Estamos agradecer o seguinte para o seu apoio: Scholarship Commonwealth Comissão Reino Unido financiamento (HP), EPSRC (HP), BBSRC (NMF) e da União Europeia Acções Marie Curie (MFN).

1. Preparação Slice parassagital 1,1 dissecar hemisférios cerebrais Todos experimentação animal deve seguir revisão ética local e regulamentos nacionais. No caso das experiências descritas aqui, o trabalho está em conformidade com os animais do Reino Unido (Scientific Procedures) Act de 1986. Nós usam rotineiramente deslocamento cervical, sem anestésico para eutanásia o mouse antes de remover o cérebro. Alternativamente, o rato pode ser terminalmente anestesiados, mas neste caso, pode ser necessário para determinar se a escolha do anestésico influencia as propriedades neuronais. Remover o cérebro do rato e imediatamente lugar no frio (4-8 ° C) de corte do fluido cerebrospinal artificial (ACSF) (ver Tabela 1 para as composições de solução) borbulhar à saturação com carbogénio (95% de O 2, 5% de CO 2). Depois de um máximo de três minutos, retire cuidadosamente o cérebro da cUtting ACSF usando uma espátula e delicadamente colocá-lo na posição vertical (lado dorsal virado para cima) em papel filtro que foi umedecido com o ACSF de corte (Figura 1A). Para facilitar a montagem precisa dos hemisférios, utilizar um aparelho de barbear ou bisturi para remover o máximo do cerebelo quanto possível sem prejudicar o MEC (localizado no extremo caudal do cérebro) e remover o terceiro rostral do cérebro por seccionamento no plano coronal (Figura 1B). Hemisect o cérebro, tomando cuidado para que a secção é exactamente ao longo do plano vertical da linha média (Figura 1C). Retornar os hemisférios ao ACSF borbulhar de corte para um minutos e meio. 1,2 Montar os hemisférios em um vibratome Antes da montagem, assegurar que a aresta de corte da lâmina tem um ângulo vibratome menos 20 graus com a horizontal ( <strong&gt; Figura 1D). Na superfície de montagem fazer uma tira superficial do paralelo superglue para a lâmina de vibratome, aproximadamente a largura de um hemisfério, e tempo suficiente para acomodar os dois hemisférios de ponta a ponta. Tendo o cuidado de minimizar o impacto físico, remover cada hemisfério do ACSF de corte com uma espátula e posição de modo que a sua superfície medial repousa sobre a espátula e sua extensão dorsal está voltado para a lâmina de micrótomo. Deslize suavemente cada hemisfério sobre a tira de supercola, tendo o cuidado de garantir que a superfície medial de cada hemisfério é paralela à base micrótomo. Descobrimos que, para melhores resultados a superfície dorsal de cada hemisfério deve ser em paralelo e em frente da lâmina vibratome (Figura 1D). 1.3 Manutenção da preparação durante o corte Na sequência de montagem imediatamente submergir os hemisférios a frio de corte ACSF (4 - 8 ° C). Manter a temperaturee carbogénio saturação durante todo o procedimento de corte. Se o arrefecimento directo e borbulhamento da solução na câmara de corte não é prático, periodicamente reabastecer a solução ACSF de corte na câmara com uma solução gelada e borbulhou fresco. 1,4 pontos de corte Usando um vibratome, remover córtex de ambos os hemisférios no plano sagital até identificar o grau mais lateral do MEC (tipicamente ~ 1 milímetro para baixo a partir da superfície lateral) (Figura 1F). Entre cortes de levantar a lâmina vibratome até ~ 200 mm a evitar arrastando a lâmina de volta e danificar o tecido exposto. Simultaneamente cortar 400 uM secções parassagitais a partir de ambos os hemisférios (se eles estão alinhados, como mostrado na Figura 1D ambos irão ser cortado ao mesmo tempo) até que a extensão medial do MEC é atingido. Isto pode ser identificados pela ausência da banda espessa branca em torno da curva ventro-caudal de tele hipocampo (a cápsula externa), a forma não-convexa da sua fronteira rostral eo angular dorso-caudal &#39;canto&#39;. Figura 1E ilustra a aparência circular do hipocampo, no plano parasagital lateral ao MEC. Figuras 1F-G ilustram como seções dentro do MEC aparecem em diferentes posições medial lateral-quando cortar. Note-se a progressivamente mais aparência em forma de feijão do hipocampo em posições mais medial. Cada hemisfério normalmente produz dois ou três 400 m de espessura, contendo o MEC. 1,5 fatias Incubar Após cada corte colocar imediatamente as fatias em carbogénio-saturado padrão ACSF mantidas em um banho de água a 35 ° C. Permitir fatias a incubar a 35 ° C durante aproximadamente 15 minutos no ACSF após o corte está completa. Remova o suporte fatia do banho de água e continuar borbulhando com carbogénio à temperatura ambiente durante a lleste 45 minutos. 2. Exemplo Experiment Slice parassagital Uma experiência típica usando esta preparação é a de fazer gravações electrofisiológicos a partir de células estreladas em camada II do MEC. 2.1 Otimizar óptica Antes de gravar, assegurar que o condensador está em foco no plano fatia (Koehler iluminação) e é centrado sob a ampliação elevada (por exemplo, 40x) objectivo. 2.2 identificar as células de interesse Usar uma ampliação baixa (por exemplo 4x) objectivo de identificar uma região de gravação aproximado dentro da MEC (Figura 2A-B). Mudar para um objectivo ampliação elevada para identificar as células viáveis ​​dentro desta região (Figura 2C-D). Como um exemplo, putativos da camada de células estreladas II são visualmente identificados pela sua forma poligonal ou ovóide e múltiplos dendritos primários com diâmetros semelhanteter, ea ausência de um único grande diâmetro apical dendrite 2,13,14. Eles são seguramente identificado na borda da camada fronteira I / II, onde são abundantes e muitas vezes aparecer em pequenos grupos 2,9 (Figura 2C-D). Outros tipos de células, tais como interneurónios e células piramidais também deve ser identificável. Neste ponto experiências pode ser realizada, por exemplo, utilizando de células inteiras de patch-clamp para gravar o potencial de membrana ou membrana de corrente a partir de neurónios identificados, e os métodos eléctricos ou optogenetic para activar entradas sinápticas para o neurónio gravada. Neuron identidade pode ser verificado a partir das propriedades electrofisiológicas do neurónio gravado e através da inclusão de etiquetas fluorescentes dentro da solução intracelular. 3. Meça localização ao longo do eixo Dorso-ventral 3,1 localização da imagem de interesse e fatia em torno Para determinar a posição de um RECORneurônio ded ao longo do eixo dorso-ventral, pela primeira vez um objetivo pequeno aumento para a imagem da região MEC da fatia e áreas circunvizinhas. Marcar a localização de interesse, por exemplo, incluindo o eléctrodo de gravação em uma imagem (Figura 3A) ou por descer o diafragma de íris de campo para deixar um círculo brilhante em torno da localização de interesse em uma imagem duplicada. Para identificar a localização de gravação dentro da imagem do duplicado pode então ser sobreposta sobre a imagem inicial do local de gravação e os seus arredores (Figura 3B). Até 3 ampliação separado baixa (4x) imagens pode ser necessária para cobrir a área a partir de um local de gravação ventral à borda dorsal da MEC. Estas imagens podem então ser cosido em conjunto, utilizando manipulação de imagens de software para fornecer uma imagem que medidas de distância pode ser tomada a partir de (Figura 3). Verificação ulterior do neurónio identidade e localização pode ser realizada seguindo de gravação através da inclusãomarcadores inactivos tais como biocitina ou corantes Alexa dentro da solução intracelular e, em seguida, utilizando o processamento apropriado do tecido seguindo de gravação 2. 3,2 Estabelecer a borda dorsal do MEC A borda dorsal do MEC fornece um marco conveniente para medir dorso-ventral posição. A borda ventral do MEC não está tão bem definido. Figura 4 ilustra como os marcos definidos no MEC celulares Nissl fatias coradas em diferentes médio-lateral posições aparecem sob iluminação DIC. A Figura 4 A mostra o hipocampo circular (Figura 4 (i)) e à falta de uma saliência parasubicular em camada I (Figura 4 (iv)) associado com fatias parassagitais contendo lateral córtex entorrinal (LEC). Figura 4 BC mostram fatias típicas que contêm o MEC. A parte dorsal da região de fronteira proeminente escuro dorsal entorrinal / Parasubicular nas fatias DIC iluminados contém uma área da parasubiculum. A área parasubiculum é claramente revelado por coloração de Nissl nas imagens correspondentes em coluna (iii). A borda dorsal dos MEC (setas pretas em 4B e 4C coluna (iv)) é ventral para o grupo de células parasubicular que se projecta para fora em camada muito I (setas vermelhas no 4B e 4C coluna (iv)). Comparação das Figuras 4B e 4C colunas (ii) e (iii) mostra que a borda dorsal da MEC nas secções de Nissl corresponde a um local que é ventral ao bordo dorsal da região de fronteira escuro entorrinal / Parasubicular na fatia DIC ( setas pretas). A localização da fronteira pode ser estimada a partir de imagens DIC e comparação de imagens de referência (ver também ref. 14). Validação Futuro da borda dorsal MEC com marcadores moleculares irá melhorar a precisão da estimativa. Notamos that coradas secções de referência, e secções que são processadas para a identificação morfológica dos neurónios marcados, podem ser sujeitas ao encolhimento considerável. Comparação de distâncias absolutas em relação a marcos em DIC e seções de referência, portanto, requer em primeiro lugar medição ea correcção em retração (ver, por exemplo ref 2). Calibre 3,3 e medir distâncias Para facilitar a medição fácil de distância em imagens, utilizar o objectivo mesma ampliação baixa para a imagem de uma grade de referência para estabelecer um pixel: taxa de conversão de distância. Medir a distância de pixel a partir da borda dorsal da MEC para a localização de interesse ao longo do contorno da MEC usando um programa de gráficos e converter distância pixel para a distância em uM (Figura 5A). Se os neurónios são enchidos com um marcador tal como biocitina, em seguida, localização do neurónio gravado pode então também ser recuperada por processamento apropriado (ver, por exemplo ref 2). 4. ReprResultados esentative A Figura 5A mostra um exemplo de baixa ampliação (4x) imagem composta de uma fatia parasagital depois da gravação, com as localizações dos neurónios gravados e guias de medição sobrepostos. Gravações dos marcadas células estreladas dorsal e ventral são mostrados na Figura 5B. Essas gravações ajudam a estabelecer a identidade das células e ilustrar como as propriedades elétricas do MEC camada de células estreladas II diferem em locais dorsal e ventral. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig1.jpg" /> Figura 1. Preparação de fatias sagitais. Um cérebro inteiro descansando com o lado dorsal virado para cima em papel de filtro umedecido com corte ACSF. B </strong&gt; Cérebro após a remoção do cerebelo e terceiro rostral do córtex frontal do cérebro C. Hemisected pronto para montagem. D montado hemisférios tira cola paralela à borda de corte da lâmina vibratome antes da submersão em corte ACSF e cortar. E Aspecto da seção contendo LEC durante a aparência de corte procedimento após a remoção do tecido lateral e ainda não está suficientemente medial para uma fatia parasagital padrão MEC. F de parte &#39;lateral&#39; do MEC após a remoção de mais de 400 uM de tecido (a superfície é de 400 uM mediais ao mostrado na . (F)) G Aspecto de parte &quot;medial&quot; do MEC depois de uma fatia 400 mM parassagital foi cortado Schematics HI de EF, respectivamente, indicando pontos anatômicos, c:. L cerebelo, córtex entorrinal: lateral (LEC), m: medial córtex entorrinal (MEC), h: hipocampo, laranja: cápsula externa, azul: corpo caloso, ciano: giro denteado, green: CA3 e CA1. O aparecimento de limite rostral do hipocampo em fatias que contêm LEC é côncava (seta preta em H), enquanto que em fatias que contêm apenas MEC, o limite pode ser linear (seta vermelha em I) ou côncava (seta vermelha em J). As formas aproximadas de marcos anatômicos coloridos foram obtidos a partir das anotações no cérebro Allen Atlas ( <a href="http://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html">http://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html</a> ). <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig2.jpg" /> Figura 2. Identificação de células da camada II do MEC sob iluminação DIC. Uma imagem Exemplo composto de um par<html> fatia sagital do cérebro em baixa ampliação (4x). As imagens separadas foram alinhados e misturados para remover bordas distracção e vinhetas. Importante marco h áreas: hipocampo, m:. MEC Cortar B de um indivíduo de baixa ampliação (4x) imagem que contém a camada II do MEC, visível como a faixa vertical escura perto da borda direita C MEC camada II em grande aumento (. ) 40x com iluminação DIC. A imagem é um composto alinhados e misturados de várias imagens. A central densa &#39;coluna&#39; de células é Layer II. D imagem ampliação Único alta DIC mostrando um grupo de células saudáveis ​​estreladas putativos e interneurônios na camada II. Como mostrado aqui, estrelada células geralmente ocorrem em grupos, na fronteira da camada I / II. Células piramidais tendem a ser encontrados mais perto da camada de fronteira II / III. As linhas pontilhadas na AC indicar a extensão da BD, respectivamente. Barras de escala: em A e B 500 mm, em C e D 100 uM. Figura 3 &quot;src =&quot; files/ftp_upload/3802/3802fig3.jpg / &quot;/&gt; Figura 3. Medir a posição dorsal-ventral de locais de interesse. Uma ampliação Alinhado baixa (4x) imagens que incluem a extensão dorso-ventral inteira do MEC entre o local de interesse (marcado pela ponta de um eléctrodo de registo) eo ponto de referência região escura entorrinal / Parasubicular fronteira (utilizada para estabelecer a borda dorsal do MEC - ver Figura 4) B Como em A, mas incluindo uma imagem sobreposta com uma parada para baixo campo diafragma (sobreposta com a opacidade reduzida) em vez de um eletrodo de registro para marcar o local de interesse.. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig4.jpg" /> Figura 4. Estimativa da borda dorsal do MEC a partir de imagens DIC de cortes sagitais. Seções AC parassagital (lateral para medial) do córtex entorrinal. Seções DIC e Nissl são de microfone diferenteAC e coluna (i):.. Whole fatias sagitais (400 mm de espessura) (alinhados e compostos de misturas de baixa ampliação (4x) imagens) coluna AC (ii): Feche acima do córtex entorrinal com a região de fronteira característica escuro entorrinal / Parasubicular em a área de topo de cada imagem. coluna AC fatias (iii) de Nissl corados (40 mm de espessura) a partir de um rato diferente alinhado com imagens em AC (ii). A camada mais escura, densa de células é a camada II. Comparando as colunas ii) e (iii) mostra como as células coradas de Nissl aparecem em imagens DIC AC coluna (iv):. Detalhe de Nissl fatias coradas. B e C em coluna (iv) incluem células do parasubiculum (parte dorsal da região de fronteira escuro entorrinal / Parasubicular nas imagens DIC) e células de MEC dorsal. Em B (iv) e C (iv) a grande mancha dorsal de células parasubicular que se estende em profundidade camada I é facilmente visível (setas vermelhas). A borda ventral destas manchas corresponde à bo dorsalRDEM do MEC (setas pretas). Num (iv) o adesivo parasubicular está ausente, indicando que a fatia é demasiado lateral para uma preparação padrão fatia parasagital MEC. Em todos os painéis, setas pretas indicam a borda dorsal do MEC. Setas cinzentas indicam a fronteira aproximada ventral do MEC. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig5.jpg" /> Figura 5. Os resultados representativos. Uma porção Misturado e cortada da imagem da Figura 3 A. As posições de uma célula dorsal e ventral uma célula são indicados por azul e verde círculos a cheio, respectivamente. A seta preta marca a fronteira estimada dorsal do MEC e é estendido para as camadas profundas da linha branca pontilhada. A linha de sólido branco é um guia mostrando o caminho de contorno ao longo do qual a medição de pixel de distância a partir da borda dorsal da MEC para a célula ventralmente localizado foi tirada. Barra de escala: 500 mm B Electro.traços fisiológicos das células indicada em A. Da esquerda para a direita - respostas subliminares para as etapas atuais usados ​​para calcular a resistência de entrada, spiking resposta a um passo positivo grande corrente, detalhe espiga.

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	<li>O'Donnell, C., Nolan, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+of+synaptic+responses:+an+organizing+principle+for+optimization+of+neural+circuits.">Tuning of synaptic responses: an organizing principle for optimization of neural circuits.</a> Trends Neurosci. 34, 51-60 (2011).</li><li>Garden, D. L. F., Dodson, P. D., O'Donnell, C., White, M. D., Nolan, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+of+synaptic+integration+in+the+medial+entorhinal+cortex+to+the+organization+of+grid+cell+firing+fields.">Tuning of synaptic integration in the medial entorhinal cortex to the organization of grid cell firing fields.</a> Neuron. 60, 875-889 (2008).</li><li>Kuba, H., Yamada, R., Fukui, I., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonotopic+specialization+of+auditory+coincidence+detection+in+nucleus+laminaris+of+the+chick.">Tonotopic specialization of auditory coincidence detection in nucleus laminaris of the chick.</a> Journal of Neuroscience. 25, 1924-1934 (2005).</li><li>Hafting, T., Fyhn, M., Molden, S., Moser, M. -. B., Moser, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructure+of+a+spatial+map+in+the+entorhinal+cortex.">Microstructure of a spatial map in the entorhinal cortex.</a> Nature. 436, 801-806 (2005).</li><li>Sargolini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjunctive+representation+of+position,+direction,+and+velocity+in+entorhinal+cortex.">Conjunctive representation of position, direction, and velocity in entorhinal cortex.</a> Science. 312, 758-762 (2006).</li><li>Fyhn, M., Hafting, T., Witter, M. P., Moser, E. I., Moser, M. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grid+cells+in+mice.">Grid cells in mice.</a> Hippocampus. 18, 1230-1238 (2008).</li><li>Giocomo, L. M., Zilli, E. A., Frans&#233;n, E., Hasselmo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+frequency+of+subthreshold+oscillations+scales+with+entorhinal+grid+cell+field+spacing.">Temporal frequency of subthreshold oscillations scales with entorhinal grid cell field spacing.</a> Science. 315, 1719-1722 (2007).</li><li>Giocomo, L. M., Hasselmo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+constants+of+h+current+in+layer+II+stellate+cells+differ+along+the+dorsal+to+ventral+axis+of+medial+entorhinal+cortex.">Time constants of h current in layer II stellate cells differ along the dorsal to ventral axis of medial entorhinal cortex.</a> Journal of Neuroscience. 28, 9414-9425 (2008).</li><li>Burgalossi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcircuits+of+functionally+identified+neurons+in+the+rat+medial+entorhinal+cortex.">Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex.</a> Neuron. 70, 773-786 (2011).</li><li>Dodson, P. D., Pastoll, H., Nolan, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal-ventral+organization+of+theta-like+activity+intrinsic+to+entorhinal+stellate+neurons+is+mediated+by+differences+in+stochastic+current+fluctuations.">Dorsal-ventral organization of theta-like activity intrinsic to entorhinal stellate neurons is mediated by differences in stochastic current fluctuations.</a> J. Physiol. (Lond). 589, 2993-3008 (2011).</li><li>Nolan, M., Dudman, J., Dodson, P., Santoro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN1+channels+control+resting+and+active+integrative+properties+of+stellate+cells+from+layer+II+of+the+entorhinal+cortex.">HCN1 channels control resting and active integrative properties of stellate cells from layer II of the entorhinal cortex.</a> Journal of Neuroscience. 27, (2007).</li><li>Boehlen, A., Heinemann, U., Erchova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+range+of+intrinsic+frequencies+represented+by+medial+entorhinal+cortex+stellate+cells+extends+with+age.">The range of intrinsic frequencies represented by medial entorhinal cortex stellate cells extends with age.</a> Journal of Neuroscience. 30, 4585-4589 (2010).</li><li>Klink, R., Alonso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+characteristics+of+layer+II+projection+neurons+in+the+rat+medial+entorhinal+cortex.">Morphological characteristics of layer II projection neurons in the rat medial entorhinal cortex.</a> Hippocampus. 7, 571-583 (1997).</li><li>van Groen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entorhinal+cortex+of+the+mouse:+cytoarchitectonical+organization.">Entorhinal cortex of the mouse: cytoarchitectonical organization.</a> Hippocampus. 11, 397-407 (2001).</li><li>Dolorfo, C. L., Amaral, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entorhinal+cortex+of+the+rat:+organization+of+intrinsic+connections.">Entorhinal cortex of the rat: organization of intrinsic connections.</a> The Journal of Comparative Neurology. 398, 49-82 (1998).</li></ol>

