com a alta resolução de microscopia electrónica de 6. Esta poderosa técnica foi implementada para estudar vários aspectos da biologia celular 5,7. Desde a sua criação, este procedimento tem aumentado a nossa capacidade de distinguir arquiteturas subcelulares e morfologias em alta resolução. Aqui, apresentamos um método simplificado para a realização de microinjeção rápida seguida de CLEM (Fig. 1). O procedimento CLEM microinjecção pode ser utilizado para introduzir quantidades específicas de moléculas pequenas e / ou proteínas directamente para o citoplasma da célula eucariótica e estudar os efeitos de milímetro a nanometros de multi-resolução (Fig. 2). A técnica baseia-se na microinjectingcélulas cultivadas em lamínulas gravadas a laser de vidro grade aposta para o fundo de pratos de células vivas e de imagem com tanto microscopia confocal fluorescente e eletrônica. Localização da célula (s) de interesse é facilitado pelo padrão de grade, a qual é facilmente transferido, juntamente com as células de interesse, para a resina Epon utilizado para imobilização de amostras e de corte antes da análise por microscopia de electrões (fig. 3). Sobreposição de imagens de fluorescência e EM permite ao utilizador determinar a localização subcelular, assim como quaisquer alterações morfológicas e / ou induzidos por ultra-estrutural da molécula de interesse microinjectados (Fig. 4). Esta técnica é passível de pontos de tempo variando de ≤ 5 s até várias horas, dependendo da natureza da amostra microinjectados.

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Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

A técnica CLEM foi adaptado para analisar a morfologia ultraestrutural de membranas, organitos e estruturas subcelulares afectados por moléculas microinjectados. Este método combina as técnicas poderosas de micromanipulação / microinjeção, microscopia confocal, fluorescentes e microscopia eletrônica para permitir milímetros de multi-resolução nanométrica. Esta técnica é susceptível a uma grande variedade de aplicações.

Microscópio óptico e Eletrônica (CLEM) como uma ferramenta para visualizar moléculas microinjetados e seus eucarióticas Sub-celulares Metas


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

19.0K visualizações.  University of Texas Southwestern Medical Center. A técnica CLEM foi adaptado para analisar a morfologia ultraestrutural de membranas, organitos e estruturas subcelulares afectados por moléculas microinjectados. Este método combina as técnicas poderosas de micromanipulação / microinjeção, microscopia confocal, fluorescentes e microscopia eletrônica para permitir milímetros de multi-resolução nanométrica. Esta técnica é susceptível a uma grande variedade de aplicações.

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Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Bioensaio eletroantenográfica como uma ferramenta de triagem para voláteis da planta hospedeira

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Biologia

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused throughout tissues made of diverse cell types, such as enteroendocrine cells of the intestinal epithelium. These gastrointestinal sensors of food and bacteria have been difficult to study because they are dispersed among other epithelial cells at a ratio of 1:1,000. Recently, transgenic reporter mice have been generated to identify enteroendocrine cells by means of fluorescence. One of those is the peptide YY-GFP mouse. Using this mouse, we developed a method to correlate confocal and serial block-face scanning electron microscopy. We named the method cocem3D and applied it to identify a specific enteroendocrine cell in tissue and unveil the cell&#8217;s ultrastructure in 3D. The resolution of cocem3D is sufficient to identify organelles as small as secretory vesicles and to distinguish cell membranes for volume rendering. Cocem3D can be easily adapted to study the 3D ultrastructure of other specific cell types in their native tissue.

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

Correlativo Confocal e Microscopia Eletrônica 3D de uma célula sensorial específica

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido macerado para visualizar a matriz extracelular

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to cells, tissues, organelles, and even whole organisms. This protocol focuses on two chemical drying methods, hexamethyldisilazane (HMDS) and t-butyl alcohol (TBA), and their application to imaging of both prokaryotic and eukaryotic organisms using SEM. In this article, we describe how to fix, wash, dehydrate, dry, mount, sputter coat, and image three types of organisms: cyanobacteria (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., and an unknown sp.), two euglenoids from the genus Monomorphina (M. aenigmatica and M. pseudopyrum), and the fruit fly (Drosophila melanogaster). The purpose of this protocol is to describe a fast, inexpensive, and simple method to obtain detailed information about the structure, size, and surface characteristics of specimens that can be broadly applied to a large range of organisms for morphological assessment. Successful completion of this protocol will allow others to use SEM to visualize samples by applying these techniques to their system.

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

SEM analysis is an effective method to aid in species identification or phenotypic discrimination. This protocol describes the methods for examining specific morphological details of three representative types of organisms and would be broadly applicable to examining features of many organismal and tissue types.

Preparação de organismos procariotas e eucariotas, utilizando secagem química para análise morfológica em microscopia eletrônica (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Preparação da grade microscópica crio-elétron para estudos resolvidos pelo tempo usando um novo sistema robótico, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal details that are important for understanding the autophagic process. However, EM methods often lack molecular information, obstructing the correlation of ultrastructural information obtained by EM to fluorescence microscopy-based localization of specific autophagy proteins. Furthermore, the rarity of autophagosomes in unaltered cellular conditions hampers investigation by EM, which requires high magnification, and hence provides a limited field of view.
In answer to both challenges, an on-section correlative light-electron microscopy (CLEM) method based on fluorescent labeling was applied to correlate a common autophagosomal marker, LC3, to EM ultrastructure. The method was used to rapidly screen cells in fluorescence microscopy for LC3 labeling in combination with other relevant markers. Subsequently, the underlying ultrastructural features of selected LC3-labeled spots were identified by CLEM. The method was applied to starved cells without adding inhibitors of lysosomal acidification.
In these conditions, LC3 was found predominantly on autophagosomes and rarely in autolysosomes, in which LC3 is rapidly degraded. These data show both the feasibility and sensitivity of this approach, demonstrating that CLEM can be used to provide ultrastructural insights on LC3-mediated autophagy in native conditions-without drug treatments or genetic alterations. Overall, this method presents a valuable tool for ultrastructural localization studies of autophagy proteins and other scarce antigens by bridging light microscopy to EM data.

Here, we present a protocol for optimized on-section correlative light-electron microscopy based on endogenous, fluorescent labeling as a tool to investigate the localization of rare proteins in relation to cellular ultrastructure. The power of this approach is demonstrated by ultrastructural localization of endogenous LC3 in starved cells without Bafilomycin treatment.

Localização ultraestrutural da CL3 endógena por microscopia óptica-eletrônica correlativa em seção

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Novo protocolo para preservação simultânea de fluorescência e ultraestrutura

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a comprehensive microscopy that combines the localization information provided by fluorescence microscopy (FM) and the context of cellular ultrastructure acquired by electron microscopy (EM). CLEM is a trade-off between fluorescence and ultrastructure, and usually, ultrastructure compromises fluorescence. Compared with other hydrophilic embedding resins, such as glycidyl methacrylate, HM20, or K4M, Epon is superior in ultrastructure preservation and sectioning properties. Previously, we had demonstrated that mEosEM can survive osmium tetroxide fixation and Epon embedding. Using mEosEM, we achieved, for the first time, Epon post embedding CLEM, which maintains the fluorescence and the ultrastructure simultaneously. Here, we provide step-by-step details about the EM sample preparation, the FM imaging, the EM imaging, and the image alignment. We also improve the procedures for identifying the same cell imaged by FM imaging during the EM imaging and detail the registration between the FM and EM images. We believe one can easily achieve Epon post embedding correlative light and electron microscopy following this new protocol in traditional EM facilities.

Autor em destaque: Avanços em microscopia eletrônica e de luz correlativa com preservação de proteínas fluorescentes

We present a detailed protocol for Epon post-embedding correlative light and electron microscopy using a fluorescent protein called mScarlet. This method can maintain the fluorescence and the ultrastructure simultaneously. This technique is amenable to a wide variety of biological applications.