Este trabalho foi financiado pela American Diabetes Association (ADA), Grant JF1-10-14 (MDiF). Gostaríamos de agradecer o pessoal do Laboratório de Recursos Animais em WSU. Os autores agradecem a assistência com a análise estatística dos dados de Neil Paton, Ph.D.

TNTs de ratinhos e ratos são determinados usando o incrementais placa quente analgesia metros [iHPAM, Inc. IITC Life Science (Woodland Hills, CA)]. O equipamento consiste em vários componentes: uma placa de alumínio (10 x 20 cm) com o sistema de aquecimento por baixo e uma câmara de observação Plexiglas acima; uma unidade de calor controlar, o software de aquisição de dados (IITC Série Parte # suave 8), um PC (pessoal computador) e um pedal de partida remota, parar ou reiniciar o controle da unidade. O sistema de aquecimento também permite iniciar / parar / reposição do processo de aquecimento manualmente através de um teclado, em frente do equipamento. O iHPAM pode ser configurado para taxas de aquecimento diferentes, espera / corte temperaturas. 1. Equipamento Set-up <ol><li> Antes de animais de ensaio, inspeccione visualmente a unidade para corroborar as taxas de aquecimento escolhido (por exemplo, 6 ° C / min), inicial e final temperaturas de espera de corte (por exemplo, 28 ° C e 55 ° C, respectivamente). </li><li> Verifique todas as conexões. Para manter uma cópia eletrônica dos resultados, a unidade deve ser ligada a um computador com Software Series 8. Alternativamente, cópias dos resultados podem ser impressos através da porta serial da unidade. </li><li> Testar o equipamento. Pressione o pedal uma vez para certificar-se da série Software 8 registros dos dados: inicial de espera, as temperaturas de corte final e tempo em segundos necessários para atingir a temperatura de corte. </li><li> Como um teste de controlo adicional, os investigadores envolvidos nas experiências podem necessitar de experimentar o dispositivo em si mesmos. Levantar a mão da placa de metal no momento da percepção da dor (46-48 ° C) não deve nem causar danos à pele nem produzir qualquer desconforto depois. </li><li> Uma vez que a unidade tenha sido definida e os resultados dos passos 1.3 e 1.4 registada eles podem ser comparados. Isto é útil para detectar problemas potenciais que podem invalidar a utilização da unidade. Por exemplo, as discrepâncias entre inicial de espera / final cut-off temperatures ea leitura efectivo da unidade, e / ou diferenças entre as temperaturas indicadas pela unidade ea temperatura da placa real necessário para a retirada mão. </li></ol> 2. Testando animais normais Ou jovens ou adultos ratos Wistar [pós-natal a idade (p) 21-25 dias], ou ratinhos (p21-25) de todo o fundo genético ou do género podem ser usados. Os ratinhos usados ​​nas nossas experiências são da estirpe C57BL/6J. <ol><li> Na noite antes das experiências a ser executada, aclimatar os animais, colocando as suas gaiolas no banco onde o iHPAM é colocado. Duas horas antes de realizar os testes, ligue o iHPAM para familiarizar os animais com o ruído de fundo da unidade. Neste ponto, o iHPAM pode ser ajustado para cima e testados para verificar a função apropriada (ver Passos 1). Alimentos e água são fornecidas ad libitum durante todo o teste, exceto quando o animal está na câmara de observação (ver passo 2.1). Nota: É important não assumir que as condições de laboratório em experimentos comportamentais são controlados por padrão. Especial atenção deve ser dada aos fatores genéticos e ambientais que podem influenciar o resultado dos estudos comportamentais (revisto em 7). </li><li> Suavemente colocar um rato normal / rato na câmara de observação Plexiglass no topo da placa de aquecimento da unidade. Permitir que o animal se adapte à superfície aquecida (definido a 28 ° C) até que o animal mostra um comportamento confortável. Nota: Sob estas condições ratos adultos normais apresentam um comportamento exploratória inicial, ocasionalmente levantando-se para a tampa da câmara de observação, enquanto que sniffing. Depois de alguns minutos, os ratos podem