Este trabalho é financiado pelo Programa Jovem Investigador de Pesquisa, do Centro de Pesquisas de Doenças Infecciosas (Zinf) da Universidade de Würzburg. Juan C Garcia-Betancur é uma bolsa de doutoramento da Escola de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (GSLs) da Universidade de Würzburg.

1. Rotulagem B. subtilis e ensaio de formação de biofilme <ol><li> Amplificar por PCR da região promotora do gene de interesse. Nós mostramos como exemplo, a clonagem de P tapa, o promotor dos genes responsáveis ​​pela produção de proteína de matriz Tasa 26. Clone P tapa em pkm008 vetor (criado pelo laboratório Rudner, Harvard Medical School. Boston, EUA) (Fig. 2). </li><li> Linearizar os plasmídeos por digestão enzimática (Enzyme recomendada, Xhol). </li><li> Induzir competência natural em B. subtilis estirpe 168, seguindo o protocolo de um passo anteriormente descrito por Harwood e Cutting 27. </li><li> Adicionar os plasmídeos linearizados para a cultura de células competentes e selecção de resistência à espectinomicina após duas horas de incubação. </li><li> Estirpes obtidas ter sido inserido o construto no locus amyE neutro de B. subtilis por recombinação dupla (Fig. 4). Para criaruma estirpe de duplo rotulado, integrar o repórter para o segundo laca lócus neutro usando o plasmídeo pDR183 apresentamos na figura 3. Inserir este repórter usando a mesma técnica descrita acima para a inserção de repórteres clonado em pKM008. </li><li> Transferir o repórter a partir da estirpe 168 de NCIB3610 que é capaz de formar biofilmes. Utilizar a transdução de fago SPP1 protocolo 28,29. Cresce tensão doador em meio TY (LB +10 mm MgSO4 +10 mM MnSO 4). Misturar 200 ul da cultura com 100 ul de diluição de fago estoque. Adicionar 3 ml de agar mole após 30 min de incubação e permitir halos de fagos de surgir a 37 ° C. </li><li> Recolher o agar mole. Centrifugar-lo e passar o sobrenadante pensou uma seringa de 0,22 filtro. Use este sobrenadante para infectar uma cultura da estirpe receptora crescidas em meio TY. Adicionar 30 ul a 10 ml de cultura diluída 1:10. Incubar durante 30 min e selecção de resistência a antibióticos, após 24 h de incubação. </li><li> Secionar uma colônia e crescer durante a noite em LB a 37 ° C. </li><li> Manchar 3 uL da cultura durante a noite em meio de indução de biofilme-sólido MSgg ágar 1,5% 30. Permitir que as células a crescer durante 72 horas a 30 ° C (Figura 3). Após três dias de crescimento, biofilmes formados na superfície do agar MSgg desenvolvida uma arquitectura de complexo morfológica na superfície do agar. </li></ol> 2. Dispersão de biofilme e fixação das células <ol><li> Remover a forma de biofilme da superfície do agar MSgg usando um palito de dentes ou pinças. A consistência do biofilme deve permitir-lhe a descascar-lo a partir da superfície do agar em uma peça. </li><li> Coloque o biofilme em 3 ml de tampão PBS e dispersar o biofilme por passagem através de uma pipeta repetitivo ou uma agulha. Alternativamente, a dispersão de biofilme pode ser feito usando sonicação suave. Sonicação suave requer 12 pulsos com uma saída de 3 e amplitude de 0,7 segundos. </li><li> Fix amostras análise única célula anterior. Resuspend uL 300 da suspensão de células em 1 ml de solução de paraformaldeído a 4% e incubar à temperatura ambiente durante exactamente sete minutos. Composição da solução de paraformaldeído a 4%: 2 g de paraformaldeído 50 ml de tampão PBS 4 uL 10 N NaOH Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 UM e alíquota </li><li> Lave as células após fixação em tampão PBS três vezes e ressuspender-los em 300 uL de tampão PBS. </li></ol> 3. A microscopia de fluorescência <ol><li> Despeje 200 mL de agarose 0,8% sobre uma lâmina de microscópio e, cuidadosamente, cobri-lo com outro slide. Remover a corrediça superior suavemente após 2 minutos para se obter uma camada de agarose ligado à corrediça do fundo. </li><li> UL local 2 de células fixas sobre a superfície da camada de agarose e cobrir com uma tampa de vidro de microscópio. </li><li> Colocar a amostra no microscópio de fluorescência. Usamos um Microscópio de fluorescência Leica DMI6000B equipado com um CRT6000 Leica iIluminatião sistema. Os filtros são para YFP Ex: BP500/20, Em: BP535/30 e PCP são Ex: BP426/20, Em: 480/40 </li><li> Exponha sua amostra para uma fluorescência de excitação entre 50-200 ms. Definir o período de excitação de acordo com um controlo negativo que não mostra nenhuma fluorescência nas condições seleccionadas para a experiência. </li><li> Referem-se a imagem de fluorescência para a mesma imagem obtida com o campo brilhante. Mesclar as duas imagens em uma imagem. Os resultados obtidos a partir de microscopia de fluxo de fluorescência usando uma única estirpe marcada com abrigando o repórter P tapa-YFP estão representados na figura 6. </li></ol> 4. Quantificação de células individuais por citometria de fluxo <ol><li> Dispersar a amostra de células fixas usando sonicação suave. Sonicar a amostra realizando 2 série de 12 impulsos com uma saída de 5 e amplitude de 0,7 segundos, para dispersar aglomerados em células individuais, sem causar a lise das células. Confirmar a eficiência da dispersão de células por microscopia de luz. </li&gt; <li> , Diluir a amostra 1:100 em tampão de PBS antes da análise de citometria de fluxo. Nós usamos um citômetro de fluxo BD FACS Canto II. Para YFP fluorescência, utilizar uma excitação com laser a 488 nm em conjugação com um filtro 530/30. Para PCP de fluorescência, utilizar a excitação com laser a 405 nm em conjugação com um filtro 408/40. </li><li> Calibrar o citómetro de fluxo máquina com dois controles negativos. Uma amostra de tampão PBS sem células em suspensão devem servir como controlo negativo para o tamanho das partículas detectado pelo citómetro de fluxo. Uma amostra marcada com fluorescência nenhum repórter deve ser servir como controlo negativo para a sensibilidade de fluorescência do citómetro de fluxo. </li><li> Colocar a amostra marcada com o repórter fluorescente no citómetro de fluxo. Para cada amostra, analisar pelo menos 50.000 acontecimentos com uma taxa de fluxo entre 300 e 3000 eventos por segundo. </li><li> Captura de dados usando FACS Diva software (BD Biosciences) e analisá-lo usando FlowJo software 8.5.2. Consulte sinais de fluorescência para o controle que mostrams de fluorescência não. </li><li> Apresentar os dados de monitoramento do sinal de fluorescência de uma única estirpe marcada em um gráfico de dois eixos. Traça-se a sinal de fluorescência detectada no eixo X e do número de células que expressam os diferentes níveis de fluorescência no eixo Y. Os resultados obtidos a partir de análise de citometria de fluxo utilizando uma única estirpe marcada com abrigando o repórter P tapa-YFP estão representados na figura 8. </li><li> Apresentar os dados de monitoramento do sinal de fluorescência de uma estirpe duplo marcado em um gráfico de três eixos. Traça-se a sinal de fluorescência de cada um dos canais monitorados em eixos X e Y (por exemplo, a GFP seria medido no eixo X e PCP no eixo Y). Lote no eixo Z do número de células que expressam cada repórter e apresentá-los como isolinhas de contorno que seria perpendicular ao plano do papel (Fig. 9 e 10). </li></ol> 4. Os resultados representativos Quando B. subtilis cresce em uma placa de biofilm indutora de MSgg médio, a formação de biofilme é observada após três dias de incubação a 30 ° C 30. O biofilme mostra consistência forte e pode ser removida a partir da superfície do agar em uma peça. Além disso, o biofilme mostra uma arquitectura de complexo morfológica que é indicativo das subpopulações de células distintas participantes (Fig. 5). Por exemplo, a produção da matriz extracelular nos resultados de biofilmes na formação de rugas na superfície da colónia. Esta característica pode ser correlacionado com a diferenciação da subpopulação de produtores de matriz 19. Do mesmo modo, o aumento das estruturas aéreas na superfície do biofilme é indicativo da presença de uma subpopulação de células esporulados, uma vez que os esporos localizada na área apical dessas estruturas 30. Exemplos de visualização de diferenciação celular de um único r-rotulados e uma estirpe de duplo rotulado usando microscopia de fluorescência sãoepresented na figura 6 e 7, respectivamente. A estirpe de um único rotulado abriga o repórter fluorescente P tapa-CFP que é expresso na subpopulação de células produtoras de matriz. Esta subpopulação é responsável para produzir e secretar a matriz extracelular que constitui o biofilme (Fig. 6). A cepa duplo marcado abriga o repórter P tapa-PCP 26 eo repórter adicional P srfAA-YFP 31. Este repórter segundo permite controlar a subpopulação de células responsáveis ​​para secretar o surfactina molécula de sinalização, o que desencadeia a cascata de sinalização para a diferenciação dos produtores de matriz (Fig. 7). Subpopulação de produtores de matrizes são falsas em tons de azul, enquanto a subpopulação de produtores surfactina é falso colorido do amarelo. Análise de citometria de fluxo utilizando uma única estirpe marcada com abrigando o repórter P tapa-YFP é apresentada na figura 8. Estirpe de controlo não tratado não abrigandoquaisquer genes de proteínas fluorescentes mostrou uma única população de fluorescência relativamente baixo. As células que abrigam P tapa-YFP em não biofilme condições indutoras de não diferenciar a subpopulação de produtores de matrizes e toda a população mostrou fluorescência relativamente baixo. Em biofilme indutora de condição, uma subpopulação de células com fluorescência relativa elevada ocorreu, observado como um ombro para a direita do pico de fluorescência relativa baixa 23. Resultados obtidos por análise de citometria de fluxo utilizando uma estirpe de duplo rotulados são representados na figura 9 e 10. Figura 9 monitoradas as subpopulações de produtores de matrizes e produtores surfactina usando a estirpe duplo marcado P tapa-PCP, P srfAA-YFP. Como controle de fluorescência de fundo foi utilizado uma estirpe que não abrigando quaisquer genes de proteínas fluorescentes. Em seguida, foram detectados cada subpopulação de produtores de matriz e os produtores surfactina em cada canal de fluorescência, utilizando a estirpe de um único rotulado<html> s como controles. A estirpe de duplo rotulado P tapa-CFP, P-srfAA YFP mostrou duas subpopulações de células que expressam níveis elevados dos repórteres fluorescentes. Cada população é moldada, mostrando que não há sobreposição na expressão dos repórteres entre as duas subpopulações de células especializadas 15. Do mesmo modo, a análise de citometria de fluxo utilizando duas vezes rotulado estirpe P SKF-YFP, P tapa-YFP é apresentada na figura 10. O repórter para o gene da SKF monitoriza a diferenciação da subpopulação de canibais 32, que tem sido descritos para diferenciar coordenadamente com a subpopulação de produtores de matriz 24. Neste caso, a estirpe de duplo rotulado mostrou uma subpopulação de células fluorescentes único que expressam tanto YFP e PCP. Isto indicou que ambas as vias de diferenciação de células são coordenadamente activado na subpopulação mesmo. 1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Esquema geral do experimento. O protocolo é dividido em três etapas principais. O primeiro passo requer etiquetar a estirpe de B. subtilis com a fusão repórter que monitora a subpopulação de interesse. Em segundo lugar, crescer as estirpes identificadas em condições indutoras de biofilme. Em terceiro lugar, dispersar o biofilme e levar a cabo de uma única célula análise da população utilizando microscópio de fluorescência e citometria de fluxo. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig2.jpg" /> Figura 2. Representação esquemática do pKM008 vetor de integração. Este vector integra a fusão repórter de interesse para o amyE lugar neutro por recombinação dupla. O promotor de interesse (P tapa) é clonado em vector usando a restrição sítios EcoRI e HindIII. Em seguida, a expressão do gene PCP está sob o controlo do promotor P Tapa. O orientatião dos genes no plasmídeo é representada como uma seta. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig3.jpg" /> Figura 3. Representação esquemática do vetor de integração pDR183. Este vector integra a fusão repórter de interesse para o lugar neutro laca por recombinação dupla. A fusão de interesse (P tapa - PCP) é clonado no vector utilizando o restrição sítios EcoRI e BamHI. A orientação dos genes no plasmídeo é representada como uma seta. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig4.jpg" /> Figura 4. Esquema da integração dos repórteres no cromossoma de B. subtilis por recombinação dupla. (A) B. cromossoma subtilis tem dois loci neutros, amyE e laca, para integrar fusões repórter sem afectar o desenvolvimento do biofilme. (B) </sTrong&gt; Processo de recombinação dupla de pKM008. Plasmídeo linearizado se integra no genoma de B. subtilis por recombinação dupla. A fusão repórter integra o locus neutro de uma maneira estável. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig5.jpg" /> Figura 5. Formação de biofilmes de B. subtilis NCIB3610. Processo de formação bioflm da estirpe B. subtilis NCIB 3610 quando crescem na MSgg meio indutor de biofilme, durante três dias a 30 ° C. Imagens seqüenciais do desenvolvimento de biofilme foram realizadas a cada 12h. <img alt="A Figura 6" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig6.jpg" /> Figura 6. A visualização da subpopulação de produtores matriz sob um microscópio de fluorescência. Uma amostra a partir de um biofilme de B. subtilis P tapa - PCP foi fixado e examinado ao microscópio de fluorescência. 200 ms de fluorescênciaexcitação evidenciado uma subpopulação de células que emitem fluorescência mais elevada do que o resto das células. Considerou-se esta subpopulação como a subpopulação de células produtoras de matriz. Barra de escala é 3 mm. <img alt="A Figura 7" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig7.jpg" /> Figura 7. A visualização da subpopulação de produtores de matriz e os produtores surfactina sob um microscópio de fluorescência. Exemplo a partir de um biofilme da B. subtilis P tapa-PCP, P tensão srfAA-YFP duplo marcado foi fixado e examinado ao microscópio de fluorescência. Tempo de exposição de 250 ms evidenciadas duas subpopulações de células que emitem fluorescência mais elevada do que o resto das células. Uma subpopulação expressa YFP e foi detectado apenas usando o canal YFP (falsa cor em amarelo). Esta é a subpopulação de produtores surfactina. Outra subpopulação expressa PCP e foi detectado exclusivamente usando o Chann PCP<html> el. Esta é a subpopulação de produtores de matriz. Barra de escala é 3 mm. <img alt="A Figura 8" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig8.jpg" /> Figura 8. Quantificação da subpopulação de produtores de matriz usando 2-D de citometria de fluxo. Dispersed células a partir de um biofilme de B. subtilis P tapa-YFP foram monitorados por citometria de fluxo. O citómetro de fluxo contadas 50.000 acontecimentos e do sinal de fluorescência para cada evento foi monitorado. Número de células contadas é traçado no eixo Y, enquanto a intensidade do sinal YFP é traçado no eixo X. As células foram cultivadas em meio LB para obter as condições de não-biofilme indutores. As células foram cultivadas em MSgg meio para a obtenção de biofilme condições indutoras de. A subpopulação de produtores de matriz diferencia apenas em condições indutoras de biofilme. Este valor foi adaptado a partir Lopez et al., PNAS (2009) 106 :280-285. s/ftp_upload/3796/3796fig9.jpg &quot;/&gt; Figura 9. Quantificação da subpopulação de produtores de matriz e os produtores surfactina utilizando 3-D citometria de fluxo. Sinal de fluorescência dos canais monitorados são apresentados no eixo X (por YFP) e ao eixo Y (por PCP). O eixo Z mede o número de células que expressam cada repórter e é quantificada como isolinhas contorno perpendiculares ao plano do papel. O número de eventos monitorados neste experimento foi de 50.000 eventos. Painel superior esquerdo apresenta um controlo de fluorescência de fundo abrigando nenhum gene da proteína fluorescente. Painel superior direito detecta a subpopulação de produtores surfactina na fluorescência YFP canal (com moldura em amarelo) usando um único marcado cepa P srfAA-YFP. Painel inferior esquerdo detecta a subpopulação de produtores da matriz na fluorescência PCP canal (com moldura em azul) usando uma única estirpe marcada P tapa-PCP. O duplo-rotulado estirpe P tapa &lt;/ Em&gt;-PCP, P srfAA-YFP é monitorado no painel inferior direito. Ele mostrou duas subpopulações que estão enquadradas em amarelo e azul. Este valor foi adaptada de López et al., Genes and Development (2009) 23 :1631-1638. <img alt="A Figura 10" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig10.jpg" /> Figura 10. Quantificação da subpopulação de produtores de matriz e canibais utilizando 3-D citometria de fluxo. Sinal de fluorescência dos canais monitorados são apresentados no eixo X (por YFP) e ao eixo Y (por PCP). O número de eventos monitorados neste experimento foi 50,000. Painel superior direito detecta a subpopulação de canibais na fluorescência YFP canal (com moldura na cor amarela) em uma única estirpe marcada P skf-YFP. Painel inferior esquerdo detecta a subpopulação de produtores da matriz na fluorescência PCP canal (com moldura em azul) em uma única estirpe marcada P tapa-PCP. A double marcado cepa P tapa-PCP, P skf-YFP mostrou apenas uma subpopulação de células em diagonal para os eixos X e Y (enquadrada no verde). Esta subpopulação é detectada no canal YFP e PCP porque expressa os dois repórteres simultaneamente. López et al, Genes and Development (2009) 23 :1631-1638.

