Our research program is funded through the Emmy Noether-Program of the German Research Foundation (DFG), grant PR1132/3-1. Further support by the M&#252;ller-Fahnenberg Foundation of the University of Freiburg is gratefully acknowledged. This study was supported in part by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).

1. Neural colheita celular <ol><li> Avaliação por microscópio: <ol><li> Antes de iniciar um experimento, verificar o estado da cultura com brilhante-campo ou microscopia de contraste de fase. NOTA: Enquanto o tecido neural primário obtido a partir de dissecações é, em princípio, igualmente passível de análise por citometria de fluxo 14,28, por favor, note que o foco do protocolo está em células obtidas de sistemas in vitro de células neurais. </li></ol></li><li> Colheita de células 7: <ol><li> Lavar suavemente o prato / frasco de células aderentes com Mg2 + / Ca2 + livre salina tamponada com fosfato (PBS) à temperatura ambiente (por exemplo, 5 ml para o frasco T75, 3 ml por poço de placa de 6 poços, ou 10 ml de prato de 10 cm). NOTA: O PBS usado durante todo o protocolo é Mg2 + / Ca2 + livre. <ol><li> Para o exemplo de vídeo, utilizar um frasco T75 de células de neuroblastoma SH-SY5Y em 80% de confluência. Aplicar etapas de lavagem suplementar nos casos emdetritos considerável está presente no prato. </li><li> Considere 48 lavagens com PBS, contendo albumina de Percoll, ou de centrifugação de Ficoll 49 gradientes de soro e / ou grânulos comercialmente disponíveis 50,51. A remoção da mielina e outros lípidos ou de outros contaminantes é crítica, especialmente quando as fontes de tecidos adultos primários estão a ser utilizados. </li></ol></li><li> Adicionar pré-aquecido (37 ° C) substituição de tripsina a um volume apropriado que cobre toda a superfície do recipiente de cultura de tecidos. NOTA: Como alternativa, considere Accutase ou outras opções de digestão enzimática. Este passo crítico pode afetar negativamente a expressão epitopo superfície (ver 7). </li><li> Incubar o prato / frasco a 37 ° C durante 2-5 minutos (dependendo do tipo de célula) para permitir que as células a separar. Bata levemente o vaso de cultura de tecidos ou flush com uma pipeta sorológica para desalojar as células. Evitar o excesso de digestão (pois isso pode causar a perda de células e coagulação em etapas posteriores). </li><li> Quench a substituição da tripsina por adição de duas vezes o volume de tampão de fluxo (2% de FBS em PBS) e recolher as células num tubo de 15 ml. </li><li> Triturar suavemente a suspensão de células utilizando uma pipeta de microlitro (100 - 1000 uL) ou uma pipeta de 5 ml serológico para preparar uma suspensão de célula única. </li><li> Centrifuga-se as células a 220 xg durante 5 min a 25 ° C. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante deixando um pelete de trás. </li><li> Re-suspender o sedimento num volume apropriado de tampão de fluxo, dependendo do tamanho da pastilha (por exemplo, para um frasco T75 confluente de células SH-SY5Y o rendimento típico é de pelo menos 10 x 10 6 células, caso em que as células são ressuspensas em 5 ml de tampão de fluxo). NOTA: Se forem observados pedaços maiores ou coagulação, filtrar através de um 30 - malha 100 mm. </li></ol></li><li> A contagem das células 52: <ol><li> Transferir uma pequena alíquota da suspensão de células para um tubo de microcentrífuga e diluir em uma proporção definida em um volume de trypan azul ou um corante de viabilidade alternativa antes da transferência para um hemocitômetro ou sistema de contagem de células automatizado. </li><li> Dilui-se a suspensão de células para uma concentração de 1 x 10 6 células viáveis ​​/ ml através da adição do volume apropriado de tampão de fluxo ou PBS com 0,1% de BSA (se prosseguir com a rotulagem CFSE). NOTA: iodeto de propídio, D-7 aminoactinomycin, anexina V e comercialmente disponíveis kits de ensaio viabilidade solucionáveis ​​representam opções alternativas, a fim de avaliar a viabilidade das células. Além disso, ensaios de apoptose caspase-3 utilizando a fluorescência como anteriormente descrito 53 pode ser usado. Canais fluorescentes serão &quot;ocupado&quot; por estes reagentes que podem limitar as opções para passos subsequentes, se incluído em todas as amostras. </li></ol></li></ol> 2. Corante intracelular Etiquetagem Usando CFSE (Figura 3) <ol><li> Dilui-se a CFSE para uma concentração do material desejado que pode ser facilmente utilizado. NOTA: Para estas experiências a concentração de ações de0,01 mM foi usada. Determinar a concentração de trabalho ideal de CFSE empiricamente. </li><li> Adicionam-se 10 ul de uma solução 0,01 mM de CFSE por ml de células (Secção 1.3.2, concentração de 1 x 10 6 células / ml em PBS + BSA a 0,1%) para uma concentração final de 0,1 uM. Resumidamente vortex para misturar bem. NOTA: As concentrações de CFSE usados ​​aqui são cerca de dez vezes menor do que os normalmente aplicados em ensaios de proliferação, por conseguinte, a toxicidade celular do corante é mínima. Não observamos efeitos negativos sobre a viabilidade celular. </li><li> Incubar durante 5 min à temperatura ambiente com agitação constante (200 rpm). Proteger da luz. </li><li> Extingue-se o corante por adição de 5 volumes de tampão de fluxo para os tubos. Centrifuga-se a 94 x g durante 5 min à TA. </li><li> Descartar o sobrenadante deixando um pelete de trás. Re-suspender as células com 5 volumes de tampão de fluxo. </li><li> Centrifuga-se a 94 x g durante 5 min à TA. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em tampão de fluxo a uma concentração de 1 x 10 6 células /<html> ml. </li><li> Adicionar um número igual de células não coradas de interesse para a suspensão de células coradas. Proceder à tona protocolo de coloração antígeno (Seção 3). </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3. Detecção de expressão diferencial entre o antigénio de superfície CD duas linhas de células por células SH-SY5Y neuroblastoma CFSE corante rotulagem. São pré-marcado com CFSE, para posterior identificação em comparação com fibroblastos BJ não marcados. Co-coloração da amostra mista (painéis à direita) com marcadores de superfície CD24 ou CD54 (ambos conjugados com APC) demonstra que as linhas celulares são facilmente distinguíveis devido à coloração CFSE (Setas = SH-SY5Y; setas = fibroblastos BJ). A maioria das células SH-SY5Y expressam CD24, mas não CD54 (ICAM-1). Em contraste, os fibroblastos BJ (CFSE-negativo) são positivas para CD54, mas amplamente negativo para CD24.Target &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 3. celular coloração da superfície <ol><li> Etiqueta de tubos, incluindo amostras e controlos críticos (ver Tabela 1). </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tubo não. </td><td> Nome da amostra </td><td> Antigen-fluorophore </td><td> Diluição </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Células não coradas </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> Manchado Individual </td><td> CD24-APC </td><td> 01:50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Manchado Individual </td><td> TUJ1-Alexa 488nm fluor </td><td> 1: 2000 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Duplo manchado </td><td> CD24-APC </td><td> 01:50 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> TUJ1-Alexa 488nm fluor </td><td> 1: 2000 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Manchado Individual</td><td> Secundária só: Alexa 488nm fluor </td><td> 1: 2000 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. L ist de tubos para ser incluído em um fluxo típico citometria experimento. A tabela mostra um conjunto mínimo de tubos de amostra necessários para uma experiência de co-coloração descrito neste artigo de vídeo. Um experimento ideal deve incluir todos os controles necessários (e positivas, bem como controles negativos de compensação) para a interpretação precisa dos resultados obtidos. <ol start="2"><li> Adicionar 100 ul de suspensão de células (a partir da Secção 2.7 ou 1.3.2) a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. NOTA: Certifique-se de um mínimo de 0,1 x 10 6 células estão presentes por 100 mL de suspensão de células. </li><li> Adicionar fluoróforo anticorpo conjugado com a amostra a uma diluição adequada. NOTA: Determinar a diluição de trabalho de cada um dos anticorpos, antes da experiência. Ver Tabela 2 para uma lista of antigénios de superfície neurais. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Antígeno </td><td> Tipo celular </td><td> Referência </td></tr><tr><td> CD15 </td><td> As células estaminais neurais </td><td> [28, 67] </td></tr><tr><td> CD24 </td><td> Células neuronais </td><td> [28, 68] </td></tr><tr><td> CD29 </td><td> As células estaminais neurais </td><td> [28, 69, 70] </td></tr><tr><td> CD44 </td><td> As células da glia </td><td> [25] </td></tr><tr><td> CD49f </td><td> As células estaminais neurais </td><td> [38] </td></tr><tr><td> CD56 (NCAM) </td><td> Células neuronais </td><td> [71] </td></tr><tr><td> CD133 </td><td> As células estaminais neurais </td><td> [27] </td></tr><tr><td> CD184 </td><td> Células-tronco neurais e células gliais </td><td> [25] </td></tr><tr><td> CD200 </td><td> Células neuronais </td><td> [38] </td></tr><tr><td> CD271 </td><td> Células-tronco da crista neural </td><td&gt; [25] </td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> As células da glia </td><td> [31] </td></tr><tr><td> CORIN </td><td> Precursores dopaminérgicos </td><td> [35, 36] </td></tr><tr><td> FORSE1 </td><td> Células-tronco neurais (NSC) </td><td> [72] </td></tr><tr><td> GLAST </td><td> As células da glia </td><td> [33] </td></tr><tr><td> NG2 </td><td> As células da glia </td><td> [32] </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Selecção de antigénios de superfície neurais. Esta tabela fornece uma lista de epítopos de superfície que se verificou ser expresso por diversos tipos de células neurais para exemplificar o aumento painel de antigénios de superfície utilizados para caracterizar a linhagem neural. Note-se que esta selecção está longe de ser completa e que a maioria destes marcadores são também expressos por uma variedade de outras células neurais e não neurais. Por conseguinte, as combinações de vários marcadores será necessária para melhor definir e isolar os subconjuntos neurais indicados. <ol start = &quot;4&quot;&gt; <li> Incubar durante 30 min num agitador orbital (200 rpm) no escuro. </li><li> Tampão de lavagem de fluxo <ol><li> Adicionar 1 ml de tampão de fluxo para os tubos. Centrifugar a 380 g durante 4 min a 4 ° C. </li><li> Descartar o sobrenadante deixando um pelete de trás. </li></ol></li><li> Repita o passo de lavagem de novo. </li><li> Após a segunda lavagem, decantar o sobrenadante e ressuspender as células em tampão de fluxo para um volume final de 100 ul. </li><li> Use amostra para análise de citometria de fluxo. Como alternativa, proceder com a Seção 4 e 5. NOTA: Se as células estão a ser classificado e colocado de volta na cultura pós-FACS (ou seja, a suspensão de células viáveis ​​sem fixação ou permeabilização), aplicar técnicas de assepsia durante a colheita, a coloração e as etapas de análise. </li></ol> 4. Fixação e permeabilização 38 <ol><li> Fixação com paraformaldeído (PFA): <ol><li> Preparar tampão de fixação contendo 2% de PFA em PBS. <br/&gt; NOTA: PFA é prejudicial aos seres humanos e ao meio ambiente. Usar equipamento de protecção individual adequado e descarte de resíduos, de acordo com os regulamentos locais. </li><li> Adicionar 500 ul de tampão de fixação de 100 ul de suspensão de células. </li><li> Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 15 min num agitador orbital (100 rpm) no escuro. </li></ol></li><li> PBS lavagem: <ol><li> Adicionar 1 ml de PBS ao tubo. Centrifuga-se a 380 xg durante 3 min a 4 ° C. </li><li> Descartar / decanta-se o sobrenadante deixando aproximadamente 100 ul do tubo. </li></ol></li><li> Permeabilização com Tween-20: <ol><li> Preparar tampão de permeabilização que contém 0,7% de Tween-20 em PBS. </li><li> Adicionar 500 ul de tampão de permeabilização de 100 ul de suspensão de células. </li><li> Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 15 