mostrar bouts casuais de preparação e um comportamento relaxado. Às vezes, os ratos se deitou com uma postura relaxada (extensão prone), enquanto casualmente farejando os arredores. Camundongos normais geralmente são mais ativos do que ratos. No entanto, os ratos apresentam um comportamento exploratório relaxado depois de alguns minutos iN a câmara de observação. É excepcionalmente raro observar tanto comportamentos Fuga (por exemplo, pulando, tentando escapar da câmara de observação) ou atitudes defensivas (por exemplo, gritando). Também é importante notar que os ratos podem se comunicar a dor de um rato para outro 8. Por isso, pode ser importante para ratos de teste colocados em gaiolas separadas. </li><li> Colocar espelhos na parte de trás da câmara de observação, para permitir observações em todos os ângulos. Um tripé segurando uma câmera de vídeo digital pode ser de ajuda para determinar o momento exato em que o comportamento (evitar a dor) nocifensive havia ocorrido. </li><li> Uma vez que o animal está confortável no calor câmara de observação até a placa pressionando o pedal. Quando a temperatura da placa aquece a uma taxa de 6 ° C / minuto, os animais normais exibem um comportamento nocifensive envolvendo quer pata traseira-* Geralmente temperaturas fúria 46-48 ° C 3,5,9,10. Assim, o animal é removido forma típica o observcâmara de ation após aproximadamente 3 minutos. Nota: Observando a resposta típica de um nocifensive ou seja rato ou mouse, pata-hind lambendo, agitando e / ou de elevação, é suficiente para encerrar o estímulo térmico. Isto é conseguido, premindo o interruptor de pé. Neste momento, o software grava temperatura da chapa ea placa imediatamente arrefece até que a temperatura de espera (28 ° C) for atingido (~ min 0,5). Este ie temperatura, o que evoca uma qualquer reacção nocifensive é considerado como o limiar de calor nocivo (TNT) do animal (controle) normal. * Por vezes, particularmente em ratinhos, o comportamento nocifensive à temperatura nocivo pode primeiro ser observado em uma ou ambas as patas dianteiras (por exemplo, lamber, enquanto sentado), poucos segundos antes hind-patas. No entanto, patas dianteiras-lamber é um componente normal do comportamento de limpeza. Assim, apenas traseiras-pata reacções são avaliados. Em ocasiões camundongos pode limpar suas patas traseiros também. No entanto, a preparação normal de fazer not duram mais que alguns segundos, não envolve intensivo lambendo e geralmente termina após a limpeza das suas garras. </li><li> Remover suavemente o animal a partir da placa e colocá-lo na sua gaiola respectiva. A medição do limiar de calor é então repetido para o controle de outras (normal) de animais. Nota: TNTs pode ser determinada de um único animal com intervalos de 1-2 minutos, sem retirar o animal a partir da câmara de observação. Determinações da TNT em ratos ou camundongos pode ser repetido várias vezes durante vários dias. Isto é particularmente útil para determinar a TNT média de um animal individual, bem como a sua variação com a idade. </li><li> A TNT de animais de controlo é expressa como a média de três ou mais limiares ± SEM. </li><li> A análise estatística dos dados obtidos é realizada para comparar diferentes grupos de tratamento de camundongos ou ratos. Procedimentos paramétricos, incluindo análise de variância pode ser adequadamente utilizado, onde os dados são normalmente distribuídos e onde os grupos de tratamento são homoskedastic, quando estas condições forem satisfeitas as seguintes abordagens podem ser aplicadas. Análise de variância, seguida pelo teste de Newman-Keuls para detectar diferenças em múltiplas medições ie, repetidos TNTs individuais com / sem tratamento ou em pontos de tempo diferentes (por exemplo, os dados da Figura 3). O t de Student-teste pode ser utilizado para comparar dois grupos de dados ou seja, TNTs antes x após o tratamento de droga; o teste t não emparelhado pode ser utilizado para determinar diferenças de mudanças de TNT em droga-tratados vs animais tratados com veículo (por exemplo , os dados da Figura 4). </li></ol> 3. Testando animais diabéticos A estreptozotocina rato diabético (STZ)-induzido é o modelo animal mais frequentemente utilizada para estudar os mecanismos de PDN e para avaliar drogas analgésicas e terapias 11,12. Ratos tornados diabéticos por uma dose única intraperitoneal de STZ (60 mg / kg) pode be testados para a hiperalgesia térmica durante a semana estr 3 após o início da diabetes 11. É importante notar que nem todos os ratos diabéticos desenvolver PDN. No entanto, os animais que se desenvolvem hiperalgesia (~ 50%) podem ser facilmente identificados. Com efeito, os seus TNTs são inferiores * normal. * Para determinar TNTs de STZ-diabéticos ratos, uma temperatura da placa de partida de 15 ° C em vez de 28 ° C é usada. A razão para estas alterações é que a maioria dos animais diabéticos com PDN se espera que sejam 2,11 hiperalgésica. Por conseguinte, eles terão inferior normais limiares de calor nocivos (por exemplo, &lt;45 ° C). <ol><li> Um rato diabético é colocado na câmara de observação no topo do aparelho de ensaio. O animal é permitido se adapte à superfície da placa até que o animal mostra um comportamento confortável. Nota: Tipicamente, um rato diabético não mostra muito do comportamento normal. Os ratos diabéticos são geralmente hipoativo, letárgico, muitas vezes mostrandomovimentos restritos e grooming lento. É raro observar classificação para a tampa da câmara de observação. Após alguns minutos, os ratos diabéticos podem ficar calmamente em um canto da câmara com ocasional sniffing dos arredores. </li><li> Uma vez que o animal diabético é confortável na câmara de observação, a placa é aquecida até como no Passo 2,3 a rato diabético podem apresentar um comportamento nocifensive envolvendo quer traseira / tona-pata. Isto acontece geralmente a temperaturas não-tóxicas de placa (por exemplo, &lt;45 ° C), ou depois de não mais de 5 minutos na câmara com o aumento da temperatura de 6 ° C / min. Nota: A resposta nocifensive de um rato diabético jovem adulto não difere da de um rato normal. No entanto, a temperatura mais baixa evocar tal comportamento é significativamente reduzido. </li><li> Consulte a Etapa 2,4 </li><li> A média de mais de três limiares no dia da experiência expressa como ° C ± SEM é considerado o limite de calor nocivo do diabetic animais. Nota: Um paradigma semelhante ao explicado para ratos normais ou diabéticos pode ser seguido para determinar o efeito anti-nocifensive térmica de analgésicos em limiares de calor. </li></ol> 4. Teste de Analgesia As propriedades anti-nociceptivos de drogas (por exemplo, analgésicos), bem como a determinação dos parâmetros de farmacológicas tais como a dose mínima eficaz pode ser facilmente obtido usando os passos explicados acima. Prevê-se que doses apropriadas de um analgésico administrado a ratos / camundongos iria aumentar significativamente seus TNTs. Isto é particularmente sensível em animais com hiperalgesia térmica 3. No entanto, para evitar distorções na interpretação dos resultados, os investigadores envolvidos na observação comportamental de um grupo de animais não deve saber ou estar ciente se os animais foram tratados ou não. Além disso, a droga a ser injectado pelo observador pode ser preparado por outro investigador e rotuladosA, B, C, etc Dosagem é fornecido em uma impressão, que enumera as doses individuais por animal identificado. Dependendo da droga a ser testada, diferentes doses de um analgésico potencial podem ser administrados a animais normais ou diabéticos 5-15 min antes de testes comportamentais. Controlos adequados devem ser incluídos (isto é, da mesma idade animais injectados apenas com veículo e / ou ratos diabéticos sem PDN) e testados utilizando condições idênticas (por exemplo, à mesma temperatura de partida da placa). Os efeitos crónicos de drogas podem ser testados. 5. Os resultados representativos A temperatura mais baixa placa evocar reacções nocifensive em qualquer pata posterior de jovens adultos normais não tratados ratos ou ratinhos foram determinados passos seguintes 2-1 a 2-6. Como mostrado na Figura 1, a TNT de ratos adultos jovens normais e ratinhos eram de 47,2 ± 0,2 ° C e 47,5 ± 0,5 ° C, respectivamente. Temos obsevariação não significativa rved diária de TNTs individuais (Figura 2A) nem alterações significativas de TNTs entre indivíduos da mesma idade (Figura 2B). Diferenças devidas a TNT género não foram observados (não mostrado). TNTs de adultos jovens STZ-diabéticos ratos foram determinados de uma forma similar como para ratos normais (Passos 3.1 a 3.3). No entanto, a temperatura da placa de partida foi ajustado para 15 ° C em vez de 28 ° C. O comportamento nocifensive de STZ-diabéticos ratos foi avaliada pelo menos três vezes em um indivíduo e de uma forma diária de partida 11 dias após a injecção STZ. Como mostrado na Figura 3, uma queda significativa (p &lt;0,01) no TNT de STZ-diabéticos ratos torna-se evidente duas semanas após a injecção STZ. A média de TNT STZ-diabéticos ratos foi 45,6 ± 0,1 ° C (n = 16, os valores obtidos a partir de 14-23 dias). Os ratos diabéticos que exibem TNT significativamente menor do que a Normal foram considerados como tendo PDN. Estes ratos foram usados ​​para testar os efeitos agudos anti-nociceptivos propriedades de um analgésico (composto A). TNTs foram determinados em ratos normais e diabéticos injectados quer com uma única dose do composto ou veículo sozinho cinco minutos antes do ensaio. Como mostrado na Figura 4, uma dose intra-peritoneal única do composto aumentou significativamente TNTs de ratos diabéticos quando comparado com os ratos tratados com veículo isolado (45,6 ° C vs 47,6 ° C, respectivamente). O efeito anti-nocifensive do composto A foi também observada em ratos normais, embora significativa (p &lt;0,01), foi menos pronunciado (47,4 ° C vs 48,0 ° C, respectivamente). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3785/3785fig1.jpg" /> Figura 1. Determinação da TNTs de ratos adultos jovens normais ou ratinhos: Os TNTs de ratos adultos jovens (p21-24) ou ratinhos (p20-21) foram testados no iHPAM seguindo as etapas descritas above. Um total de 12 ratos e 25 ratinhos foram testados. As medições foram realizadas durante vários dias e os resultados foram reunidas. Os resultados são expressos como média ± EPM. Os valores mínimo e máximo de TNT registada nestes ratos foram 46,2 ° C e 48,6 ° C respectivamente. No caso de ratinhos, os valores máximo e mínimo de TNT registados foram 48,8 ° C e 44,9 ° C, respectivamente. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3785/3785fig2.jpg" /> Figura 2. Idade-dependência de TNTs em ratos e ratinhos: Um Plotada) são os TNTs de quatro ratos normais (n = 4) de 21 dias de idade determinado pelo menos três vezes ao dia durante 5 dias B) TNTs de ratinhos littermates determinada de uma vez em indicado. idades. Os números no topo de cada ponto de determinação representa o número de ninhada utilizados. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3785/3785fig3.jpg" /> Figura 3. Os ratos diabéticos ficam 3 hiperalgesia nósEKS após o início da diabetes: TNTs de seis (n = 6) com a mesma idade jovem adulto STZ-diabéticos ratos foram determinados a cada dia de partida de 11 dias pós-indução de diabetes. São mostrados médias diárias TNT (média ± SEM). TNTs diabéticos fixados entre 11-13 dias após a injecção-STZ estavam dentro da faixa normal (linha vermelha). Duas semanas após a injeção de STZ TNTs diminuiu significativamente para 45,1 ± 0,4 ° C, (p &lt;0,05). <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3785/3785fig4.jpg" /> Figura 4. Agudas anti-nocifensive efeitos do composto B em ratos diabéticos STZ-. Jovens adultos ratos normais (azul grupo n = 12) e idade foram ratos STZ-diabéticos hiperalgésica (verde grupo n = 6) foram testados no iHPAM após a injecção intraperitoneal de veículo (barras escuras) ou composto A. (barras claras) A média ± SEM TNT para cada tratamento (controlo de veículo ou o composto A-tratado) são mostrados. Os asteriscos indicam diferenças estatísticas(P &lt;0,05).

<ol>
	<li>Baron, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+neuropathic+pain:+From+mechanisms+to+symptoms.">Peripheral neuropathic pain: From mechanisms to symptoms.</a> Clin. J. Pain. 16, S12-S20 (2000).</li><li>Calcutt, N. A., Jorge, M. C., Yaksh, T. L., Chaplan, S. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+alterations+in+thermal+nociceptive+threshold+and+the+distribution+of+immunoreactive+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+p+after+neonatal+administration+of+capsaicin+in+the+rat.">Developmental alterations in thermal nociceptive threshold and the distribution of immunoreactive calcitonin gene-related peptide and substance p after neonatal administration of capsaicin in the rat.</a> Neurosci. Lett. 97, 57-62 (1989).</li></ol>

Decidimos não divulgar a identidade do analgésico utilizado nestes experimentos. Parte dos resultados mostrados aqui foi apresentado nos 71 ª Sessões Científicas da American Diabetes Association (San Diego CA) e da 47 ª Reunião Anual da Associação Europeia para o Estudo da Diabetes (Lisboa, Portugal).

Da mesma forma que no teste da placa quente clássico para quantificar hiperalgesia térmica 4,13, o teste de nocicepção descrito aqui permite uma forma rápida e confiável para quantificar o comportamento nocifensive em ratos e camundongos. No entanto, ao contrário do teste clássico, o método de placa quente incremental é não-invasiva e praticamente livre de estresse. Embora alguns conter é necessário para realizar o teste (ie, o animal deve estar na câmara de observação), ratazanas ou ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Incremental Hot-Plate Analgesia Medidor </td><td> IITC Inc. Life Science </td><td> Part # PE34 </td></tr><tr><td> Série macio 8 </td><td> IITC Inc. Life Science </td><td> Part # Series8 </td></tr><tr><td> Estreptozotocina </td><td> Calbiochem </td><td> 572201 </td></tr></tbody></table>

rapid determination of the thermal nociceptive threshold in diabetic rats

Neuropatia diabética dolorosa (PDN) é caracterizada por hiperalgesia isto é, aumento da sensibilidade à estímulo nocivo, e isto é alodinia, hipersensibilidade a estímulos inócuos normalmente 1. Hiperalgesia e alodinia têm sido estudados em muitos modelos de roedores diferentes de diabetes mellitus 2. No entanto, como afirma Bölcskei et al, a determinação de &quot;dor&quot; em modelos animais é um desafio devido à sua natureza subjetiva 3. Além disso, os métodos tradicionais utilizados para determinar as respostas comportamentais a estímulos térmicos nocivos geralmente não possuem reprodutibilidade e 3 sensibilidade farmacológica. Por exemplo, usando o método de placa quente de Ankier 4, recuar, retirada e / ou lamber de qualquer posterior e / ou fore-patas é quantificada como latências do reflexo na elevada e constante estímulos térmicos (52-55 ° C). No entanto, os animais que são de hiperalgesia ao estímulo térmico não reproduzível mostrar diferenças em relatências Flex usando essas temperaturas supra-limiar de 3,5. Como o método descrito recentemente de Bölcskei et al. 6, os processos descritos aqui permite a determinação rápida, sensível e reprodutível de térmicas limiares nociceptivos (TNTs) em ratinhos e ratos. O método utiliza a aumentar lentamente estímulo térmico aplicado principalmente para a pele de rato / rato superfície plantar. O método é particularmente sensível a estudar anti-nocicepção durante estados de hiperalgesia tais como PDN. Os procedimentos descritos abaixo são baseados em os publicados em detalhe por Almasi et al 5 e et al Bölcskei 3. Os procedimentos descritos aqui foram aprovados o Animal Care Laboratório e do Comitê de Uso (LACUC), Wright State University.

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Rapid Determination of the Thermal Nociceptive Threshold in Diabetic Rats

Aqui, nós descrevemos um procedimento rápido, simples e confiável para determinar a menor temperatura em que ratos ou camundongos mostram comportamento nocifensive,<em&gt; Ou seja,</em&gt; O<em&gt; Limiar térmico nociceptivo</em&gt; (TNT). Este método aplica-se um estímulo aumentando lentamente térmica permitindo estimativa precisa e reprodutível de TNTs com mínima, se alguma, o stress para os animais.

Determinação rápida do limiar térmico nociceptivo em ratos diabéticos

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity ...

rapid-determination-thermal-nociceptive-threshold-diabetic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

27.4K visualizações.  Wright State University. Aqui, nós descrevemos um procedimento rápido, simples e confiável para determinar a menor temperatura em que ratos ou camundongos mostram comportamento nocifensive, Ou seja, O Limiar térmico nociceptivo (TNT). Este método aplica-se um estímulo aumentando lentamente térmica permitindo estimativa precisa e reprodutível de TNTs com mínima, se alguma, o stress para os animais.

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A General Method for Evaluating Incubation of Sucrose Craving in Rats

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and relapse to food taking 1. Food craving conceptualized in this way is akin to drug craving in response to drug-paired cues. A rich literature has been developed around understanding the behavioral and neurobiological determinants of drug craving; we and others have been focusing recently on translating techniques from basic addiction research to better understand addiction-like behaviors related to food 2-4.
As done in previous studies of drug craving, we examine sucrose craving behavior by utilizing a rat model of relapse. In this model, rats self-administer either drug or food in sessions over several days. In a session, lever responding delivers the reward along with a tone+light stimulus. Craving behavior is then operationally defined as responding in a subsequent session where the reward is not available. Rats will reliably respond for the tone+light stimulus, likely due to its acquired conditioned reinforcing properties 5. This behavior is sometimes referred to as sucrose seeking or cue reactivity. In the present discussion we will use the term "sucrose craving" to subsume both of these constructs.
In the past decade, we have focused on how the length of time following reward self-administration influences reward craving. Interestingly, rats increase responding for the reward-paired cue over the course of several weeks of a period of forced-abstinence. This "incubation of craving" is observed in rats that have self-administered either food or drugs of abuse 4,6. This time-dependent increase in craving we have identified in the animal model may have great potential relevance to human drug and food addiction behaviors.
Here we present a protocol for assessing incubation of sucrose craving in rats. Variants of the procedure will be indicated where craving is assessed as responding for a discrete sucrose-paired cue following extinction of lever pressing within the sucrose self-administration context (Extinction without cues) or as responding for sucrose-paired cues in a general extinction context (Extinction with cues).

Responding for food or drug-paired cues increases over the course of a period of abstinence and this may relate to an increased susceptibility to relapse behaviors. Here we detail a procedure for evaluating this "incubation of craving" in rats that have self-administered sucrose.

Um método geral para a avaliação de Incubação de Craving Sacarose em Ratos

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and ...

Neurociência

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

Métodos locais e globais de Avaliação nocicepção térmica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Assessment of Morphine-induced Hyperalgesia and Analgesic Tolerance in Mice Using Thermal and Mechanical Nociceptive Modalities

Opioid-induced hyperalgesia and tolerance severely impact the clinical efficacy of opiates as pain relievers in animals and humans. The molecular mechanisms underlying both phenomena are not well understood and their elucidation should benefit from the study of animal models and from the design of appropriate experimental protocols. 
We describe here a methodological approach for inducing, recording and quantifying morphine-induced hyperalgesia as well as for evidencing analgesic tolerance, using the tail-immersion and tail pressure tests in wild-type mice. As shown in the video, the protocol is divided into five sequential steps. Handling and habituation phases allow a safe determination of the basal nociceptive response of the animals. Chronic morphine administration induces significant hyperalgesia as shown by an increase in both thermal and mechanical sensitivity, whereas the comparison of analgesia time-courses after acute or repeated morphine treatment clearly indicates the development of tolerance manifested by a decline in analgesic response amplitude. This protocol may be similarly adapted to genetically modified mice in order to evaluate the role of individual genes in the modulation of nociception and morphine analgesia. It also provides a model system to investigate the effectiveness of potential therapeutic agents to improve opiate analgesic efficacy.

We describe a protocol to examine the development of opioid-induced hyperalgesia and tolerance in mice. Based on the measurement of thermal and mechanical nociceptive responses of na&#239;ve and morphine-treated animals, it allows to quantify the increase in pain sensitivity (hyperalgesia) and decrease in analgesia (tolerance) associated with chronic opiate administration.

Avaliação da hiperalgesia induzida por morfina e analgésicos Tolerância em ratos usando térmicas e mecânicas nociceptivos Modalidades

Opioid-induced hyperalgesia and tolerance severely impact the clinical efficacy of opiates as pain relievers in animals and humans. The molecular ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinação da atividade locomotora espontânea em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

Rápido<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação usando sondas Oligonucleotide no cérebro prefixado-paraformaldeído de ratos com síndrome serotoninérgica

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Measurement &amp; Analysis of the Temporal Discrimination Threshold Applied to Cervical Dystonia

The temporal discrimination threshold (TDT) is the shortest time interval at which an observer can discriminate two sequential stimuli as being asynchronous (typically 30-50 ms). It has been shown to be abnormal (prolonged) in neurological disorders, including cervical dystonia, a phenotype of adult onset idiopathic isolated focal dystonia. The TDT is a quantitative measure of the ability to perceive rapid changes in the environment and is considered indicative of the behavior of the visual neurons in the superior colliculus, a key node in covert attentional orienting. This article sets out methods for measuring the TDT (including two hardware options and two modes of stimuli presentation). We also explore two approaches of data analysis and TDT calculation. The application of the assessment of temporal discrimination to the understanding of the pathogenesis of cervical dystonia and adult onset idiopathic isolated focal dystonia is also discussed.

Methods for the measurement and analysis of the temporal discrimination threshold are presented, and its application to the study of the pathogenesis of cervical dystonia are discussed.

Medição e análise do limiar discriminação Temporal aplicado a distonia Cervical

The temporal discrimination threshold (TDT) is the shortest time interval at which an observer can discriminate two sequential stimuli as being ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of oligodendroglia as well as the biology of demyelinating diseases such as multiple sclerosis and Pelizaeus-Merzbacher-like disease (PMLD). Here, we present a simple and efficient selection method for the immunomagnetic isolation of stage three O4+ preoligodendrocytes cells from neonatal mice pups. Since immature OL constitute more than 80% of the rodent-brain white matter at postnatal day 7 (P7) this isolation method not only ensures high cellular yield, but also the specific isolation of OLs already committed to the oligodendroglial lineage, decreasing the possibility of isolating contaminating cells such as astrocytes and other cells from the mouse brain. This method is a modification of the techniques reported previously, and provides oligodendrocyte preparation purity above 80% in about 4 h.

We describe the immunomagnetic isolation of primary mouse oligodendrocytes, which allows the rapid and specific isolation of the cells for in vitro culture.

Isolamento de Fima rápida e específica de oligodendrócitos primário de Mouse

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Establishment of Acute Pontine Infarction in Rats by Electrical Stimulation

Pontine infarction is the most common stroke subtype in the posterior circulation, while there lacks a rodent model mimicking pontine infarction. Provided here is a protocol for successfully establishing a rat model of acute pontine infarction. Rats weighing about 250 g are used, and a probe with an insulated sheath is injected into the pons using a stereotaxic apparatus. A lesion is produced by the electrical stimulation with a single pulse. The Longa score, Berderson score, and beam balance test are used to assess neurological deficits. Additionally, the adhesive-removal somatosensory test is used to determine sensorimotor function, and the limb placement test is used to evaluate proprioception. MRI scans are then used to assess the infarction in vivo, and TTC staining is used to confirm the infarction in vitro. Here, a successful infarction is identified that is located in the anterolateral basis of the rostral pons. In conclusion, a new method is described to establish an acute pontine infarction rat model.

Presented here is a protocol for establishing acute pontine infarction in a rat model via electrical stimulation with a single pulse.

Estabelecimento de Infarto Agudo de Pontina em Ratos por Estimulação Elétrica

Pontine infarction is the most common stroke subtype in the posterior circulation, while there lacks a rodent model mimicking pontine infarction. Provided ...

Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) occlusion of the middle cerebral artery (MCA) using a catheter. This generally accepted technique, however, has some limitations, thereby limiting its extensive use. Stroke induction by this method is often characterized by high variability in the localization and size of the ischemic area, periodical occurrences of hemorrhage, and high death rates. Also, the successful completion of any of the transient or permanent procedures requires expertise and often lasts for about 30 minutes. In this protocol, a laser irradiation technique is presented that can serve as an alternative method for inducing and studying brain injury in rodent models.
When compared to rats in the control and MCAO groups, the brain injury by laser induction showed reduced variability in body temperature, infarct volume, brain edema, intracranial hemorrhage, and mortality. Furthermore, the use of a laser-induced injury caused damage to the brain tissues only in the motor cortex unlike in the MCAO experiments where destruction of both the motor cortex and striatal tissues is observed.
Findings from this investigation suggest that laser irradiation could serve as an alternative and effective technique for inducing brain injury in the motor cortex. The method also shortens the time for completing the procedure and does not require expert handlers.

The protocol presented here shows a technique to create a rodent model of brain injury. The method described here uses laser irradiation and targets motor cortex.

Lesão cerebral induzida por laser no córtex motor de ratos

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) ...

Induction of Diffuse Axonal Brain Injury in Rats Based on Rotational Acceleration

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large percentage of TBI patients requiring hospitalization. DAI involves widespread axonal damage from shaking, rotation or blast injury, leading to rapid axonal stretch injury and secondary axonal changes that are associated with a long-lasting impact on functional recovery. Historically, experimental models of DAI without focal injury have been difficult to design. Here we validate a simple, reproducible and reliable rodent model of DAI that causes widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

This protocol validates a reliable, easy-to-perform and reproducible rodent model of brain diffuse axonal injury (DAI) that induces widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

Indução de lesão cerebral axonal difusa em ratos com base na aceleração rotacional

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large ...