Nada de divulgar.

Para facilitar a investigação das propriedades de circuito MEC que seguem uma organização dorsal-ventral temos descrito aqui em detalhe um procedimento para a produção de uma preparação fatia parasagital que preserva a extensão dorso-ventral do MEC. As etapas críticas Remover o cérebro do animal. Tome cuidado especial para evitar a exercer pressão sobre o cérebro. Isto é mais importante do que a remoção rápida do cérebro. <p cl...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Corte ACSF (mM) </td><td> Padrão ACSF (mM) </td><td> Solução interna (mM) </td><td> CASNumber </td><td> Número Catálogo Fornecedor </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 86 </td><td> 124 </td><td></td><td> 7647-14-5 </td><td> Sigma S9888 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 1,2 </td><td> 1,2 </td><td></td><td> 13472-35-0 </td><td> Sigma 71505 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 </td><td> 2,5 </td><td> 10 </td><td> 7447-40-7 </td><td> Sigma P3911 </td></tr><tr><td> De NaHCO3 </td><td> 25 </td><td> 25 </td><td></td><td> 144-55-8 </td><td> Fischer S/4240 </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> 25 </td><td> 20 </td><td></td><td> 50-99-7 </td><td> Sigma G5767 </td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> 75 </td><td></td><td></td><td> 57-50-1 </td><td> Sigma S5016 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0,5 </td><td> 2 </td><td></td><td> 10043-52-4 </td><td> VWR 190464K </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 7 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 7786-30-3 </td><td> Sigma 63020 </td></tr><tr><td> K Gluconato </td><td></td><td></td><td> 130 </td><td> 299-27-4 </td><td> Sigma G4500 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 7365-45-9 </td><td> Sigma H3375 </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td></td><td> 0,1 </td><td> 67-42-5 </td><td> Sigma E4378 </td></tr><tr><td> Na 2 ATP </td><td></td><td></td><td> 2 </td><td> 34369-07-8 </td><td> Sigma A7699 </td></tr><tr><td> Na 2 GTP </td><td></td><td></td><td> 0,3 </td><td> 36051-31-7 </td><td> Sigma G8877 </td></tr><tr><td> NaPhospho Creatina </td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 19333-65-4 </td><td> Sigma P7936 </td></tr><tr><td> Biocitina (opcional) </td><td></td><td></td><td> 2,7 </td><td> 576-19-2 </td><td&gt; Sigma B4261 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Corte ACSF, padrão ACSF e K-gluconato receitas solução interna.

preparation of parasagittal slices for the investigation of dorsal-ventral organization of the rodent medial entorhinal cortex

Computação no cérebro depende de neurônios que respondem adequadamente às suas entradas sinápticas. Neurônios diferem em seu complemento e distribuição de canais de membrana de íons que determinam como eles respondem a entradas sinápticas. No entanto, a relação entre estas propriedades celulares e função neuronal em comportando animais não é bem compreendida. Uma abordagem para este problema é investigar topograficamente organizadas circuitos neurais em que a posição de mapas individuais neurônios para codificar informações de que ou os cálculos que realizam 1. Experimentos utilizando esta abordagem sugere princípios para ajuste das respostas sinápticas subjacentes codificação da informação em circuitos sensoriais e cognitivos 2,3. A organização topográfica das representações espaciais ao longo do eixo dorso-ventral medial do córtex entorrinal (MEC) oferece uma oportunidade para estabelecer relações entre os mecanismos celulares e cálculos important para a cognição espacial. Neurônios na camada II do MEC roedor codificar localização utilizando-grade como disparar campos 4-6. Para os neurónios encontrados nas posições dorsal no MEC a distância entre os campos de queima individuais que formam uma grelha é da ordem de 30 cm, enquanto que para os neurónios em posições progressivamente mais ventrais esta distância aumenta para mais de 1 m. Vários estudos têm revelado propriedades celulares de neurónios na camada II do MEC que, tal como o espaçamento entre os campos de grade de queima, também diferem de acordo com a sua posição dorsal-ventral, sugerindo que estas propriedades celulares são importantes para a computação espacial 2,7-10. Aqui descrevemos procedimentos de preparação e gravação eletrofisiológico de fatias do cérebro que mantêm a extensão dorso-ventral da investigação MEC permitindo a organização topográfica das propriedades biofísicas e anatômico de neurônios do MEC. A posição dorsal-ventral de n identificadoeurons relativos aos marcos anatômicos é difícil estabelecer com precisão com os protocolos que utilizam fatias horizontais do MEC 7,8,11,12, como é difícil estabelecer pontos de referência para a localização dorso-ventral exato da fatia. Os procedimentos aqui descritos permitem uma medição precisa e consistente com a localização de células registados ao longo do eixo dorso-ventral do MEC, bem como a visualização de gradientes moleculares 2,10. Os procedimentos foram desenvolvidos para utilização com ratos adultos (&gt; 28 dias) e foram empregues com sucesso com ratos até 1,5 anos de idade. Com os ajustes que poderiam ser usados ​​com ratos mais jovens ou outras espécies de roedores. Um sistema padronizado de preparação e medição ajudará investigação sistemática das propriedades celulares e microcircuito desta área.

