Siamo ringraziare per il loro sostegno: Commonwealth Scholarship Commissione UK finanziamento (HP), EPSRC (HP), BBSRC (NPF) e dell&#39;Unione europea Azioni Marie Curie (NPF).

1. Slice Preparazione parasagittale 1,1 Dissect out emisferi cerebrali Tutti sperimentazione animale dovrebbero seguire locali esame etico e delle normative nazionali. Nel caso degli esperimenti descritti qui, il lavoro conforme agli animali Regno Unito (Scientific Procedures) Act 1986. Noi abitualmente uso dislocazione cervicale senza anestesia per eutanasia il mouse prima di rimuovere il cervello. In alternativa, il mouse può essere terminale anestetizzati, ma in questo caso può essere necessario per determinare se la scelta di anestetico influenza proprietà neuronali. Togliere il cervello dal mouse e subito posto in condizioni di freddo (4-8 ° C) il taglio artificiale liquido cerebrospinale (ACSF) (vedi Tabella 1 per composizioni in soluzione) bollito alla saturazione con CarboGen (95% O 2, 5% CO 2). Dopo un massimo di tre minuti, rimuovere con attenzione il cervello dal cUtting ACSF utilizzando una spatola e delicatamente collocare in posizione verticale (lato dorsale verso l&#39;alto) su carta da filtro che è stato inumidito con il taglio ACSF (Figura 1A). Per facilitare il montaggio accurato degli emisferi, utilizzare un rasoio o bisturi per rimuovere la maggior quantità del cervelletto possibile senza ripercussioni sul MEC (che si trova all&#39;estremo caudale del cervello) e rimuovere il terzo rostrale del cervello sezionando nel piano coronale (figura 1B). Hemisect il cervello, avendo cura che la sezione è esattamente lungo il piano verticale della linea mediana (Figura 1C). Ritorno degli emisferi al ACSF bolle di taglio per un minuti e mezzo. 1,2 Montare gli emisferi su un vibratomo Prima del montaggio, in modo che il bordo tagliente della lama vibratomo è angolato a 20 gradi dalla posizione orizzontale ( <sTrong&gt; Figura 1D). Sulla superficie di montaggio una striscia superficiale di colla parallela alla lama vibratomo, circa la larghezza di un emisfero e sufficientemente lunga per i due emisferi end-to-end. Avendo cura di minimizzare l&#39;impatto fisico, rimuovere ciascun emisfero dalla ACSF taglio con una spatola e la posizione in modo che la sua superficie mediale si basa sulla spatola e la sua estensione dorsale rivolta verso la lama microtomo. Delicatamente ciascun emisfero sulla striscia di colla, avendo cura di assicurare che la superficie mediale di ciascun emisfero è parallelo alla base microtomo. Abbiamo trovato che i migliori risultati per la superficie dorsale di ciascun emisfero dovrebbe essere parallelo e rivolte verso la lama vibratomo (Figura 1D). 1.3 Manutenzione del preparato durante l&#39;affettatura Dopo il montaggio immediatamente immergere gli emisferi in ACSF taglio a freddo (4 - 8 ° C). Mantenere la temperature saturazione e CarboGen tutta la procedura di taglio. Se il raffreddamento diretto e gorgogliamento della soluzione nella camera di taglio non è pratico, periodicamente ricostituire la soluzione di taglio ACSF nella camera con soluzione fresca raffreddato e bolle. 1.4 sezioni tagliate Utilizzando un vibratomo, rimuovere corteccia da due emisferi nel piano sagittale fino a identificare l&#39;estensione più laterale del MEC (tipicamente ~ 1 millimetro dalla superficie laterale) (figura 1F). Tra tagli sollevare la lama vibratomo up ~ 200 micron per evitare di trascinare la lama ripercorrere e danneggiare il tessuto esposto. Contemporaneamente tagliate sezioni 400 um parasagittali da due emisferi (se sono allineate, come mostrato nella figura 1D saranno entrambi essere tagliate contemporaneamente) finché la portata mediale del MEC viene raggiunto. Questo può essere identificato tramite l&#39;assenza della banda bianca spessa attorno al ventro-caudale curva di tegli ippocampo (la capsula esterna), la non-convessa del suo confine rostrale e l&#39;angolare dorso-caudale &#39;angolo&#39;. figura 1E illustra l&#39;aspetto circolare dell&#39;ippocampo nel piano parasagittale laterale al MEC. figure 1F-G illustrano come sezioni all&#39;interno del MEC appaiono in diverse laterale-mediale posizioni quando taglio. Nota la progressivamente più a forma di fagiolo aspetto dell&#39;ippocampo da più posizioni mediale. Ogni emisfero produce in genere due o tre fette di 400 micron di spessore che contengono il MEC. 1.5 fette Incubare Dopo ogni taglio immediatamente disporre le fette in CarboGen-saturo standard di ACSF mantenuti in un bagno di acqua a 35 ° C. Lasciare fette a incubare a 35 ° C per circa 15 minuti nel ACSF dopo il taglio è completa. Rimuovere il supporto fetta dal bagnomaria e continuare a gorgogliare con CarboGen a temperatura ambiente per lest 45 minuti. 