Apoiado em parte por concessões do National Institutes of Health (R01 NS37253 e N01 NS055167) e da Sociedade Nacional de Esclerose Múltipla (RG 3288-A6).

1. Preparando CFA-emulsionado Antigen <ol><li> Dissolver cobaia MBP (preparado de acordo com o método de Swanborg1 e armazenado na forma liofilizada a 4 ° C) em solução tampão fosfato (PBS) a uma concentração de 2 mg / mL. Se péptidos MBP sintetizado (MBP 60-80, SHHAARTTHYGSLPQKSQR) 2 são utilizados, preparar uma solução a 2 mg / mL. Elaborar uma quantidade apropriada de solução de antigénio (0,1 mL por rato a ser imunizado) para uma seringa de vidro com luer-lok. </li><li> Elaborar um volume de adjuvante completo de Freund H37Ra (0.1WT%) (CFA, Difco Laboratories) igual à solução de antigénio para outra seringa de vidro equipado com luer-lok. </li><li> Ligar as duas seringas de vidro com uma torneira de três vias. Misture a solução MBP com o CFA, empurrando os êmbolos para trás e para frente. Manter o movimento até que uma emulsão é formada. </li><li> Para testar se uma emulsão é formada, empurrar toda a mistura em uma seringa. Desconecte a seringa vazia, puxe tele êmbolo para trás um pouco e descarregar uma gota da emulsão residual em um copo de água limpa à temperatura ambiente. Se a queda de emulsão permanece intacta sobre a superfície da água, uma emulsão é formada. Se a queda de emulsão dispersa, reconectar as seringas e continuar o movimento de mistura. </li><li> Usar uma seringa de plástico de 1 ml para o processo de imunização para assegurar a entrega de uma dose precisa de antigénio. Para transferir a emulsão antigénio para a seringa de plástico, puxar para fora o êmbolo e inserir a seringa vazia de plástico para dentro da abertura de torneira de três vias onde a seringa de vidro anterior foi desligado como em 1,4. </li><li> Encher a seringa de plástico para o aro, empurrando o êmbolo da seringa de vidro. Inserir o êmbolo da seringa de plástico para trás e para empurrar para trás emulsão excesso até alcançar a 1,2 mL marca na seringa de plástico. Essa manobra garante que nenhuma bolha de ar é aprisionado no interior da seringa de plástico. </li><li> Remova a seringa de plástico do torneira de três vias. Attach uma agulha calibre 26 # para a seringa de plástico. Empurrar o êmbolo para a marca de 1 mL de modo a que a emulsão agora enche o volume vazio da agulha. </li></ol> 2. A imunização de camundongos doadores Nota: camundongos fêmeas C57BL / 6 são normalmente injetados com antígeno emulsão em quatro locais nos flancos, seguindo os métodos originalmente concebidos pelo grupo McFarlin de 3 no National Institutes of Health. Para um investigador experiente, uma pessoa pode realizar toda a tarefa. Para os iniciantes, a ajuda pode ser solicitada de modo que uma pessoa detém o mouse ea outra pessoa faz a injeção. Alternativamente, o rato pode ser anestesiados para a injecção. <ol><li> Segure o mouse com firmeza pela pele do pescoço e segurar a cauda entre os dedos ª 4 ª e 5 de tal forma que o tórax eo abdômen são facilmente acessíveis. </li><li> Coloque a agulha da seringa 1 mL de plástico a um sítio no tórax ligeiramente acima da axila direita (do mousar) e injectar 0,05 mL da emulsão antigénio por via subcutânea. Uma protuberância pouco do CFA esbranquiçado pode ser visto através da pele pálido. Repita a mesma para o local no tórax ligeiramente acima da axila esquerda. </li><li> Solte o rabo e segure o pé direito (do mouse), transformá-lo e mantê-lo entre os dias 4 e 5 dedos ª. Localizar o local imediatamente abaixo da nervura caso no flanco direito e injectar 0,05 mL da emulsão antigénio. </li><li> Solte o pé direito, vire o mouse para o outro lado e segure o pé esquerdo (do mouse) entre o 4 º e 5 º dedos. Localizar o local imediatamente abaixo da nervura caso no flanco esquerdo e injectar 0,05 mL da emulsão antigénio. </li><li> Alterar a uma agulha de fresco após a injecção de 10 ratinhos, ou se a agulha se torna embotada. </li></ol> 3. Isolamento de células dos nódulos linfáticos para cultura de tecido de 7 a 10 dias após a imunização <ol><li> Sete a 10 dias após a imunização, sacrificar os ratinhose remover os linfonodos de drenagem. O método preferido de eutanásia é por inalação de CO 2. Após o sacrifício, coloque o mouse sobre as suas costas em uma placa de dissecção com os membros esticados e fixados à placa com os pinos. Os ratinhos são humedecidos com uma pulverização de etanol a 70%. </li><li> Cortar uma fenda na pele longitudinalmente no meio a partir da extremidade inferior do abdómen até ao queixo com tesouras e pinças esterilizadas. </li><li> Cortar o abdómen da pele a partir da área da virilha para baixo para cada perna. Descasque e fechar a pele, expondo os linfonodos inguinais. </li><li> Corte a pele junto a membros anteriores (esquerda e direita) para que a pele pode ser puxada para trás e fixado para baixo para expor os linfonodos axilares perto das axilas. </li><li> Com dois pares de pinças que trabalham em conjunto, afastar os tecidos conjuntivos e cobrindo em torno dos linfonodos inguinais. Quando os tecidos conjuntivos são