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Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

Nós descrevemos processos de preparação e de gravação electrofisiológico de fatias do cérebro que mantêm o eixo dorso-ventral do córtex entorrinal medial (MEC). Devido codificação neural da localização seguinte uma organização dorsal-ventral dentro do MEC, estes procedimentos facilitar a investigação dos mecanismos celulares importantes para navegação e de memória.

Preparação de fatias parassagital de Investigação de dorso-ventral Organização do Rodent córtex medial entorrinal

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of ...

preparation-parasagittal-slices-for-investigation-dorsal-ventral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.5K visualizações.  University of Edinburgh. Nós descrevemos processos de preparação e de gravação electrofisiológico de fatias do cérebro que mantêm o eixo dorso-ventral do córtex entorrinal medial (MEC). Devido codificação neural da localização seguinte uma organização dorsal-ventral dentro do MEC, estes procedimentos facilitar a investigação dos mecanismos celulares importantes para navegação e de memória.

Vídeo: Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

Brain Imaging Investigation of the Neural Correlates of Emotion Regulation

The ability to control/regulate emotions is an important coping mechanism in the face of emotionally stressful situations. Although significant progress has been made in understanding conscious/deliberate emotion regulation (ER), less is known about non-conscious/automatic ER and the associated neural correlates. This is in part due to the problems inherent in the unitary concepts of automatic and conscious processing1. Here, we present a protocol that allows investigation of the neural correlates of both deliberate and automatic ER using functional magnetic resonance imaging (fMRI). This protocol allows new avenues of inquiry into various aspects of ER. For instance, the experimental design allows manipulation of the goal to regulate emotion (conscious vs. non-conscious), as well as the intensity of the emotional challenge (high vs. low). Moreover, it allows investigation of both immediate (emotion perception) and long-term effects (emotional memory) of ER strategies on emotion processing. Therefore, this protocol may contribute to better understanding of the neural mechanisms of emotion regulation in healthy behaviour, and to gaining insight into possible causes of deficits in depression and anxiety disorders in which emotion dysregulation is often among the core debilitating features.

We present a protocol that allows investigation of the neural correlates of deliberate and automatic emotion regulation, using functional magnetic resonance imaging. This protocol can be used in healthy participants, both young and older, as well as in clinical patients.

Investigação por imagem do cérebro os correlatos neurais da regulação emocional

The ability to control/regulate emotions is an important coping mechanism in the face of emotionally stressful situations. Although significant progress ...

Neurociência

Brain Imaging Investigation of the Memory-Enhancing Effect of Emotion

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the neural mechanisms underlying this enhancing effect of emotion on memory. A method that has proven particularly influential in the 
investigation of the memory-enhancing effect of emotion is the so-called subsequent memory paradigm (SMP). This method was originally used to investigate the 
neural correlates of non-emotional memories3, and more recently we and others also applied it successfully to studies of emotional memory (reviewed in4, 5-7). 
Here, we describe a protocol that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion using the SMP in conjunction with 
event-related functional magnetic resonance imaging (fMRI). An important feature of the SMP is that it allows separation of brain activity specifically 
associated with memory from more general activity associated with perception. Moreover, in the context of investigating the impact of emotional stimuli, 
SMP allows identification of brain regions whose activity is susceptible to emotional modulation of both general/perceptual and memory-specific processing. 
This protocol can be used in healthy subjects8-15, as well as in clinical patients where there are alterations in the neural correlates of emotion perception 
and biases in remembering emotional events, such as those suffering from depression and post-traumatic stress disorder (PTSD)16, 17.

We present a protocol that uses functional magnetic resonance imaging to investigate the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion. This protocol allows identification of brain activity specifically linked to memory-related processing, contrary to more general perceptual processing, and can be used with healthy and clinical populations.

Investigação de imagens do cérebro do Efeito Memória de aumento da Emoção

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the ...

