Este trabalho foi suportado pelo financiamento da Fundação Overstreet.

1. Configuração básica antes de prosseguir para Cultura Celular <ol><li> NeuroCult Médio NSC basal e Suplementos NeuroCult NSC proliferação, são misturados a uma proporção de 9:1, respectivamente, para fazer médio NSC completa. </li><li> A 37 ° C banho de água é usada para aquecer o meio. </li><li> Quantidade apropriada de inactivado pelo calor soro fetal de vitelo (FCS) é descongelado. </li><li> Quantidade apropriada de soluções de reserva do factor de crescimento incluindo o factor de crescimento epidérmico (EGF a 10 ug / ml), factor de crescimento básico de fibroblastos (b-FGF, 10 ug / ml) e 0,2% de solução de heparina em salina tamponada com fosfato (PBS) são descongeladas. </li><li> Frascos de cultura de tecidos (T25, T75 e T175 ou) são necessários para NSC expansão e de diferenciação. </li><li> A cultura de tecidos tratados 96 e placas de 24 poços e lamelas de vidro são necessários para cultivar células ordenados. </li></ol> 2. Isolamento e Expansão (Passaging) de NSCs <ol><li> -Tronco neurais e progenitores são isoladas e se expandiu a partir do mouse bchover, tal como descrito nos protocolos separadas 1, 2 e 3. </li><li> Quando o neuroesferas (neuroesferas primária ou passadas) estão prontos para subcultura (150-200 um de diâmetro), as esferas meio contendo é transferida para um tubo de cultura apropriado tamanho estéril tecido, e centrifugado a 800 rpm (110 g) durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> O meio sobrenadante é removido e as esferas são re-suspensas em 1 ml de pré-aquecida a 0,05% de tripsina-EDTA. </li><li> Após a incubação num banho de água 37 ° C durante 2-3 min, um volume igual de inibidor de tripsina de soja é adicionado à suspensão de células para parar a actividade da tripsina. </li><li> Para assegurar que a tripsina foi completamente inactivada, a suspensão de células é suavemente pipetados para cima e para baixo 3-5 vezes. </li><li> Após centrifugação a 800 rpm (110 g) durante 5 min, o sobrenadante é removido e as células são re-suspensas em 1 ml de meio de NSC completa. </li><li> 10 ul da suspensão celular é misturada com 90 uL de trypan azul para realizar uma contagem de células. Nota: Outras diluições de células adequadas pode também ser usado. </li><li> As células são então utilizadas para subcultura 1, 2 ou para a diferenciação, como descrito abaixo. </li></ol> 3. Diferenciação de tronco neurais e células progenitoras, O Ensaio neuroblastos (NBA) <ol><li> Células resultantes de neuroesferas dissociadas são plaqueadas a uma concentração de 2-3 x 10 5 células / ml em meio NSC completo suplementado com 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml de bFGF, 1 ul / ml de heparina a 0,2% e 5% FCS inactivado pelo calor, em um frasco de cultura apropriado tamanho do tecido. 5 ml de meio é usado para T25, 20 ml para T75 e 40 ml para frascos T175. Nota: FCS fará com que as células para anexar firmemente ao substrato e não há necessidade de revestimento dos frascos para cultura NBA. </li><li> Cultofrascos Ure são então incubadas em 37 ° C incubadora humidificada com 5% de CO 2, durante 3-4 dias. Este período é chamado fase de proliferação, durante o qual a descendência NSC anexar para o substrato e proliferam como uma monocamada de células. </li><li> Quando a cultura se torna confluente de 90-95%, o meio de cada balão está ligado ao meio de NSC completo suplementado com FCS 5%, sem quaisquer factores de crescimento. </li><li> Frascos de cultura são novamente incubadas em 37 ° C incubadora humidificada com 5% de CO 2 por mais 3-4 dias. Este período é chamado estágio de diferenciação, durante o qual progenitores neuronais aparecem no topo de uma monocamada astrocítica e proliferam para fazer as colónias de células neuronais imaturas. No dia 4-5 do estágio de diferenciação, a cultura está pronto para o isolamento das células neuroblasto usando a tecnologia de citometria de fluxo. </li></ol> 4. Preparação de células por citometria de fluxo Trypsinização <ol><li> A cultura de diferenciar progenitura NSC no dia 4-5 do estágio de diferenciação é lavada uma vez com uma quantidade apropriada de PBS (2 ml por T25, 4 ml de