limpas, colocar um par de pinças sob o nó de linfa e puxar para fora do corpo. Colocar onódulos linfáticos em uma placa de Petri 35 milímetros cheio com PBS estéril. </li><li> Afaste os tecidos conectivos que cobrem os dois gânglios axilares linfáticos usando dois pares de fórceps. Isolar os nódulos linfáticos e colocá-los na placa de Petri. Tenha muito cuidado para não quebrar os vasos sanguíneos que atravessam a área, como o sangramento torna identificar os linfonodos muito difícil. </li><li> Depois de todos os linfonodos são coletados, mova a placa de Petri para uma capa de biossegurança. Ruptura e provocar os gânglios linfáticos distante com os dois pares de pinças, moagem um contra o outro. Alternativamente, os nódulos linfáticos pode ser quebrada usando a extremidade plana do êmbolo de uma seringa de plástico de 3 mL pressionando contra os gânglios linfáticos na parte inferior da placa de Petri. </li><li> Passar o provocou linfa suspensão de células nó através de uma malha de nylon para remover as membranas e detritos. </li><li> Perfaz-se a linfa suspensão de células de nó para 50 mL utilizando PBS estéril. Centrifugar a 1000 rpm durante 10 minutos. Ressuspender o sedimento em meio de cultura. Faça uma c viávelell contar e ajustar a concentração de 4 x 10 6 células / ml. UseRPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitelo, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio MEM, 0,1 mM de MEM não-aminoácidos essenciais, 100 U / mL de penicilina, estreptomicina 100 ug / mL, 10 mM de tampão Hepes e 5 x 10 -5 M 2-ME. Pré-aquecer a cultura antes de ressuspender as células. </li><li> Cultura das células em placas de 24 poços de cultura com 2 ml de volume por poço (concentração celular final de 8 x 10 6 células / poço). Adicionar antigénio a cada poço a uma concentração final de 100 ug / mL. Colocar a placa de cultura num 37 ° C incubadora com 5% de CO 2. Incubar as células durante 5 dias. </li></ol> 4. Coleta de células cultivadas de nó de linfa 5 dias após o início das Culturas <ol><li> Misturar as células em cada poço por pipetagem para cima e para baixo com uma pipeta de Pasteur de vidro ou de uma pipeta de pequeno volume. Colher as células para um tubo de centrífuga de 50 mL. </li><li> Centrifugar as células a 1000 rpm durante 10 minutos. Reanimaçãopend o sedimento de células em um pequeno volume de PBS. </li><li> Contar as células e ajustar a concentração de células viáveis ​​para 2,5 x 10 8 células / ml com PBS estéril. Desenhar as células em uma seringa com uma agulha # 26 gauge. </li><li> Colocar uma lâmpada de calor sobre a gaiola de ratos receptores para ajudar a dilatar a veia da cauda. </li><li> Utilizando um suporte de rato, estender a cauda do rato através da fenda no suporte. Puxar para estender a cauda. Localize a veia. </li><li> Injectar 0,2 mL / rato da suspensão de células, igualando 5 x 10 7 células. </li></ol> 5. Desafio antigênico de ratos receptores 20 dias a transferência de células de Correios e Desenvolvimento de sintomas da doença <ol><li> Ratos receptores desafio que não apresentam sinais da doença com o antígeno. Os procedimentos são o mesmo que a secção 2 em &quot;imunização de ratinhos dadores&quot;. </li><li> Observar o desenvolvimento de doença paralítica 7 a 10 dias após o desafio antigénico. <ol><li> Doença começa com fraqueza na cauda. A doença é classificada como umaquando a cauda flácida torna-se. A doença é classificada como 2 quando o mouse está paralisado em um dos membros posteriores. A doença é classificada 3, quando ambos os membros posteriores estão paralisados ​​e arrasta o mouse ambos os membros posteriores ao rastrear a frente. A doença é grau 4 quando o mouse perde o uso de ambos os membros anteriores, deixando o mouse totalmente imóvel. A doença é classificada 5, quando o mouse está moribunda eo corpo se enrola. A morte é classificada como grau de doença 6 4. </li></ol></li><li> MBP-específico EAE induzida em camundongos C57BL / 6 após este protocolo é monofásica. Os ratos podem se recuperar da doença, mas não sofrem recaídas espontâneas. </li></ol> 6. Os resultados representativos Os ratos que receberam ferrado e in vitro-expandidos doadores células dos nódulos linfáticos não desenvolveram sintomas da doença EAE, reflectindo a sua resistência à indução da doença. No entanto, a doença grave desenvolvido após o desafio antigénico (Tabela I), demonstrando a capacidade do desafio antigénicoem reverter o mecanismo de resistência. Duas características especiais do desafio antigênico observado são as doses de antígeno e cinética de desafio para induzir a doença. Dose muito baixa de antigénio é necessário, como mostrado na Tabela III. Surpreendentemente, os ratinhos que receberam células de dadores um ano antes pode ainda desenvolver uma doença grave quando desafiado com o antigénio (Tabela IV). Estas duas observações sugerem fortemente o envolvimento de &quot;longa duração&quot; células T em manter a resistência EAE. Este protocolo é aplicável a muitos EAE linhagens resistentes 4. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3778/3778fig1.jpg" /> Figura Fluxograma 1. Do projeto experimental para a indução de EAE em reputados linhagens mais resistentes. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> EAE clínica após a transferência adotiva </td><td colspan="3"><strong&gt; EAE Clínica após o desafio antigénico </td></tr><tr><td> Tensão </td><td> Antígeno </td><td> incidência </td><td> Av. grau de doença (Intervalo) </td><td> Av. dia de início (Intervalo) </td><td> Incidência </td><td> Av. grau de doença (Intervalo) </td><td> Av. dia de início (Intervalo) </td></tr><tr><td> SJL </td><td> MBP </td><td> 21/21 </td><td> 4.0 (3-5) </td><td> 8.0 (6-10) </td><td> ND </td><td> ND </td><td> ND </td></tr><tr><td> C57BL / 6 </td><td> MBP </td><td> 0/10 </td><td> - </td><td> - </td><td> 7/7 </td><td> 3.85 (3-5) </td><td> 9.28 (9-10) </td></tr><tr><td> Balb / c </td><td> MBP </td><td> 0/7 </td><td> - </td><td> - </td><td> 5/5 </td><td> 3.2 (3-4) </td><td> 7.0 (7) </td></tr><tr><td> C3H/HeJ </td&gt; <td> MBP </td><td> 0/7 </td><td> - </td><td> - </td><td> 4/4 </td><td> 3.2 (3-4) </td><td> 8.0 (8) </td></tr><tr><td> C57BL / 6 </td><td> MBP 60-80 </td><td> 0/4 </td><td> - </td><td> - </td><td> 4/4 </td><td> 2.75 (2-4) </td><td> 10.2 (9-11) </td></tr></tbody></table> Tabela I. Indução de MBP-mediada EAE em ratinhos C57BL / 6. A transferência adoptiva de EAE preparado e em células in vitro-expandidos dadores não induziu nos C57BL / 6 ratinhos. Antigênica desafio de transferência de célula pós prestados os ratos suscetíveis à indução da doença. Av., Em média. ND, não feito. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> EAE clínica após o desafio antigénico </td></tr><tr><td> Antigen Priming </td><td> Antígeno Desafio </td><td> Incidência </td><td> Av. grau de doença (Intervalo)</td><td> Av. dia de início (Intervalo) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> CFA sozinho </td><td> 0/3 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> OVA-CFA </td><td> 0/3 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> MBP-CFA </td><td> 3/3 </td><td> 4.0 (4.0) </td><td> 7.7 (7-9) </td></tr></tbody></table> Tabela II Especificidade. De desafio antigênico. Ratinhos receptores foram desafiados com o antigénio de escorvamento, bem como outros antigénios irrelevantes. Apenas o antigénio de escorvamento induzida doença grave. OVA: ovalbumina de galinha. Av., Em média. <table border="1"><tbody&gt; <tr><td></td><td></td><td colspan="3"> EAE clínica após o desafio antigénico </td></tr><tr><td> Desafio doses de antígeno (mg / rato) </td><td> Incidência </td><td> Av. grau de doença (Intervalo) </td><td> Av. dia de início (Intervalo) </td></tr><tr><td> 200 </td><td> 4/4 </td><td> 3.75 (3-4) </td><td> 8.25 (7-9) </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 4/4 </td><td> 3.67 (3-4) </td><td> 7.5 (7-8) </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 4/4 </td><td> 3.25 (3-4) </td><td> 8.25 (7-10) </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 4/4 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 8.25 (8-9) </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 4/4 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 8.76 (8-9) </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 4/4 </td><td> 2.5 (2-3) </td><td> 9.75 (9-10) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2/4 </td><td> 1.0 (1.0) </td><td&gt; 16 (14-18) </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0/4 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela III. Doses de antigénios Desafio necessária para a indução da doença. Várias concentrações de MBP utilizados para desafiar ratinhos receptores foram testados. Av., Em média. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> EAE clínica após o desafio antigénico </td></tr><tr><td> Antígeno Desafio </td><td> Dia do Desafio </td><td> Incidência </td><td> Av. Grau de doença (Intervalo) </td><td> Av. Dia de início (Intervalo) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 5 </td><td> 3/4 </td><td> 1.33 (1-2) </td><td> 9.67 (9-10) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 10 </td&gt; <td> 4/4 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 8.25 (7-9) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 15 </td><td> 4/4 </td><td> 3.75 (3-4) </td><td> 7.25 (7-8) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 25 </td><td> 4/4 </td><td> 4.0 (4.0) </td><td> 8.0 (7-9) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 35 </td><td> 4/4 </td><td> 3.5 (3-4) </td><td> 7.5 (7-8) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 60 </td><td> 4/4 </td><td> 3.75 (3-4) </td><td> 9.0 (8-10) </td></tr><tr><td colspan="5"> -------------------------- </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 343 </td><td> 3/3 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 10.33 (10-11) </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 445 </td><td> 3/3 </td><td> 3.0 (3.0) </td><td> 7.0 (7.0) </td></tr></tbody></table> Tabela IV. Cinética de desafio antigênico. Camundongos receptores foram desafiados, em diversos ponto do tempo pós adotarive transferência de células. Av., Em média.