2. Esempio parasagittale Experiment Slice Un tipico esperimento utilizzando questa preparazione è quello di rendere le registrazioni elettrofisiologiche da parte delle cellule stellate nel livello II della MEC. 2.1 Ottimizzare ottiche Prima della registrazione, in modo che il condensatore è a fuoco sul piano slice (illuminazione Koehler) ed è centrato sotto l&#39;ingrandimento elevato (ad esempio 40x) obiettivo. 2.2 identificare le cellule di interesse Utilizzare un basso ingrandimento (es. 4x) obiettivo per identificare una regione approssimativo di registrazione all&#39;interno del MEC (Figura 2A-B). Passare a un obiettivo ingrandimento per identificare cellule vitali all&#39;interno di questa regione (Figura 2C-D). Come esempio, putativi strato II cellule stellate sono visivamente identificati dai loro forma poligonale o ovoidale e più dendriti primari con diametro simileter, e l&#39;assenza di un diametro unico grande dendrite apicale 2,13,14. Essi vengono identificati sul bordo del bordo Layer I / II, dove sono abbondanti e spesso appaiono in piccoli gruppi 2,9 (Figura 2C-D). Altri tipi di cellule, quali interneuroni e cellule piramidali dovrebbero anche essere identificabile. A questo punto esperimenti può essere effettuata, per esempio utilizzando whole-cell patch-clamp per registrare il potenziale di membrana o di membrana corrente da neuroni identificati, e metodi elettrici o optogenetic per attivare gli ingressi sinaptiche al neurone registrato. Neuron identità può essere verificata dalle proprietà elettrofisiologiche dei neuroni registrati e includendo le etichette fluorescenti all&#39;interno della soluzione intracellulare. 3. Misurare posizione lungo il dorso-ventrale Axis 3,1 posizione dell&#39;immagine di interesse e slice circostante Per determinare la posizione di un regineurone DED lungo il dorso-ventrale asse, utilizzare innanzitutto un obiettivo a basso ingrandimento per l&#39;immagine della regione MEC della fetta e le zone circostanti. Segnare la posizione di interesse, ad esempio, tra l&#39;elettrodo di registrazione in una immagine (Figura 3A) o scendendo il diaframma di campo e lascia un cerchio luminoso intorno alla posizione di interesse in una copia dell&#39;immagine. Per individuare la posizione di registrazione all&#39;interno dell&#39;immagine del duplicato può essere sovrapposta all&#39;immagine iniziale della posizione di registrazione e dei suoi dintorni (Figura 3B). Fino a 3 ingrandimenti separata bassa (4x) immagini può essere necessario per coprire l&#39;area da una posizione di registrazione ventrale al confine dorsale del MEC. Queste immagini possono poi essere unite insieme mediante manipolazione delle immagini software per fornire un&#39;immagine che le misure di distanza può essere presa da (Figura 3). Ulteriore verifica dell&#39;identità neurone e localizzazione può essere effettuata seguendo registrazione includendomarcatori inattivi come coloranti o biocitina Alexa all&#39;interno della soluzione intracellulare e quindi utilizzando opportune elaborazioni del tessuto in seguito registrazione 2. 3,2 Stabilire il confine dorsale del MEC Il bordo dorsale del MEC fornisce un punto di riferimento da cui partire per misurare la posizione dorso-ventrale. Il bordo ventrale del MEC non è ben definito. La figura 4 mostra come i punti di riferimento definiti nel MEC cellulari Nissl fette colorate a differenti posizioni di medio-laterale appaiono sotto illuminazione DIC. Figura 4 A mostra l&#39;ippocampo circolare (figura 4 (i)) e la mancanza di una sporgenza parasubicular strato in I (Figura 4 (iv)) associato con fette parasagittali contenenti laterale corteccia entorinale (LEC). Figura 4 aC mostrano fette tipici che contengono la MEC. La parte dorsale del promontorio scuro dorsale entorinale / Parasubicular regione di confine nelle fette DIC illuminati contiene un&#39;area del parasubiculum. L&#39;area parasubiculum è chiaramente rivelata mediante colorazione Nissl nelle immagini corrispondenti a colonna (iii). Il bordo dorsale delle MEC (frecce nere in 4B e 4C colonna (iv)) è ventrale al gruppo di celle parasubicular che sporge in profondità nello strato I (frecce rosse 4B e 4C colonna (iv)). Confronto delle figure 4B e 4C colonne (ii) e (iii) mostra che il bordo dorsale del MEC nelle sezioni Nissl corrisponde a una posizione