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional distractibility) effects (reviewed in 1). Complementing our recent protocol 2 describing a method that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion (see also 1, 3-5), here we present a protocol that allows investigation of the neural correlates of the detrimental impact of emotion on cognition. The main feature of this method is that it allows identification of reciprocal modulations between activity in a ventral neural system, involved in 'hot' emotion processing (HotEmo system), and a dorsal system, involved in higher-level 'cold' cognitive/executive processing (ColdEx system), which are linked to cognitive performance and to individual variations in behavior (reviewed in 1). Since its initial introduction 6, this design has proven particularly versatile and influential in the elucidation of various aspects concerning the neural correlates of the detrimental impact of emotional distraction on cognition, with a focus on working memory (WM), and of coping with such distraction 7,11, in both healthy 8-11 and clinical participants 12-14.

We present a protocol that allows investigation of the neural mechanisms mediating the detrimental impact of emotion on cognition, using functional magnetic resonance imaging. This protocol can be used with both healthy and clinical participants.

Investigação por imagem do cérebro o efeito prejudicial da emoção sobre a Cognição

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Eletroencefalografia simultânea, em tempo real de medição da concentração de lactato e Manipulação optogenética da atividade neuronal do córtex cerebral de roedores

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

A Comprehensive Protocol for Manual Segmentation of the Medial Temporal Lobe Structures

The present paper describes a comprehensive protocol for manual tracing of the set of brain regions comprising the medial temporal lobe (MTL): amygdala, hippocampus, and the associated parahippocampal regions (perirhinal, entorhinal,&#160;and parahippocampal proper). Unlike most other tracing protocols available, typically focusing on certain MTL areas (e.g., amygdala and/or hippocampus), the integrative perspective adopted by the present tracing guidelines allows for clear localization of all MTL subregions. By integrating information from a variety of sources, including extant tracing protocols separately targeting various MTL structures, histological reports, and brain atlases, and with the complement of illustrative visual materials, the present protocol provides an accurate, intuitive, and convenient guide for understanding the MTL anatomy. The need for such tracing guidelines is also emphasized by illustrating possible differences between automatic and manual segmentation protocols. This knowledge can be applied toward research involving not only structural MRI investigations but also structural-functional colocalization and fMRI signal extraction from anatomically defined ROIs, in healthy and clinical groups alike.

The present work provides a comprehensive set of guidelines for manually tracing the medial temporal lobe (MTL) structures. This protocol can be applied to research involving structural and/or combined structural-functional magnetic resonance imaging (MRI) investigations of the MTL, in both healthy and clinical groups.

Um protocolo abrangente para segmentação manual das estruturas do lobo temporal medial

The present paper describes a comprehensive protocol for manual tracing of the set of brain regions comprising the medial temporal lobe (MTL): amygdala, ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Preparação de fatias de cérebro aguda usando um otimizado N-metil-D-método de proteção de recuperação glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

A Preparação de Oblique Spinal Cord Fatias de Estimulação raiz ventral

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific frequency and in turn modulate ongoing cortical oscillatory activity. This neurotool allows the establishment of a causal link between endogenous oscillatory activity and behavior. Most of the tACS studies have shown online effects of tACS. However, little is known about the underlying action mechanisms of this technique because of the AC-induced artifacts on Electroencephalography (EEG) signals. Here we show a unique approach to investigate online physiological frequency-specific effects of tACS of the primary motor cortex (M1) by using single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) to probe cortical excitability changes. In our setup, the TMS coil is placed over the tACS electrode while Motor Evoked Potentials (MEPs) are collected to test the effects of the ongoing M1-tACS. So far, this approach has mainly been used to study the visual and motor systems. However, the current tACS-TMS setup can pave the way for future investigations of cognitive functions. Therefore, we provide a step-by-step manual and video guidelines for the procedure.

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) allows the modulation of cortical excitability in a frequency-specific fashion. Here we show a unique approach which combines online tACS with single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) in order to "probe" cortical excitability by means of Motor Evoked Potentials.

Efeitos da estimulação da corrente alternada transcraniana no córtex Motor primário por on-line abordagem combinada com estimulação magnética transcraniana

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

Avaliação da densidade de sinapse em fatias Hippocampal cérebro de roedor

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Preparação de ritmicamente ativo em Vitro Neonatal roedores tronco cerebral-medular e fatia fina

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...