<ol>
	<li>Swanborg, R. H., Sabato, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis.">Experimental allergic encephalomyelitis.</a> Methods in Enzymology. 162, 413-421 (1988).</li><li>Shaw, M. K., Kim, C., Hao, H. W., Chen, F., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+myelin+basic+protein-specific+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+C57BL/6+mice:+Mapping+of+T+cell+epitopes+and+T+cell+Vb+gene+segment+usage.">Induction of myelin basic protein-specific experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice: Mapping of T cell epitopes and T cell Vb gene segment usage.</a> J. Neuroscience Research. 45, 690-699 (1996).</li><li>McCarron, R., McFarlin, D. 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Não há divulgações financeiras.

Estudos de EAE em ratinhos frequentemente utilizar os neuroantigens e proteína básica de mielina (MBP), proteína proteolipídeo (PLP) ou proteína de mielina oligodendrócito (MOG). Estudos anteriores usado principalmente MBP. PLP estimula respostas fortes e consistentes de camundongos SJL. Mais recentemente, é o MOG neuroantigen comum utilizado porque ratinhos B6 são susceptíveis à indução da doença com este antigénio. Muitos dos genes alvo são as estirpes de rato no fundo B6 genética. Curiosamente, ratinh...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Cobaia medulas espinhais </td><td> Rockland Imuno-químicos, Inc. Gilbertsville, PA 19525 <a href="http://www.rockland-inc.com" target="_blank">www.rockland-inc.com</a> </td><td> GP-T065 </td><td> congelada </td></tr><tr><td> Adjuvante de Freund, completo H37Ra </td><td> Disco Laboratories Detroit, MI </td><td> 231131 </td><td></td></tr><tr><td> Multifit seringa interchange capaz </td><td> BD <a href="http://www.bd.com/us" target="_blank">www.bd.com / us</a> </td><td> 512133 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> MediatechInc. Manassas, VA <a href="http://www.cellgro.com" target="_blank">www.cellgro.com</a> </td><td> 10-040-CM </td><td></td></tr><tr><td> OVA </td><td> Sigma-Aldrich <a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a> </td><td> A5503 </td><td></td></tr><tr><td> Ratos </td><td> Jackson Laboratory Bar Harbor, Maine </td><td> Ratinhos B6: 0000664 </td><td></td></tr></tbody></table>

overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (eae) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge

Encefalomielite autoimune experimental (EAE) é uma doença inflamatória do sistema nervoso central (SNC) e tem sido utilizado como um modelo animal para estudo da doença desmielinizante humano, a esclerose múltipla (MS). EAE é caracterizada pela infiltração de células mononucleares patológica no SNC e pela manifestação clínica da doença paralítica. Semelhante à MS, a EAE é também sob controlo genético em que as estirpes de ratinho determinados são susceptíveis à indução da doença, enquanto outros são resistentes. Tipicamente, C57BL / 6 (H-2 b) ratos imunizados com proteína básica de mielina (MBP) não conseguem desenvolver sinais de paralisia. Esta falta de responsividade não é certamente devido a defeitos de processamento do antigénio ou apresentação de antigénio de MBP, como um protocolo experimental descrito aqui tinha sido utilizado para induzir a EAE grave em ratinhos C57BL / 6, bem como outros reputados linhagens mais resistentes. Além disso, os clones de células T a partir de encephalitogenic C57BL / 6 e ratinhos Balb / c reactivo a MBP tinha sido sucessototalmente isolado e propagado. O protocolo experimental envolve o uso de um sistema de transferência adoptiva em que celular MBP-preparado (200 ug / ratinho) C57BL / 6 dadores células dos nódulos linfáticos são isoladas e cultivadas durante cinco dias com o antigénio para expandir o pool de células T específicas MBP. No final do período de cultura, a 50 milhões de células viáveis ​​são transferidos para ingénuos receptores singénicos através da veia da cauda. Ratos receptores assim tratado normalmente não se desenvolvem EAE, reafirmando seu status resistentes, e podem permanecer normais indefinidamente. Dez dias após a transferência de células, ratos receptores são desafiados com adjuvante completo de Freund (CFA)-emulsionado MBP em quatro locais nos flancos. EAE grave começa a desenvolver nestes ratinhos dez a catorze dias após o desafio. Os resultados mostraram que a indução da doença era específica antigénica como desafio com antigénios irrelevantes não induziu sinais clínicos da doença. Significativamente, uma titulação da dose de antigénio utilizado paradesafiar os ratos receptores mostraram que poderia ser tão baixa como 5 ug / rato. Além disso, um estudo cinético da temporização de desafio antigénico mostrou que desafio para induzir a doença foi eficaz tão cedo quanto 5 desafio antigénico dias pós e enquanto sobre 445 desafio antigénico dias pós. Estes dados apontam fortemente para o envolvimento de uma &quot;longa vida&quot; população de células T em manter indiferença. O envolvimento de células T reguladoras (Tregs) neste sistema não está definido.

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Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Linhagens determinados são capazes de resistir a indução de encefalomielite autoimune experimental (EAE) com proteína básica de mielina. Descrito aqui é um simples protocolo de imunização que reverte a apatia e induz a doença paralítica em vários típicos EAE manchas resistentes do mouse.

Superando indiferença em Encefalomielite autoimune experimental (EAE) linhagens mais resistentes por transferência adotiva e desafio antigênico

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

20.2K visualizações.  St. John-Providence Health System. Linhagens determinados são capazes de resistir a indução de encefalomielite autoimune experimental (EAE) com proteína básica de mielina. Descrito aqui é um simples protocolo de imunização que reverte a apatia e induz a doença paralítica em vários típicos EAE manchas resistentes do mouse.

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Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

Metástase experimental e CTL Adoptive Transferência Modelo rato Imunoterapia

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Imunologia e Infecção

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While the exact etiology of the disease is yet unclear, autoreactive T lymphocytes are thought to play a central role in its pathophysiology. MS therapy is only partially effective so far and research efforts continue to expand our knowledge on the pathophysiology of the disease and to develop novel treatment strategies. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model for MS sharing many clinical and pathophysiological features. There is a broad diversity of EAE models which reflect different clinical, immunological and histological aspects of human MS. Actively-induced EAE in mice is the easiest inducible model with robust and replicable results. It is especially suited for investigating the effects of drugs or of particular genes by using transgenic mice challenged by autoimmune neuroinflammation. Therefore, mice are immunized with CNS homogenates or peptides of myelin proteins. Due to the low immunogenic potential of these peptides, strong adjuvants are used. EAE susceptibility and phenotype depends on the chosen antigen and rodent strain. C57BL/6 mice are the commonly used strain for transgenic mouse construction and respond among others to myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG). The immunogenic epitope MOG35-55 is suspended in complete Freund's adjuvant (CFA) prior to immunization and pertussis toxin is applied on the day of immunization and two days later. Mice develop a "classic" self-limited monophasic EAE with ascending flaccid paralysis within 9-14 days after immunization. Mice are evaluated daily using a clinical scoring system for 25-50 days. Special considerations for care taking of animals with EAE as well as potential applications and limitations of this model are discussed.

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an established animal model of multiple sclerosis. C57BL/6 mice are immunized with myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) peptide 35-55 (MOG35-55), resulting in an ascending flaccid paralysis caused by autoreactive immune cells in the central nervous system. Protocols for disease induction and monitoring will be discussed.

Mielina Oligodendrocyte glicoproteína (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induzida Encefalomielite Auto-imune Experimental (EAE) em murganhos C57BL / 6

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) resulting in cognitive and motor impairment. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a useful animal model of MS, because it is also characterized by lesion formation in the CNS, motor impairment and is also driven by autoimmune and inflammatory reactions. One of the EAE models is induced with a peptide derived from the myelin oligodendrocyte protein (MOG)35-55 in mice. The EAE mice develop a progressive disease course. This course is divided into three phases: the preclinical phase (day 0 - 9), the disease onset (day 10 - 11) and the acute phase (day 12 - 14). MS and EAE are induced by autoreactive T cells that infiltrate the CNS. These T cells secrete chemokines and cytokines which lead to the recruitment of further immune cells. Therefore, the immune cell distribution in the spinal cord during the three disease phases was investigated. To highlight the time point of the disease at which the activation/proliferation/accumulation of T cells, B cells and monocytes starts, the immune cell distribution in lymph nodes, spleen and blood was also assessed. Furthermore, the levels of several cytokines (IL-1&#946;, IL-6, IL-23, TNF&#945;, IFN&#947;) in the three disease phases were determined, to gain insight into the inflammatory processes of the disease. In conclusion, the data provide an overview of the functional profile of immune cells during EAE pathology.