che è ventrale al bordo dorsale del buio entorinale / Parasubicular regione di confine nella fetta DIC ( frecce nere). La posizione del bordo può essere stimata dalle immagini DIC e di confronto per immagini di riferimento (vedi anche rif. 14). Future convalida del confine dorsale MEC con marcatori molecolari migliorerà l&#39;accuratezza di questa stima. Notiamo that macchiato sezioni di riferimento, e le sezioni che vengono elaborati per l&#39;identificazione morfologica di neuroni marcati, può essere soggetto a restringimento considerevole. Confronto delle distanze relative a punti di riferimento assoluti in DIC sezioni di riferimento e quindi richiede prima misurazione e della correzione per il ritiro (si veda per esempio rif 2). 3,3 Calibrare e misurare le distanze Per agevolare una facile misurazione della distanza in immagini, utilizzare lo stesso obiettivo a basso ingrandimento di immagine una griglia di riferimento per stabilire un pixel: conversione del rapporto a distanza. Misurare la distanza pixel dal bordo dorsale della MEC alla posizione di interesse lungo il contorno della MEC utilizzando un programma di grafica e convertire distanza pixel a distanza in um (figura 5A). Se i neuroni sono riempiti con un marcatore come biocitina, allora posizione del neurone registrato può anche essere recuperato dal trattamento appropriato (per esempio vedi riferimento 2). 4. ReprRisultati esentative Figura 5A mostra un esempio basso ingrandimento (4x) immagine composita di una fetta parasagittale dopo la registrazione, con le posizioni di neuroni registrati e guide misurazione sovrapposti. Registrazioni dalle cellule marcate stellate dorsale e ventrale sono mostrati in figura 5B. Queste registrazioni aiutare a stabilire l&#39;identità delle cellule ed illustrare come le proprietà elettriche del MEC Layer II cellule stellate differiscono in luoghi dorsali e ventrali. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig1.jpg" /> Figura 1. Preparazione di fette parasagittali. Un cervello intero riposo con il lato dorsale verso l&#39;alto su carta da filtro inumidita con taglio ACSF. B </sTrong&gt; Cervello dopo la rimozione del cervelletto e del terzo rostrale della corteccia frontale. cerebrale C Hemisected pronto per il montaggio. D montato emisferi striscia adesiva parallelamente al tagliente della lama vibratomo prima immersione nel taglio ACSF e affettare. E aspetto di sezione contenente LEC durante Aspetto taglio procedura dopo la rimozione di tessuto laterale e non ancora sufficientemente mediale per uno standard fetta parasagittale MEC. F della parte &#39;laterale&#39; del MEC dopo la rimozione di ulteriori 400 micron di tessuto (la superficie è di 400 um mediale a quello illustrato nella . (F)) Aspetto G della parte &#39;mediale&#39; del MEC, dopo una fetta di 400 micron parasagittale è stato tagliato HI Schema di EF, rispettivamente, indicano punti di repere anatomici, C:. cervelletto, L: laterale della corteccia entorinale (LEC), m: mediale corteccia entorinale (MEC), h: ippocampo, arancione: capsula esterna, blu: corpo calloso, ciano: giro dentato, green: CA3 e CA1. L&#39;aspetto di confine rostrale dell&#39;ippocampo a fette che contengono LEC è concava (freccia nera in H), mentre a fette che contengono solo MEC, il confine può essere lineare (freccia rossa in I) o concave (freccia rossa in J). Le forme approssimative di punti di repere anatomici colorati sono stati ricavati dalle annotazioni nel cervello Allen Atlas ( <a href="http://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html">http://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html</a> ). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig2.jpg" /> Figura 2. Identificare le cellule dello strato MEC II sotto illuminazione DIC. Una immagine composita Esempio di para<html> sezione sagittale del cervello a basso ingrandimento (4x). Le immagini separate sono state allineate e miscelati per rimuovere i bordi di distrazione e vignettatura. Importante punto di riferimento h aree: l&#39;ippocampo, m. MEC B Crop da un individuo a basso ingrandimento (4x) un&#39;immagine che contiene strato II del MEC, visibile come la striscia scura verticale vicino al bordo destro C MEC II livello a forte ingrandimento (. ) 40x con illuminazione DIC. L&#39;immagine è un composito allineata e mescolato di più immagini. Il denso centrale &#39;colonna&#39; di cellule è Layer II. D singola immagine ad alto ingrandimento DIC mostra un gruppo di cellule stellate presunti sani e interneuroni dello strato II. