Esta técnica de microscopia eletrônica de volume é usada para realizar estudos biológicos que requerem a observação de uma estrutura 3D. Oferecendo uma haste, visão de fielder e armazenamento de amostras antes da retomada da imagem. Fx2 Asan projetou os estágios de caminho que catalisam a deabilização para aumentar o teste de elétrons das estruturas alvo e pode ser usado para localizar um alvo específico de interesse.
Essas partículas combinam o uso de luz correlativa e técnica de microscopia eletrônica 3D para investigar as interações entre organelas membranous e células hospedeiras. 16 a 24 horas após a transfecção, lave suavemente a cultura com 250 microliters de 30 a 37 graus Celsius solução de fixação. Substituindo rapidamente a lavagem por 1,5 mililitros de solução de fixação fresca, e colocando a cultura no gelo por 30 minutos.
No final da incubação, enxágue as células com três lavagens de dez minutos em um mililitro de tampão de cacodilato de sódio molar 0,1 molar por lavagem. Após a última lavagem, adicione um mililitro de 0 a 4 graus Celsius 20 milmolar glycine solução ao prato para uma incubação de dez minutos no gelo seguido por três lavagens de cinco minutos com um mililitro de tampão de cacodilato de sódio fresco e frio de 0,1 por lavagem. Em seguida, rotule as células com 500 microliters de solução DAB recém-preparada.
E incubar as células no gelo por aproximadamente cinco a quarenta e cinco minutos. Quando uma mancha marrom clara é visível sob um microscópio de luz invertida, enxágue as células três vezes com um mililitro de tampão de cacodila de sódio molar 0,1 fresco por dez minutos por lavagem. Em seguida, use um microscópio invertido de contraste de fase para visualizar a coloração DAB a uma ampliação 100 vezes maior ou superior e marque o fundo do vidro onde a região de interesse está localizada.
Para a preparação da amostra de blocos de microscópio eletrônico, primeiro pós-fixar as células com um mililitro de 2% de tetroxida de ósmio reduzido por uma hora a quatro graus Celsius. No final da fixação, enxágue as células com três lavagens de cinco minutos e um mililitro de água fresca destilada por lavagem. Antes de tratar as células com um mililitro de solução TCH filtrada por 20 minutos.
No final da incubação, lave as células três vezes em água destilada como apenas demonstrado e fixe as células com uma incubação de 30 minutos em 2% de tetroxida de ósmio reduzido. No final da segunda fixação, lave as células três vezes com água destilada e cubra a cultura com um mililitro de acetato aquoso de 1%uranyl durante a noite a 4 graus Celsius protegido da luz. Na manhã seguinte, lave as células três vezes com água destilada antes de coloração com um mililitro de 60 graus Celsius aqueceu a solução de aspartato de chumbo de Walton por 30 minutos em um forno de 60 graus Celsius.
No final da incubação, lave as células três vezes em água destilada. E incubar a cultura em uma série classificada de 20 minutos 2 mililitros de etanol aliquots. Após a última exposição 100% ao etanol, incubar as células por 30 minutos em um mililitro de três a um etanol para uma mistura de baixa viscosidade incorporando meio à temperatura ambiente.
No final da incubação, substitua o meio por um mililitro de etanol de um para um para o meio de mistura de baixa viscosidade para outra incubação de 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, substitua o meio por um milímetro de etanol de um a três para o meio de mistura de incorporação de baixa viscosidade por mais 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, substitua o meio por um mililitro de 100% de baixa viscosidade incorporando meio durante a noite, seguido pela incorporação da amostra em mistura de incorporação de viscosidade 100% baixa por 24 horas a 60 graus Celsius.
Para a análise da microscopia eletrônica de transmissão, no dia seguinte, use um ultra microtómeo para obter seções de 90 nanômetros de espessura e observar a rede sob microscopia eletrônica de transmissão a 200 quilovolts. Antes de iniciar a preparação da amostra, limpe as tampas de vidro revestida de óxido de lata de índio com agitação suave em isopropanol por 30 a 60 segundos. No final da agitação, drene o excesso de álcool e coloque as tampas em um ambiente livre de poeira.
Quando as tampas estiverem secas, use um revestimento de plasma para ressarcar as tampas por um minuto. Em seguida, insira as tampas no suporte do substrato e coloque o suporte do substrato no barco da faca. Para obter amostras para a microscopia eletrônica de varredura, insira o bloco de amostra incorporado no suporte amostral do ultramicrotome.
E coloque o suporte no bloco de corte. Use uma lâmina de barbear para cortar o excesso de resina ao redor da posição alvo para que a face do bloco adquira uma forma trapézio ou retangular. As bordas principais e de arrasto devem ser estritamente paralelas umas às outras.
Não é fácil adquirir um grande número de seções de série. No entanto, você tem que ter as bordas principais e bordas de trilha completamente paralelas. Em seguida, insira o suporte de amostra no braço do ultramicrotome.
Coloque a faca de diamante no porta-faca e encha o barco da faca com água destilada filtrada. Em seguida, empurre cuidadosamente a pega do suporte para ajustar a posição do portador para que a borda das tampas fique próxima da faca. Após a obtenção da amostra, pare o processo de secção, abra lentamente o parafuso de fixação do tubo e escorra o barco de água.
Quando o processo de coleta da fita estiver concluído, remova o substrato com a alça do dispositivo de fixação e seque a fita. O uso de plasmídeos geneticamente marcados expressando proteínas de interesse, permite a identificação das células-alvo transfectadas após a coloração para as proteínas marcadas. A microscopia eletrônica de luz correlativa pode então ser usada para visualizar ainda mais a cultura celular rotulada.
Por exemplo, a mancha escura gerada pelo SCO1-APEX2 é observada exclusivamente no espaço intermembano mitocondrial e não no espaço matrúmico das mitocôndrias. Células transfeinadas de código com plasmídeos SCO1-APEX2 e HRP-KDEL expressam um sinal de elétron altamente denso no espaço intermembano mitocondrial e no ritúlume endoplasmático. No entanto, nenhuma coloração de órticulo endoplasmático é observada em células que são transfectadas apenas com SCO1-APEX2.
Para imagens seriais através da microscopia eletrônica, uma visão geral de toda a imagem da matriz é criada usando um detector de elétrons backscatter sobre uma grande área. Em seguida, a região de interesse é colocada na primeira seção e propagada para todas as outras seções. Finalmente, a região de interesse contendo cinco células-alvo é imagens com cinco pixels de imagem nanômetro.
A ampliação revela estruturas subcelulares detalhadas, como o aparelho Golgi, mitocôndrias e retículo endpolasmico. Imagens seriais revelam claramente que os contatos endoplasmáticos de órticulo-mitocôndrias ocorrem em diferentes z-planes. Você deve ter uma boa compreensão de como localizar uma estrutura de alvo específica usando a microscopia de luz correlativa e elétrons para investigar os efeitos de uma modificação de identidade específica.
Essas técnicas de coloração combinadas com microscopia eletrônica de volume poderiam ser usadas para em maior escala para investigar interações celulares particularmente no eurovírus. Lembre-se que o glutaraldeído, também enteterocide e TCH são muito tóxicos, por isso não deixe de usar roupas protetoras e trabalhar em um capuz de fumaça ao usar esses materiais.
