O objetivo geral deste procedimento é preparar fatias agudas saudáveis da região intermediária dorsal do hipocampo para gravações de longo prazo e reconstrução de neurônios em camundongos adultos. Muitos laboratórios como o nosso, estudando hipocampo dorsal por seu papel na aprendizagem especial e navegação. Técnicas comuns empregadas para este fim são experimentos comportamentais, rastreamento anatômico e manipulações específicas regionais.
Desenvolvemos um método de corte cerebral para combinar eletrofisiologia com esta técnica para permitir a correlação direta de invivodata dentro de gravações de vídeo. A vantagem deste protocolo é que ele combina um procedimento simples para obter fatias transversais com o uso de solução de proteção para melhorar a viabilidade do tecido cerebral. Essa abordagem é particularmente adequada quando animais maduros são usados como em experimentos comportamentais.
Para iniciar este procedimento, prepare ao lado da pia o equipamento necessário para esta seção. Prepare no gelo um copo de 150 mililitros e duas placas de vidro Petri de 10 centímetros de diâmetro cada. Desenhe três partes das linhas até o fundo de uma placa de Petri de plástico e posicione esta placa perto da bandeja de gelo.
Você também precisará de cola e do porta-espécimes para o vibratome. Em seguida, equipar o banco de cirurgia com tesoura grande, tesoura pequena, pinça de ponta arredondada, pinças de ponta fina, uma espátula de metal fina, uma espátula de metal grande, e transferir pipetas. Descasque as placas de Petri com uma solução de corte.
Um prato para realizar a dissecação da cabeça e o outro para a dissecação do cérebro. Neste último, coloque também um pedaço de papel filtro. Preencha também o béquer com solução de corte de 30 mililitros.
Isso será necessário para a perfusão transcárvia. Encha a bandeja de vibratome com solução de corte gelado e mantenha toda a solução oxigenada com um dispositivo borbulhante de carbogen. Adicione o gelo triturado feito do lote congelado de solução de corte à solução de corte fresco frio para manter a temperatura baixa.
Preste atenção, para manter o gelo longe da lâmina enquanto corta. Quase todas as etapas após a capitação são realizadas dentro das soluções. Isso ajuda a manter a privação de oxigênio do metabolismo ao mínimo.
Prepare uma câmara de incubação cheia de uma solução de corte sob constante oxigenação. Coloque a câmara em um banho de água pré-aquecido a 35 graus Celsius. Prepare uma câmara de armazenamento fatiada com vários poços independentes e encha-a com solução de armazenamento.
Mantenha-o sob constante oxigenação à temperatura ambiente. No caso de o tecido expressar uma proteína fluorescente ou uma opsonina ativada pela luz. É recomendável manter a câmara no escuro.
Por exemplo, dentro da caixa. Depois de realizar a perfusão transcárdia, coloque a cabeça do mouse na placa de Petri com a solução de corte frio de gelo. Abra a pele com uma tesoura fina para expor o crânio.
Começando no foramen magnum, corte ao longo da sutura sagital até chegar à sutura nasofrontal. Tenha cuidado para puxar ligeiramente a tesoura para evitar danos ao cérebro. Faça duas incisões laterais na base do crânio.
Use a pinça arredondada para puxar os ossos parietal. Tenha cuidado para remover também as meninges. Se deixados, podem danificar o cérebro durante a extração.
Use a espátula pequena para soltar suavemente o cérebro da base do crânio. Com uma pequena espátula, retire o cérebro dos nervos cranianos e transfira o cérebro para um pequeno pedaço de papel filtro na segunda placa de Petri. Corte o cérebro em metades ao longo da fissura longitudinal usando uma lâmina pré-refrigerada.
Separe os dois hemisférios usando a menor espátula. Use a espátula maior para transferir um hemisfério para a placa de plástico Petri com sua superfície medial voltada para baixo. Alinhe o córtex parietal com uma das linhas paralelas para ter uma referência para o segundo corte.
Use um pedaço de papel filtro para secar a solução em excesso. Posicione a lâmina em paralelo às linhas e corte a parte ventral do hemisfério. Esta superfície plana será posteriormente colada no suporte do espécime.
Devolva o hemisfério para a solução de algodão oxigenado da placa de vidro Petri e realize o mesmo procedimento no segundo hemisfério. Coloque uma gota de cola de cianoacrilato no suporte do espécime vibratome e espalhe-o com uma espátula para criar uma camada fina. Transfira o hemisfério para o suporte do vibratome com o lado ventral para baixo usando o lado arredondado da espátula.
Iniciar este corte do córtex parietal reduziria o tempo necessário para coletar a região dorsal do hipocampo. Adicione algumas gotas de solução de corte a frio para solidificar a cola. Mova o suporte do espécime para a bandeja de vibratome e com as configurações apropriadas, corte o cérebro até que a região do hipocampo dorsal seja visível.
Em seguida, recolha as fatias com o uso de uma pipeta de transferência de plástico. Transfira cada fatia para a câmara de incubação e deixe descansar por 12 minutos. Enquanto isso, prossiga com o corte das próximas fatias.
Após os 12 minutos de incubação, transfira as fatias para a câmara de armazenamento. E deixe descansar até o início do experimento. Para demonstrar a pureza de nossa preparação, comparamos com uma preparação coronal que é comumente usada para gravar a partir do hipocampo dorsal.
Mostrado aqui, micrografo de contraste de interferência diferencial adquirido da lâmina superior do giro dentado em fatias agudas de camundongos de dois meses de idade. Na fatia transversal, os neurônios apresentaram principalmente superfícies lisas e apenas provavelmente bordas contrastadas, indicadas por setas negras. Neurônios em fatias coronais, no entanto, muitas vezes apareciam curso e exibiam contornos fortemente contrastados, indicados por setas brancas.
Isso sugere melhor viabilidade dos neurônios na fatia transversal. De acordo com esta impressão, o tempo médio para selar a formação durante a remenda em nossas fatias transversais foi significativamente mais rápido do que nas fatias coronais. Como um proxy geral para a integridade celular, registramos que os potenciais de membrana de repouso das células de grânulo e parvalbumin positivos entre neurônios que, onde significativamente mais despolarizam em ambos os tipos de células em fatias coronais versus transversais.
O que, no final, resultou em significativamente mais células que tiveram que ser excluídas na preparação coronal. Enquanto os axônios das células de grânulo correm no plano transversal, a reconstrução de células registradas resultou na recuperação da arborização axonal completa em nossa preparação. Este não foi o caso em fatias coronais onde os axônios podem facilmente ter sido cortados.
Além disso, a reconstrução morfológica de parvalbuminas interferais positivas em fatias transversais permitiu a representação de arborização axonal e dendrítica extensa, incluindo a visualização de pequenos detalhes, como espinhas dendríticas. No total, apresentamos métodos de corte para obter fatias de hipocampo transversal com alta viabilidade neuronal para camundongos adultos. Este método pode ser usado para medir a investigação eletrofisiológica in vitro com estudos anatômicos e comportamentais com foco na parte dorsal intermediária do hipocampo.