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Produção simples e eficiente e Purificação de rato Mielina Oligodendrocyte glicoproteína de encefalomielite autoimune experimental Estudos

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with embedded pericytes, and the glia limitans composed by the parenchymal basement membrane and astrocytic end-feed embracing the abluminal aspect of central nervous system (CNS) microvessels. In addition to maintaining CNS homeostasis the NVU controls immune cell trafficking into the CNS. During immunosurveillance of the CNS low numbers of activated lymphocytes can cross the endothelial barrier without causing BBB dysfunction or clinical disease. In contrast, during neuroinflammation such as in multiple sclerosis or its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) a large number of immune cells can cross the BBB and subsequently the glia limitans eventually reaching the CNS parenchyma leading to clinical disease. 
Immune cell migration into the CNS parenchyma is thus a two-step process that involves a sequential migration across the endothelial and glial barrier of the NVU employing distinct molecular mechanisms. If following their passage across the endothelial barrier, T cells encounter their cognate antigen on perivascular antigen-presenting cells their local reactivation will initiate subsequent mechanisms leading to the focal activation of gelatinases, which will enable the T cells to cross the glial barrier and enter the CNS parenchyma. Thus, assessing both, BBB permeability and MMP activity in spatial correlation to immune cell accumulation in the CNS during EAE allows to specify loss of integrity of the endothelial and glial barriers of the NVU. 
We here show how to induce EAE in C57BL/6 mice by active immunization and how to subsequently analyze BBB permeability in vivo using a combination of exogenous fluorescent tracers. We further show, how to visualize and localize gelatinase activity in EAE brains by in situ zymogaphy coupled to immunofluorescent stainings of BBB basement membranes and CD45+ invading immune cells.

Here, we present protocols to investigate impairment of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. We specifically address how to determine blood-brain barrier permeability and gelatinase activity involved in leukocyte migration across the glia limitans.&#160;

Visualizando o comprometimento das barreiras endoteliais e Glial da unidade Neurovascular durante encefalomielite auto-imune Experimental In Vivo

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T (iNKT) cells. Patients with active RA present fewer iNKT cells, defective cell function, and excessive polarization of Th1. In this study, an RA animal model was established using a mixture of hGPI325-339 and hGPI469-483 peptides. The iNKT cells were obtained by in vivo induction and in vitro purification, followed by infusion into RA mice for adoptive immunotherapy. The in vivo imaging system (IVIS) tracking revealed that iNKT cells were mainly distributed in the spleen and liver. On day 12 after cell therapy, the disease progression slowed down significantly, the clinical symptoms were alleviated, the abundance of iNKT cells in the thymus increased, the proportion of iNKT1 in the thymus decreased, and the levels of TNF-&#945;, IFN-&#947;, and IL-6 in the serum decreased. Adoptive immunotherapy of iNKT cells restored the balance of immune cells and corrected the excessive inflammation of the body.

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

This protocol uses G6PI mixed peptides to construct rheumatoid arthritis models that are closer to that of human rheumatoid arthritis in CD4+ T cells and cytokines. High purity invariant natural killer T cells (mainly iNKT2) with specific phenotypes and functions were obtained by in vivo induction and in vitro purification for adoptive immunotherapy.

Imunoterapia adotiva de células iNKT em Isomerase Isomerase Induzida de Glicose-6-Fosfato (G6PI)-Induzido RaMice

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible genetic background. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a typical disease model of MS widely used for investigating the pathogenesis in which T lymphocytes specific for myelin antigens initiate an inflammatory reaction in CNS. It is very important to assess how lymphocytes in the CNS regulate the development of disease. However, the approach for measuring the quantity and quality of infiltrated lymphocytes in the CNS is very limited due to the difficulties in isolating and detecting infiltrated lymphocytes from the brain. This manuscript presents a protocol for that is useful for the isolation, identification, and characterization of infiltrated lymphocytes from the CNS and will be helpful for our understanding of how lymphocytes are involved in the development of the CNS autoimmune disease.

This manuscript presents a protocol to induce active experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice. A method for the isolation and characterization of the infiltrated lymphocytes in the central nervous system (CNS) is also presented to show how lymphocytes are involved in the development of CNS autoimmune disease.

Análise Citométrica de Fluxo de Infiltração linfócito no Sistema Nervoso Central durante Encefalomielite Autoimune Experimental

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Experimental Autoimmune Uveitis: An Intraocular Inflammatory Mouse Model

Experimental Autoimmune Uveitis (EAU) is driven by immune cells responding to self-antigens. Many features of this non-infectious, intraocular inflammatory disease model recapitulate the clinical phenotype of posterior uveitis affecting humans. EAU has been used reliably to study the efficacy of novel inflammatory therapeutics, their mode of action and to further investigate the mechanisms that underpin disease progression of intraocular disorders. Here, we provide a detailed protocol on EAU induction in the C57BL/6J mouse - the most widely used model organism with susceptibility to this disease. Clinical assessment of disease severity and progression will be demonstrated using fundoscopy, histological examination and fluorescein angiography. The induction procedure involves subcutaneous&#160;injection of an emulsion containing a peptide (IRBP1-20) from the ocular protein interphotoreceptor retinoid binding protein (also known as retinol binding protein 3), Complete Freund&#39;s Adjuvant (CFA) and supplemented with killed Mycobacterium tuberculosis. Injection of this viscous emulsion on the back of the neck is followed by a single intraperitoneal injection of Bordetella pertussis toxin. At the onset of symptoms (day 12-14) and under general anesthesia, fundoscopic images are taken to assess disease progression through clinical examination. These data can be directly compared with those at later timepoints and peak disease (day 20-22) with differences analyzed. At the same time, this protocol allows the investigator to assess potential differences in vessel permeability and damage using fluorescein angiography. EAU can be induced in other mouse strains - both wildtype or genetically modified - and combined with novel therapies offering flexibility for studying drug efficacy and/or disease mechanisms.

In this report we present a protocol that allows the investigator to generate a mouse model of intraocular uveitis. More commonly referred to as experimental autoimmune uveitis (EAU), this established model captures many aspects of human disease. Herein, we will describe how to induce and monitor disease progression using several readouts.

Uveíte Autoimune Experimental: Um Modelo de Rato Inflamatório Intraocular

Experimental Autoimmune Uveitis (EAU) is driven by immune cells responding to self-antigens. Many features of this non-infectious, intraocular ...

Aumento da imunogenicidade por Mycobacterium paratuberculosis na encefalomielite autoimune

Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) requires immunization by a MOG peptide emulsified in complete Freund&#39;s adjuvant (CFA) containing inactivated Mycobacterium tuberculosis. The antigenic components of the mycobacterium activate dendritic cells to stimulate T-cells to produce cytokines that promote the Th1 response via toll-like receptors. Therefore, the amount and species of mycobacteria present during the antigenic challenge are directly related to the development of EAE. This methods paper presents an alternative protocol to induce EAE in C57BL/6 mice using a modified incomplete Freund&#39;s adjuvant containing the heat-killed Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis strain K-10.
M. paratuberculosis, a member of the Mycobacterium avium complex, is the causative agent of Johne&#39;s disease in ruminants and has been identified as a risk factor for several human T-cell-mediated disorders, including multiple sclerosis. Overall, mice immunized with Mycobacterium paratuberculosis showed earlier onset and greater disease severity than mice immunized with CFA containing the strain of M. tuberculosis H37Ra at the same doses of 4 mg/mL. The antigenic determinants of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP)&#160;strain K-10 were able to induce a strong Th1 cellular response during the effector phase, characterized by significantly higher numbers of T-lymphocytes (CD4+ CD27+), dendritic cells (CD11c+ I-A/I-E+), and monocytes (CD11b+ CD115+) in the spleen compared to mice immunized with CFA. Furthermore, the proliferative T-cell response to the MOG peptide appeared to be highest in M. paratuberculosis-immunized mice. The use of an encephalitogen (e.g., MOG35-55) emulsified in an adjuvant containing M. paratuberculosis in the formulation may be an alternative and validated method to activate dendritic cells for priming myelin epitope-specific CD4+ T-cells during the induction phase of EAE.

Autor em destaque: Atividade adjuvante de Mycobacterium paratuberculosis no aumento da imunogenicidade de autoantígenos durante a encefalomielite autoimune experimental  

Here, we present an alternative protocol to actively induce experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice, using the immunogenic epitope myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)35-55 suspended in incomplete Freund's adjuvant containing the heat-killed Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis.

Atividade Adjuvante de Mycobacterium paratuberculosis no Aumento da Imunogenicidade de Autoantígenos Durante Encefalomielite Autoimune Experimental

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) requires immunization by a MOG peptide emulsified in ...