min num agitador orbital (100 rpm) no escuro. </li></ol></li><li> Lavar as células uma vez com PBS (como descrito na Secção 4.2) e remover o sobrenadante do co tubosmpletely, deixando apenas o sedimento atrás. </li></ol> 5. Coloração Intracelular Antigen 38 (Figura 4) <ol><li> Preparação das soluções de anticorpos primários: <ol><li> Dilui-se os anticorpos primários em tampão de diluição contendo 1% de albumina de soro bovino, 10% de soro (por exemplo, burro ou soro de cabra normal) e 0,5% de Tween-20 em PBS. NOTA: Escolha o soro a ser utilizado, dependendo da espécie os anticorpos secundários foram levantados no. </li><li> Alternativamente, usar Zenon rotulagem de fluoresceína o anticorpo primário de acordo com as instruções do fabricante. <ol><li> Prepare 1 jig de anticorpo primário em PBS a uma diluição adequada (volume total ≤ 20 ul). </li><li> Adiciona-se 5 ul de reagente de marcação Zenon fluoresceína IgG (Componente A) à solução de anticorpo. </li><li> Incubar a mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Adiciona-se 5 ul de reagente de bloqueio Zenon (Componente B) à mistura de reacção. </li><li> Incubara mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente. Aplicar o anticorpo com a amostra em 30 min. </li></ol></li></ol></li><li> Coloração de anticorpo primário: <ol><li> Adicionar 100 ul da solução de anticorpo primário para a pelete de células e tritura-se suavemente para misturar. </li><li> Alternativamente, adicionar Zenon anticorpo marcado com fluoresceína para a suspensão de células na diluição apropriada. </li><li> Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 30 min num agitador orbital (200 rpm), protegida da luz. Lavar as células uma vez com PBS (como descreve na Secção 4.2) e remover o sobrenadante dos tubos completamente, deixando apenas o sedimento atrás. </li></ol></li><li> Coloração do anticorpo secundário (não necessária para os anticorpos Zenon fluoresceína marcados): <ol><li> Dilui-se os anticorpos secundários em PBS a uma concentração apropriada. </li><li> Adicionar 100 ul da solução de anticorpo secundário para a pelete de células e tritura-se suavemente para misturar. Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 30 min num agitador (200 rpm) no escuro. </li></ol></li><li> Lavam-se as amostras duas vezes com PBS (como descrito na Secção 4.2). </li><li> Lavar uma vez com tampão de fluxo (ver secção 3.5). </li><li> Re-suspender as células em cerca de 150 ul de tampão de fluxo e analisar no citómetro de fluxo. </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4. Co-coloração de superfície e proteínas intracelulares. A citometria de fluxo de dados exemplifica uma comparação entre baseada em anticorpo primário + secundário contra a coloração intracelular com base em fluoresceína Zenon em combinação com coloração de superfície. Positividade exclusiva no eixo y (quadrante superior esquerdo) e o eixo x (quadrante inferior direito) mostra células coradas para MAP2 e CD24, respectivamente. Após co-coloração, MAP2 partilhada e expressão de CD24 pode ser visto no quadrante superior direito (painéis da direita). Comparação do usoAlexa Fluor 488. (Top; AF488) versus Zenon fluoresceína (em baixo) para os rendimentos de rotulagem MAP2 resultados semelhantes <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig4highres.jpg" target="_blank">por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 6. Fluxo de análise de citometria <ol><li> Realizar uma análise de citometria de fluxo, imediatamente após a conclusão do protocolo de coloração utilizando um citómetro de fluxo com filtros adequados para a detecção de sinal. Use 488 nm laser vermelho nm azul e 640 com FL-1 (533/30), FL-2 (585/40), e filtros FL-4 (675/25) de banda. </li><li> Configure portas primárias com base na dispersão frontal e lateral excluindo detritos e células mortas. </li><li> Definir portões fluorescência para superfície e antígeno intracelular para ≤0.5% com base nas amostras não coradas e indemnizações por sobreposição espectral usando controles manchadas de solteiro. </li></ol>

The authors declare no potential conflicts of interest.

O protocolo aqui apresentado é bem estabelecido para as culturas de células neurais derivadas de células estaminais humanas, mas pode ser igualmente aplicado a outras fontes de células neurais, incluindo tecido primário ou linhas de células neuronais. Para além das fontes embrionárias, células estaminais ou progenitoras neurais pode ser extraído a partir das regiões do cérebro adulto neurogénicos 27. Além disso, a citometria de fluxo e FACS pode ser explorada para quantificar, analisar e isolar ...

A citometria de fluxo foi explorado extensivamente em imunologia, hematologia e oncologia para definir populações de células através de dispersão propriedades intrínsecas, a expressão do antigénio da superfície celular, e outros parâmetros de fluorescência 1-3. Os nossos insights sobre desenvolvimento linhagem de sangue e doença são o resultado de um significativo grau de refinamento contínuo desta metodologia após a sua implementação inicial de 4,5. O aumento da consciência do potencial analítico quantitativo e global de citometria de fluxo tem incentivado recentemente o seu uso mais difundido na pesquisa com células-tronco e pode permitir semelhante profunda progresso em um tempo mais curto 6. No entanto, a aplicação da citometria de fluxo para analisar especificamente e isolar populações neuronais tem sido entendida como um desafio. Em contraste com as células hematopoiéticas que existem naturalmente em suspensão, os tipos de células neuronais são tipicamente colhidas de fontes excessivamente complexas que podem incluir células gliais e vários outras células circundantes, bem como uma intrincada rede de neurônios portadores de processo. Consequentemente, neurobiologia ainda tem que implementar a versatilidade de citometria de fluxo para o seu potencial completo em rotinas do cotidiano da pesquisa. No entanto, desde que uma única suspensão de células viáveis ​​podem ser gerados (e protocolos têm sido desenvolvidos e optimizados para esse fim 7), citometria de fluxo e de células activadas por fluorescência (FACS) pode ser considerado um elemento valioso do repertório analítico em neurobiologia 8-11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig1highres.jpg" width="600" /> . Figura 1. Princípio da análise de citometria de fluxo e componentes de um citômetro de fluxo Fluxo cytometers compreendem três sistemas principais: fluídicos, óptica e eletrônica. Um fluxo simplificado de células em suspensão (preparada a partir de tecido primário ou em cultura in vitro) é realizada pela bainha Fluid através de focagem hidrodinâmica, a limitação da amostra para o seu núcleo central. As peças ópticas são compostos de lasers que iluminam o fluxo de células e os filtros ópticos que encaminham o sinal para os detectores apropriados. Os sinais de luz detectados são convertidos em sinais eletrônicos, posteriormente processadas por um computador e visualizadas em um monitor para análise de dados e gating. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Usuários de métodos de citometria de fluxo de lucro de pelo menos um conhecimento básico dos fundamentos subjacentes, incluindo blocos de construção de um citómetro (para revisão ver 12,13; também veja a Figura 1). Um feixe de raios laser intersecta com um fluxo de fluidos hidrodinamicamente focado que contém as células em suspensão, que por sua vez, passam através do feixe de laser em um ficheiro único &quot;um após o outro. O Interceptino de uma célula (ou qualquer outra partícula, para esse efeito) com os resultados de laser na dispersão de luz a partir deste ponto de interrogação. Luz dispersada pode ser detectada na continuação da direcção de laser (dispersão frontal, associada ao tamanho da partícula), bem como perpendiculares à sua direcção (dispersão lateral; reflectindo a granulosidade da partícula / célula). Estas propriedades de dispersão acima mencionados não exigem rotulagem específica, razão pela qual uma amostra não marcado (ou também os restos celulares, bolhas de ar, etc.) gerará um sinal (evento) na dispersão para a frente bivariada e lado dispersão comumente usado para gating inicial. Ao utilizar os lasers e filtros específicos para os espectros de excitação e de emissão correspondente adequadas, uma célula pode ser analisada quanto a sua positividade, o nível de intensidade, ou na ausência de marcadores fluorescentes. A maioria das aplicações de citometria de fluxo têm-se centrado na caracterização através de antigénios da superfície celular. Ao contrário do lineag hematopoiéticase, a linhagem neural permaneceu menos extensivamente definido de acordo com a superfície de expressão epitopo padrões 5. Uma vantagem de explorar os antigénios de superfície é que as células vivas podem ser submetidas a triagem celular paradigmas tais como FACS. Em contraste, a coloração do antigénio intracelular requer fixação e permeabilização passos para mediar a interacção epitopo-anticorpo, o que impede a jusante aplicações que exigem células viáveis. Digno de nota, tais abordagens ainda permitem inúmeros ensaios quantitativos 14, bem como análises a jusante para RNA e proteína expressão 15. Hematologia, imunologia e oncologia, muitas vezes utilizado mais de uma dúzia de marcadores em conjunto para definir determinadas subpopulações 16. Além disso, citometria de massa ou CyTOF pode agora ser utilizado para analisar se a 30 parâmetros simultaneamente 17,18. Para aplicações de células-tronco neurais, bem como culturas primárias 14,19,20 A heterogeneidade das célulasvitro é um fenômeno comum 21-23. As células não representam a população alvo de interesse encarnar um fator potencialmente confusão para leitura experimental 24,25. Convenientemente, os diferentes tipos celulares presentes dentro de uma suspensão celular heterogénea suportar perfis de expressão de antigénio distintas (conhecidas ou ainda a ser decifrados), que podem ser utilizados para definir estes diferentes populações. A citometria de fluxo pode, portanto, desempenhar um papel crucial na resolução de heterogeneidade celular e, assim, facilitar aplicações biomédicas (ensaios in vitro, de terapia celular) e otimizar a leitura quantitativa, concentrando-se no subconjunto mais relevantes 24,26. Várias combinações de antigénios de superfície foram identificados nos últimos anos para permitir o isolamento e quantificação de tipos de células neuronais específicas. Isto inclui CD133 para o enriquecimento de células estaminais neurais 27, uma combinação dos / CD24 / CD29 antigénios de superfície CD15 para o isolamento da NSC, Differentiated neurônio e células da crista neural 28 ou CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 para isolar neural e subconjuntos gliais 25, entre outras assinaturas 29,30. Além neurônios, marcadores gliais incluem A2B5 31, CD44 25, NG2 32 e GLAST 33. Uma publicação recente tem explorado o mesencéfalo marcador precursor floorplate CORIN 34,35 para enriquecer precursores dopaminérgicos no transplante de células Parkinson paradigmas 36. Moléculas de CD não são apenas marcadores, mas mediadores funcionalmente relevantes de interações célula-célula e da capacidade de uma célula para responder a estímulos a partir de moléculas de matriz extracelular e fatores de crescimento 37. Uma estratégia de reforçar ainda mais o arsenal de antigénios CD combinatórias para caracterizar desenvolvimento da linhagem neural é a utilização de marcadores intracelulares conhecidos para rastrear e definir as combinações de antigénios CD para um tipo particular de célula de interesse. Nós exploramos recentemente essa abordagem e identificaram CD49F - / CD200 padrões de expressão combinatórias altas como uma nova abordagem para o enriquecimento de subconjuntos de neurônios de pluripotentes induzidas sistemas de cultura de células-tronco diferenciadas neurally 38. Aqui, nós incluímos e discutir o último protocolo (e variações opcionais dos mesmos), em que a coloração da superfície e coloração intracelular pode ser utilizado simultaneamente para definir sub-populações de células neurais, por citometria de fluxo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig2highres.jpg" width="300" /> Figura 2. Diagrama do sistema de opções de protocolos experimentais. A figura ilustra uma representação esquemática dos principais passos envolvidos no protocolo. Passos opcionais (corante CFSE ou rotulagem antígeno intracelular) são indicados por caixas de cinza claro. Após a colheita, é essencial avaliar o número e a viabilidade de células de suspensões de células neuronais antes da coloração da superfície celular. Positivo comobem como os controlos negativos devem ser incluídos em adição às amostras de interesse. As amostras podem ser analisadas por análise de citometria de fluxo e / ou utilizadas em paradigmas de separação de células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Embora se tenha usado previamente anticorpos primários em combinação com anticorpo secundário por 38 coloração intracelular, que agora introduzir a rotulagem não-covalente do anticorpo primário através de fragmentos Fab fluorescentes (rotulagem Zenon) como uma ligeira variação, reduzindo, assim, os passos de manipulação de células 39. Além disso, como mais um exemplo da versatilidade do protocolo, que empregam uma etiquetagem opcional de um subconjunto experimental por carboxifluoresceína éster de succinimidilo (CFSE) antes da coloração de antigénio de superfície. Essa pré-rotulagem CFSE permite a comparação direta imediata de duas linhas celulares ou condições experimentais (CFSE marcado vs. sem rótulo) dentro de um único tubo de amostra, reduzindo variação ou diferenças sutis no tempo de incubação e de poupança de anticorpos. CFSE é um corante fluorescente estabelecido que é comumente usado para rastreamento de células 40, na proliferação 41,42 e barcoding experiências 43,44. Finalmente, embora passos reais (FACS, de separação de células imunomagnï¿½ica ou immunopanning) não fazem parte deste protocolo, em princípio, os procedimentos de colheita e de rotulagem descritos aqui fazer amostras de rendimento que podem ser submetidos a superfície antígeno ou aplicações de classificação baseada em rotulagem intracelulares 15 25,28. Com este artigo, pretendemos: resumir um protocolo de coloração antígeno de superfície viável 25,28, resumir um protocolo para detecção de alvos intracelulares, bem como superfície combinada e análise do antígeno intracelular 38, apresentar uma CFSE marcação com corante passo intracelular 41,45 como um opção experimental para comanalisa comparativo de populações de células neurais, e resumir abordagens para análise de citometria de fluxo (controles apropriados 13,46, gating estratégia e dados apresentação 47).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:456px;">DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:124px;">11330057</td>
			<td style="width:149px;">www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DPBS without Ca2+ Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190169</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MEM Non-essential amino acids (100 x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140035</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TrypLE Express</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604013</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>335.3</td>
			<td>www.carlroth.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td>
			<td>PAA Laboratories, Coelbe</td>
			<td>K41-001</td>
			<td>www.gelifesciences.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tween-20 Detergent</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>655205</td>
			<td>www.merckmillipore.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>65-0850-84</td>
			<td>www.ebioscience.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DMSO</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1584</td>
			<td>www.applichem.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Bottle top filters express plus 0.22 &#181;m, 250 ml</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td>www.millipore.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Cell culture treated flasks (T 25)</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>156367</td>
			<td>www.thermoscientific.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Cell culture treated flasks (T 75)</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>156499</td>
			<td>www.thermoscientific.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Conical tubes (15 ml)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>www.greinerbioone.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Conical tubes (50 ml)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>www.greinerbioone.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pasteur pipet, glass (150 mm)</td>
			<td>STEIN Labortechnik, Remchingen</td>
			<td>S03710150</td>
			<td>www.stein-labortechnik.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pipet tips (0.1-10 &#181;l)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4125</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pipet tips (1-200 &#181;l)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4126</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pipet tips (100-1000 &#181;l)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4129</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Serological pipets, 5 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4051</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Serological pipets, 10 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4101</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Serological pipets, 25 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4251</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microcentrifuge tubes (0.5 ml)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,699</td>
			<td>www.sarstedt.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microcentrifuge tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td>www.greinerbioone.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microcentrifuge tubes (2.0 ml)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,695,500</td>
			<td>www.sarstedt.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0247-42</td>
			<td>www.ebioscience.com 
			Working dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0549-42</td>
			<td>www.ebioscience.com 
			Working dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:456px;">Neuronal Class III &#946;-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-435P</td>
			<td>www.covance.com 
			Working dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21206</td>
			<td>www.lifetechnologies.com 
			Working dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Zenon&#174; Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Z-25342</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Neubauer-Improved counting chamber</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0640010</td>
			<td>www.marienfeld-superior.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td>www.scientificindustries.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.001</td>
			<td>www.eppendorf.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Accuri C6 flow cytometer</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td align="right">653118</td>
			<td>www.bdbiosciences.com/instruments/accuri</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>91-PSPIN-24R</td>
			<td>www.peqlab.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Orbital shaker, Unimax 1010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>543-12310-00</td>
			<td>www.heidolph-instruments.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>4480-50</td>
			<td>www.hettichlab.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Class II Biological safety cabinet Safe 2020</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026640</td>
			<td>www.thermoscientific.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 Incubator, Heracell 240i</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">51026331</td>
			<td>www.thermoscientific.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Vacuum system, Vacusafe comfort</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td align="right">158320</td>
			<td>www.integra-biosciences.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microscope, Axiovert 40 CFL</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td align="right">451212</td>
			<td>www.zeiss.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pipet controller, accu-jet pro</td>
			<td>Brand</td>
			<td align="right">26303</td>
			<td>www.brand.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 &#181;l)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144563</td>
			<td>www.gilson.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 &#181;l)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144565</td>
			<td>www.gilson.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 &#181;l)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144566</td>
			<td>www.gilson.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

O protocolo aqui apresentado permite abordagens para versátil experimentais (Figura 2). Na sua versão mais curta (passos 1, 3 e 6), ele pode ser considerado como um guia para a coloração simples de antigénios de superfície. Na sua forma mais complexa, um número de paradigmas de co-marcação com uma gama de antigénios intracelulares pode ser prosseguido passos opcionais (2 e / ou 4 a 5). Além d...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types at JoVE.com

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Citometria de Fluxo protocolos para a superfície e intracelular Antigen análises de tipos de células neurais

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

flow-cytometry-protocols-for-surface-intracellular-antigen-analyses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

51.9K visualizações.  University of Freiburg. We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Vídeo: Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

O Ensaio neuroblasto: um ensaio para a Geração e Enriquecimento de células progenitoras neuronais de Diferenciando Progeny Neural Stem Cell utilizando citometria de fluxo

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Neurociência

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Automatizados análises comportamentais de alto rendimento em larvas do peixe

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization of various cell types. These typically proceed with the application of antibodies to bind antigens and identify cells with characteristics that are a function of the inherent biology and development. Adult hippocampal neurogenesis is a sequential process wherein a quiescent neural stem cell can become activated and proceed through stages of proliferation, differentiation, maturation and functional integration. Each phase is distinct with a characteristic morphology and upregulation of genes. Identification of these phases is important to understand the regulatory mechanisms at play and any alterations in this process that underlie the pathophysiology of debilitating disorders. Our heat-induced antigen retrieval approach improves the intensity of the signal that is detected and allows correct identification of the progenitor cell type. As discussed in this paper, it especially allows us to circumvent current problems in detection of certain progenitor cell types.

During adult hippocampal neurogenesis, a distinct set of genetic markers are expressed when a quiescent neural stem cell sequentially progresses and develops into a functionally integrated neuron in the circuit. Using heat-induced antigen retrieval, progenitor cell types that are otherwise difficult to detect are identified with improved effectiveness.

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Preparação de fatias de cérebro aguda usando um otimizado N-metil-D-método de proteção de recuperação glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. NSCs and neural progenitors (NPs) are commonly cultured in vitro as neurospheres. This protocol describes in detail how to determine the NSC frequency in a given cell population under clonal conditions. The protocol begins with the seeding of the cells at a density that allows for the generation of clonal neurospheres. The neurospheres are then transferred to chambered coverslips and differentiated under clonal conditions in conditioned medium, which maximizes the differentiation potential of the neurospheres. Finally, the NSC frequency is calculated based on neurosphere formation and multipotency capabilities. Utilities of this protocol include the evaluation of candidate NSC markers, purification of NSCs, and the ability to distinguish NSCs from NPs. This method takes 13 days to perform, which is much shorter than current methods to enumerate NSC frequency.

Neural stem cells (NSCs) refer to cells&#160;which can self-renew and differentiate into the three neural lineages. Here, we describe a protocol to determine NSC frequency in a given cell population using neurosphere formation and differentiation under clonal conditions.

Enumeração de células-tronco neurais Usando clonais Ensaios

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Desenvolvimento de um protocolo refinado para Trans-escleral apresentam transplante de células epiteliais de pigmento Retinal humano nos olhos de rato

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Aumento Time-dependente na resposta da rede à estimulação de culturas de pilha neuronais em matrizes do micro-elétrodo

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

Preparações e protocolos para toda célula Patch Clamp gravação de neurônios Tectal Xenopus laevis

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Identificando marcadores de superfície celular da haste neural primária e células progenitoras por rotulagem metabólica de Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...