T75 e 8 ml para T175 balão) para remover FCS a partir da cultura. Nota: FCS blocos Tripsina-EDTA atividade. </li><li> Em seguida, uma quantidade suficiente de pré-aquecida a 0,05% de tripsina-EDTA (2 ml por T25, 4 ml de T75 e 8 ml para T175 balão) é adicionado a cada frasco para cobrir a monocamada de células e incubado durante 1-2 min em uma 37 ° C incubadora humidificada. </li><li> O balão é verificada ao microscópio para avaliar o efeito de Tripsina-EDTA sobre a cultura. O balão é então realizada com uma mão e atingiu firmemente com a outra mão para desalojar as células da parte inferior do balão. </li><li> Volume igual de inibidor de tripsina de soja é adicionado ao balão para extinguir a actividade da tripsina. A suspensão de células é suavemente pipetados para cima e para baixo para assegurar a inactivação de tripsina e para conseguir uma célula única homogéneasuspensão. Nota: Alternativamente, meio suplementado com FCS 5% pode ser usado para extinguir a actividade da tripsina. </li><li> Para remover não diferenciados aglomerados, a suspensão de células é passada através de um filtro de malha 40-m de tamanho. </li><li> A suspensão de células é então centrifugado a 800 rpm (110g) durante 5 min, o sobrenadante é removido e as células são re-suspensas num volume apropriado de meio NSC completa. </li><li> O volume final de suspensão de células é ajustada de modo que a densidade de células não exceda 2-3x10 6 -cells/ml. A densidade celular elevada pode causar o bloqueio de fluxo na máquina de citometria de fluxo. </li><li> Se você gostaria de isolar as células neuronais apenas com base em suas propriedades físicas, agora você pode continuar a FACS de classificação, conforme descrito na parte 4. </li><li> Antes de triagem, iodeto de propídio (PI, Sigma, 500 ug / ml em PBS) é adicionado a uma concentração de 1 ul / ml de suspensão de células para excluir as células mortas. </li></ol> Ao vivo cell imunomarcação Para alcançar uma pureza mais elevada de células neuronais, colhido única célula a partir da cultura NBA podem ser coradas para PSA-NCAM (um marcador de início imaturos progenitores neuronais) e, em seguida, as células positivas a partir da população neuronal pode ser isolado utilizando a máquina de FACS. <ol><li> Depois de realizar uma contagem de células, a suspensão de célula única a partir da cultura NBA é dividido em quatro grupos: <ul><li> Células de grupo, por si só serve como um controlo para ajustar os parâmetros e portões (0,5-1 x 10 6 células). </li><li> Células mais PI, serve como um controlo para ajustar os parâmetros e portões (0,5-10 x 10 6 células). Células pi negativo deste grupo pode também ser classificados com base nas características físicas de células. </li><li> Secundário sozinho grupo (isotipo de controlo), que também serve como um controlo para ajustar os parâmetros e portões (1-2 x 10 6 células). </li><li> Imunomarcação grupo (8-10 x 10 6 células) que é corado para PSA-NCAM para atingirpurificação adicional das células imaturas neuronais. Para excluir as células mortas sobre a classificação, PI é adicionado a esse grupo também. </li></ul></li><li> Para iniciar imunomarcação, as células são centrifugadas a 800 rpm (110 g) durante 5 min. O sobrenadante é removido e as células são re-suspensas em 100 uL de meio de NSC completa. </li><li> Ficoeritrina (PE) anticorpo anti-PSA-NCAM conjugado é adicionado a uma razão de 10 ul / 5-10 x 10 6 células para a suspensão de células a serem coradas para PSA-NCAM. Da mesma forma, um ratinho conjugada PE IgG1 anticorpo de controlo de isotipo é adicionado à suspensão de células de isotipo de controlo. Seguir as instruções sobre a folha de especificação anticorpo em relação à concentração de anticorpo a ser utilizado. A suspensão de células é então misturada suavemente e incubada à temperatura ambiente durante 10-15 min no escuro. </li><li> As suspensões de células (PSA-NCAM e os tubos de controlo de isotipo) são então centrifugadas a 800 rpm (110 g) durante 5 min, o sobrenadante é removido e as células são re-suspended em 1 ml de meio de NSC completa. </li><li> Para remover o excesso de un-delimitadas anticorpos a partir das amostras, 4 passo é repetido 2-3 vezes. </li><li> Depois de re-suspensão de células num volume apropriado de meio, iodeto de propídio (PI, Sigma, 500 ug / ml em PBS) é adicionado a uma concentração de 1 ml / ul das suspensões de células (células mais PI, isotipo de controlo e PSA- NCAM coradas amostras) para excluir as células mortas quando analisados ​​por citometria de fluxo. </li><li> 15 ml tubos estéreis falcon contendo 1 ml de meio completo estão preparados para recolher as células ordenados de populações de células diferentes. </li></ol> 5. Fluorescência-activated cell sorting (FACS) de neurônios imaturos <ol><li> A máquina FACS está configurado com base em sua instrução manual do usuário através do fluxo de técnico especialista em citometria de instalação. </li><li> Salina tamponada com fosfato (PBS) ou qualquer outra solução adequada depending em instruções do fabricante, poderia ser usado como fluido de bainha menos 28 PSI através de um bocal 90 uM. </li><li> Pressão diferencial no sistema é ajustada de tal modo que a taxa de gatilho tipo não exceda 2500 eventos por segundo. </li><li> A suspensão de células a partir das células por si só grupo é executado através da máquina de FACS. </li><li> Primeiro, as células (eventos) são traçados com base em seu tamanho (Forward Scatter (FSC) luz) versus complexidade interna (Side Scatter luz (SSC)) para distinguir diferentes populações de células. Para fazer isso, os parâmetros de tensão para o FSC e SSC deve ser ajustada de modo que as células pode ser visto na trama de citometria de fluxo. </li><li> Para excluir aglomerados de células e doublet, as células são primeiro traçado com base na área de dispersão para a frente (FSC-A) versus largura de impulso para a frente de dispersão (FSC-W) ea população única célula é fechado como população 1 (P1). Em seguida, as células P1 são traçados com base na área do lado de dispersão (SSC-A) x largura de pulso de dispersão lateral (FSC-W) e este tempo as células individuais são gated como população 2 (P2). Tendo estabelecido esses dois portões consecutivos, grupos ou dupletos (largura de pulso de alta FSC e SSC alta largura de pulso) estão sendo excluídos. </li><li> Para excluir células mortas ou danificadas, as células individuais (P2) são plotados com base na PI reatividade contra FSC-A ea população única célula viva está fechado. </li><li> Individuais de células vivas são traçados com base no FSC contra SSC para distinguir diferentes populações de células com base no tamanho da célula e granularidade interna. Nesta fase duas populações celulares principais são gated como FSC baixo SSC baixo (P3) e de alta FSC SSC elevada (P4) populações de células. </li><li> Para classificar PSA-NCAM imuno-reativas imaturos células neuronais da população SSC FSC baixo baixo, primeiro o FSC população SSC baixo baixo do controle de células (mais PI e isotipo controle) grupos é traçado com base na imunorreatividade PE contra FSC-A eo negativo As células são gated (P5), e, em seguida, as células positivas de PSA-NCAMgrupo manchado são gated como população 6 (P6). </li><li> Depois de ajustar todas as portas necessárias, as células de interesses são classificados em 15 ml de tubos de tecido estéreis de cultura contendo 1ml médio NSC. </li><li> As células são então classificadas centrifugada a 1200 rpm (240 g) durante 5 min. </li><li> Sobrenadante é eliminado eo sedimento é re-suspenso em um volume apropriado de meio (dependendo do tamanho pellet) e uma contagem de células é realizada. </li><li> As células são então plaqueadas em poli-L-ornitina revestidos placas de 96 poços a uma densidade de 20-30 x 10 3 células / poço em 200-250 ul de meio completo com NSC FCS 5% e 20 ng / ml humana recombinante BMP4 5 . </li></ol> Nota: para o revestimento 96 poços, 100 ul de Poli-L-ornitina solução de trabalho (1,5 ml de poli-O e 8,5 ml de PBS estéril) é adicionado a cada poço ea placa é incubada numa incubadora a 37 ° C durante pelo menos uma horas. Em seguida, o poli-S é removido e cada poço é lavado três vezes com PBS estéril(Deixe o PBS permanecem no poço durante 10 min de cada vez). Use 500 uL de poli-L-ornitina solução de trabalho / poço se placas de 24 poços são utilizados. <ol start="14"><li> As células são então fixadas em pontos de tempo diferentes após ordenação usando paraformaldeído a 4% frio e imunocoradas para adequadas marcadores de células neuronais e gliais para avaliar o fenótipo de células ordenados de populações de células diferentes. </li></ol> 6. Os resultados representativos No neuroblasto cultura diferenciação de ensaio (NBA), células plaqueadas anexar para o substrato de cultura de tecidos e crescer como uma monocamada. Dependendo da densidade inicial de células em placas, a cultura vai se transformar em uma cultura de 90-95% confluentes após 3-4 dias. Nesta fase, uma monocamada de células, principalmente astrocíticos pode ser visualizado por baixo com pequenas redondas células progenitoras neuronais em 4,5 topo (Figura 1). Depois de mudar o meio para um meio de fator de crescimento livre, as células progenitoras neuronais começardividindo rapidamente e gerar grupos de células neuroblasto imaturas no topo da monocamada astrocítica em 4-5 dias (Figura 2). Análise de citometria de fluxo da cultura NBA dissociado em dia 4-5 do estágio de diferenciação, mostra duas populações de células principais; FSC baixo SSC baixa e alta FSC SSC elevada com base no tamanho da célula (FSC) e granularidade interna (SSC) (Figura 3). Imuno-fluorescente análise das células ordenados mostra que as células neuronais são principalmente localizados nas populações FSC baixos SSC baixo (com mais de 75% deles expressando β-III tubulina), enquanto as células ordenadas a partir da população FSC SSC alta alta são na sua maioria GFAP astrócitos imunorreactivos (Figura 4). A purificação adicional da imaturos células neuronais até homogeneidade próximo (97%) poderia ser alcançado com a selecção positiva de células PSA-NCAM IR a partir da população FSC SSC baixo baixo (Figura3, 4). Enriquecidas células neuronais gerados a partir dos NSCs isoladas de E14 eminências rato ganglionares adquirir um fenótipo GABAérgico e expressa DARPP-32, um marcador de neurónios espinais médio, na diferenciação (Figura 5). <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig1.jpg" alt="A Figura 1"/> Figura 1. Cultura ensaio neuroblasto de E14 de mouse células-tronco neurais no dia 4 de estágio de proliferação. Esta cultura de monocamada consiste de células planas astrocíticos (pontas de seta) debaixo e redondos células progenitoras neuronais (setas) na parte superior. Aumento original; 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig2.jpg" alt="A Figura 2"/> . Figura 2 cultura ensaio neuroblasto de E14 de mouse células-tronco neurais no dia 4 de estágio de diferenciação: um contraste de fase), de coloração B) imunofluorescência. Observe o aglomerado de células neuronais imaturas (setas em A </strong&gt; e coloração tubulina β III em B) na parte superior da monocamada astrocítica (cabeças de seta em A coloração GFAP, em B). Aumento original; 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig3.jpg" alt="A Figura 3"/> Figura 3. Parcelas de classificação representativos: A). FSC vs SSC trama tipo antes exclusão de dupletos e células mortas. B, C). Parcelas de classificação para a exclusão de dupletos com base no FSC e SSC largura de pulso. D). Exclusão de células mortas e danificadas com base na imunorreactividade de propídio iodeto. E). FSC vs SSC trama após a exclusão de dupletos e células mortas, mostrando os dois principais populações rotulados como de baixa FSC SSC baixo e os FSC altas populações SSC elevadas. F, G). Parcelas de classificação para isolar as células PSA-NCAM IR imaturas do FSC população SSC baixo baixo. Micrografias Figura 4. Representativos de células ordenadas a partir de diferentes populações um dia após o plaqueamento. A) FSC baixo população SSC baixa (mais de 75% destas células são neurónios). B) FSC alta população SSC elevada (a maioria destas células são astrócitos ). C) PSA-NCAM + células classificados do FSC população SSC baixo baixo (quase todas as células são classificadas neurônios). Ampliação Original; 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig5.jpg" alt="A Figura 5"/> A Figura 5. Ordenado neurónios imaturos diferenciar em neurónios GABAérgicos (A) e expressas DARPP-32 (B), um marcador para médio neurónios espinais.

<ol>
	<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay.">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).</li><li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells.">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).</li><li>Scheffler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterization+of+adult+brain+neuropoiesis.">Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).</li><li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+immature+neuronal+cells+from+neural+stem+cell+progeny.">Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny.</a> PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).</li><li>Amariglio, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-Derived+Brain+Tumor+Following+Neural+Stem+Cell+Transplantation+in+an+Ataxia+Telangiectasia+Patient.">Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient.</a> Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A capacidade de isolar populações definidas de células neurais (neurônios, ou seja, astrócitos e oligodendrócitos) pode resolver alguns dos impedimentos associados à aplicação clínica de células-tronco neurais (NSCs). Em primeiro lugar, permite-nos para caracterizar completamente a população inicial de células do doador. Em segundo lugar, nos permite usar um tipo particular de célula ou uma combinação de diferentes tipos de células com um rácio específico, dependendo da natureza ou da fase da doença...

<table border="1"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Tipo </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> NeuroCult Médio NSC Basal </td><td> Médio </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05700 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Suplementos Proliferação </td><td> Suplemento de meio </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05701 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% de tripsina-EDTA </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> Inibidor de tripsina de soja </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> * MEM </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 41500-018 </td><td> Componente HEM </td></tr><tr><td> * Os HEPES </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> Componente HEM </td></tr><tr><td> * A água destilada </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> Coador celular </td><td> Peneira </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> T25 balão </td><td> Cultura louça </td><td> Nalge Nunc internacional </td><td> 136196 </td><td></td></tr><tr><td> T80 balão </td><td> Cultura louça </td><td> Nalge Nunc internacional </td><td> 178905 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubos </td><td> Cultura louça </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de 50 ml </td><td> Cultura louça </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Fator de crescimento </td><td> R &amp; D </td><td> 2028-EG </td><td></td></tr><tr><td> b-FGF </td><td> Fator de crescimento </td><td> R &amp; D </td><td> 3139-FB </td><td></td></tr><tr><td> Heparina </td><td> Fator de crescimento </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Reconstituído em PBS </td></tr><tr><td> Anti-PSA-NCAM-PE </td><td> Anticorpo </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-093-274 </td><td></td></tr><tr><td> PE-conjugado IgG1 rato </td><td> Isotipo de anticorpo de controlo </td><td> BD Pharminogen </td><td> 556029 </td><td></td></tr><tr><td> Heparina </td><td> Fator de crescimento </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Reconstituído em PBS </td></tr><tr><td> HrBMP-4 </td><td> Fator de crescimento </td><td> R &amp; D </td><td> 314-BP-010 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-Ornithine </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> P4957 </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal de vitelo </td><td> Suplemento Médio </td><td> Gibco </td><td> 10099-141 </td><td></td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Anticorpo </td><td> DAKO </td><td> Z0334 </td><td></td></tr><tr><td> B-III tubulina </td><td> Anticorpo </td><td> Promega </td><td> G7121 </td><td></td></tr></table> * Para fazer HEM, mistura 1 x pacote L 10 de MEM e 160 ml de HEPES 1M e levar o volume a 8,75 L com água destilada. Ajuste o pH final para 7,4 e armazená-lo a 4 ° C.

the neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry

As células estaminais neurais (NCCC) podem ser isoladas e expandidas em grande escala, utilizando o ensaio de neuroesfera e diferenciados para as três principais tipos de células do sistema nervoso central (SNC), ou seja, astrócitos, oligodendrócitos e neurónios. Estas características tornam haste neural e células progenitoras uma valiosa fonte renovável de células para estudos in vitro, como o rastreio de drogas, neurotoxicologia e electrofisiologia e também para a terapia de substituição de células em muitas doenças neurológicas. Na prática, contudo, a heterogeneidade da NSC descendência, baixa produção de neurónios e oligodendrócitos, e uma predominância de astrócitos seguintes diferenciação limitar as suas aplicações clínicas. Aqui, descrevemos uma nova metodologia para a purificação e posterior geração de neurônios imaturos da descendência NSC murino usando separação de células activadas por fluorescência (FACS) da tecnologia. Utilizando esta metodologia, uma população altamente enriquecida de células neuronais progenitoras pode ser conseguida witHout qualquer astrócitos perceptível e bona fide contaminação NSC. O procedimento inclui a diferenciação de NSC progenitura isoladas e expandidas a partir de E14 eminências rato ganglionares utilizando o ensaio neuroesfera, seguido por isolamento e enriquecimento de células neuronais imaturos com base nas suas propriedades físicas (tamanho e complexidade interna) e fluorescente utilizando a tecnologia de citometria de fluxo. Em geral, leva-se 5-7 dias para gerar neuroesferas e 6-8 dias para diferenciar progenitura NSC e isolar altamente purificada imaturos células neuronais.

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The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Este protocolo de vídeo demonstra um novo método para a geração e subsequente purificação de células progenitoras neuronais a partir de uma fonte renovável de células estaminais neurais (NSCs) com base na sua (granulosidade tamanho e interno) física e propriedades fluorescentes usando tecnologia de citometria de fluxo.

O Ensaio neuroblasto: um ensaio para a Geração e Enriquecimento de células progenitoras neuronais de Diferenciando Progeny Neural Stem Cell utilizando citometria de fluxo

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

the-neuroblast-assay-an-assay-for-generation-enrichment-neuronal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.4K visualizações.  The University of Florida. Este protocolo de vídeo demonstra um novo método para a geração e subsequente purificação de células progenitoras neuronais a partir de uma fonte renovável de células estaminais neurais (NSCs) com base na sua (granulosidade tamanho e interno) física e propriedades fluorescentes usando tecnologia de citometria de fluxo.

Vídeo: The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Isolamento e Expansão do Rato Adulto células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Neurociência

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Estabelecer embrionárias de rato Cultura de Células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Neurais Colony-Forming Assay Cell: um ensaio para Discriminar Bona Fide células-tronco neurais de células progenitoras neurais

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Derivação sem alimentador de células da crista neural progenitoras pluripotentes humanas de células-tronco

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Citometria de Fluxo protocolos para a superfície e intracelular Antigen análises de tipos de células neurais

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Seleção de células-tronco neurais de células progenitoras e do rato adulto subventricular Zone e Live-imagem de seus Dynamics com o ciclo celular

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. NSCs and neural progenitors (NPs) are commonly cultured in vitro as neurospheres. This protocol describes in detail how to determine the NSC frequency in a given cell population under clonal conditions. The protocol begins with the seeding of the cells at a density that allows for the generation of clonal neurospheres. The neurospheres are then transferred to chambered coverslips and differentiated under clonal conditions in conditioned medium, which maximizes the differentiation potential of the neurospheres. Finally, the NSC frequency is calculated based on neurosphere formation and multipotency capabilities. Utilities of this protocol include the evaluation of candidate NSC markers, purification of NSCs, and the ability to distinguish NSCs from NPs. This method takes 13 days to perform, which is much shorter than current methods to enumerate NSC frequency.

Neural stem cells (NSCs) refer to cells&#160;which can self-renew and differentiate into the three neural lineages. Here, we describe a protocol to determine NSC frequency in a given cell population using neurosphere formation and differentiation under clonal conditions.

Enumeração de células-tronco neurais Usando clonais Ensaios

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Identificando marcadores de superfície celular da haste neural primária e células progenitoras por rotulagem metabólica de Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...