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Microbiol. 74, 609-618 (2009).</li><li>Arima, K., Kakinuma, A., Tamura, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactin,+a+crystalline+peptidelipid+surfactant+produced+by+Bacillus+subtilis:+isolation,+characterization+and+its+inhibition+of+fibrin+clot+formation.">Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 31, 488-494 (1968).</li><li>Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+accessory+protein+required+for+anchoring+and+assembly+of+amyloid+fibres+in+B.+subtilis+biofilms.">An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms.</a> Mol. Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).</li><li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Novick, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+systems+in+staphylococci.">Genetic systems in staphylococci.</a> Methods Enzymol. 204, 587-636 (1991).</li><li>Yasbin, R. E., Young, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+in+Bacillus+subtilis+by+bacteriophage+SPP1.">Transduction in Bacillus subtilis by bacteriophage SPP1.</a> J. Virol. 14, 1343-1348 (1974).</li><li>Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis.">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).</li><li>Nakano, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=srfA+is+an+operon+required+for+surfactin+production,+competence+development,+and+efficient+sporulation+in+Bacillus+subtilis.">srfA is an operon required for surfactin production, competence development, and efficient sporulation in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 173, 1770-1778 (1991).</li><li>Gonzalez-Pastor, J. E., Hobbs, E. C., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannibalism+by+sporulating+bacteria.">Cannibalism by sporulating bacteria.</a> Science. 301, 510-513 (2003).</li><li>Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinking+about+Bacillus+subtilis+as+a+multicellular+organism.">Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 638-643 (2007).</li><li>Shapiro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinking+about+bacterial+populations+as+multicellular+organisms.">Thinking about bacterial populations as multicellular organisms.</a> Annu. Rev. Microbiol. 52, 81-104 (1998).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

O fato de que as comunidades bacterianas mostrar subpopulações de células que expressam conjunto específico de genes evidencia a complexidade das comunidades microbianas 33,34. Este protocolo deve ajudar a determinar se a expressão de qualquer gene de interesse é restrita a uma subpopulação específica de células especializadas na comunidade microbiana. Visualização destas subpopulações exige o desenvolvimento de novas técnicas, porque os métodos tradicionais para monitorizar a expressão do ge...

<table border="1"><tbody><tr><td> Técnica </td><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td rowspan="11"> MSgg composição </td><td> fosfato de potássio 5 mM </td><td> Roth </td><td> 6878 </td></tr><tr><td> MOPS 100mM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Cloreto de magnésio 2mM </td><td> Roth </td><td> 2189,1 </td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio 700μM </td><td> Roth </td><td> A119.1 </td></tr><tr><td> Férricos 50 ìm de cloreto </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 157740 </td></tr><tr><td> 1μM cloreto de zinco </td><td> Applichem </td><td> A2076 </td></tr><tr><td> Tiamina 2μM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 74625 </td></tr><tr><td> Glicerol 0,5% </td><td> Roth </td><td> 7533 </td></tr><tr><td> Gluta% companheiro de 0,5 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 49621 </td></tr><tr><td> Triptofano 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0254 </td></tr><tr><td> Fenilalanina 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2126 </td></tr><tr><td> Fixação das células </td><td> Paraformaldeído </td><td> Roth </td><td> 0335 </td></tr><tr><td></td><td> Nome do equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> Sonicação </td><td> Sonicador celular </td><td> Bandelin </td><td> D-1000 </td></tr><tr><td> A microscopia de fluorescência </td><td> Microscópio de fluorescência </td><td> Leica </td><td> DMI6000B </td></tr><tr><td></td><td> Nome do software </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> A microscopia de fluorescência </td> &lt;td&gt; Asaf </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> A citometria de fluxo </td><td> FCASDiva </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> A citometria de fluxo </td><td> FlowJo </td><td> Treestar </td><td></td></tr></tbody></table>

single-cell analysis of bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry

Formação de biofilme é um atributo geral para quase todos 1-6 bactérias. Quando as bactérias formar biofilmes, as células são encerradas em matriz extracelular que é principalmente constituída por proteínas e exopolissacarídeos, entre outros factores 7-10. A comunidade microbiana encaixada dentro do biofilme, muitas vezes mostra a diferenciação de subpopulação distinta de células especializadas 11-17. Estas subpopulações coexistir e muitas vezes mostram organização espacial e temporal dentro do biofilme 18-21. A formação de biofilme no modelo de Bacillus subtilis organismo requer a diferenciação de subpopulações distintas de células especializadas. Entre eles, a subpopulação de produtores de matriz, responsáveis ​​para produzir e secretar a matriz extracelular do biofilme é essencial para a formação de biofilme 11,19. Assim, a diferenciação dos produtores de matrizes é uma característica da formação de biofilme em B. subtilis. Usámos repórteres fluorescentes para visualizar e quantificar a subpopulação de produtores de matriz em biofilmes de B. subtilis 15,19,22-24. Concretamente, observou-se que a subpopulação de produtores de matriz diferencia em resposta à presença de auto-produzido sinal extracelular surfactina 25. Curiosamente, surfactina é produzida por uma subpopulação de células especializadas diferentes a partir da subpopulação de produtores de matriz 15. Temos detalhadas neste relatório a abordagem técnica necessária para visualizar e quantificar a subpopulação de produtores de matrizes e produtores surfactina dentro dos biofilmes de B. subtilis. Para fazer isso, repórteres fluorescentes de genes necessários para a produção de matriz e da produção surfactina são inseridos no cromossoma de B. subtilis. Repórteres são expressos apenas em uma subpopulação de células especializadas. Em seguida, as subpopulações pode sermonitorizada utilizando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo (ver Fig. 1). O fato de que diferentes subpopulações de células especializadas coexistir dentro de comunidades multicelulares de bactérias nos dá uma perspectiva diferente sobre a regulação da expressão gênica em procariontes. Este protocolo aborda esse fenômeno experimentalmente e pode ser facilmente adaptado a qualquer modelo de outros, para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à heterogeneidade fenotípica dentro de uma comunidade microbiana.

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Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilmes microbianos são geralmente constituídos por subpopulações distintas de células especializadas. De célula única análise destas subpopulações requer a utilização de repórteres fluorescentes. Aqui nós descrevemos um protocolo para visualizar e monitorar vários subpopulationswithin<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilmes através de microscopia de fluorescência e citometria de fluxo.

Análise de uma única célula de Bacillus subtilis Os biofilmes utilizando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

single-cell-analysis-bacillus-subtilis-biofilms-using-fluorescence

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

20.3K visualizações.  University of Würzburg. Biofilmes microbianos são geralmente constituídos por subpopulações distintas de células especializadas. De célula única análise destas subpopulações requer a utilização de repórteres fluorescentes. Aqui nós descrevemos um protocolo para visualizar e monitorar vários subpopulationswithin B. subtilis Biofilmes através de microscopia de fluorescência e citometria de fluxo.

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Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Análise por Citometria de fluxo das células imunológicas Dentro aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Imunologia e Infecção

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Imagens de células vivas de Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Usando Microscopia lapso de tempo Automated

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Um protocolo simples e rápido para não enzimática Separar frescos Tecidos Humanos para a Análise de infiltrar Linfócitos

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two Sprague-Dawley rats were used in this study. Animals were orally treated twice a day for two days with B. subtilis BSB3 strain or PBS. The next day after the last treatment, each group was divided and two experimental groups (one treated with PBS and one treated with B. subtilis) were placed at 45 oC for 25 min. Two control groups stayed for 25 min at room temperature. All rats were euthanized and different parameters were analyzed in all groups. Adverse effects of heat stress are registered by the decrease of villi height and total mucosal thickness in the intestinal epithelium; translocation of bacteria from the lumen; increased vesiculation of erythrocytes and elevation of the lipopolysaccharides (LPS) level in the blood. The protective efficacy of treatment is evaluated by prevention of these side effects. The protocol was set up for the oral treatment of rats with bacteria for prevention of heat stress complications, but this protocol can be modified and used for other routes of administration and for analysis of different compounds.

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

We described a protocol for prevention of heat stress effects in rats by oral pre-treatment with beneficial bacteria. This protocol can be modified and used for various routes of administration and for analysis of different compounds.

Prevenção de estresse térmico efeitos adversos em ratos pela<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Strain

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Metodologias para o estudo<em&gt; B. subtilis</em&gt; Os biofilmes como um modelo para a caracterização de pequena molécula biofilme Inibidores

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocitï¿½des do rato de Medula Óssea

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Caracterização de subconjuntos de monócitos humanos por sangue total Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...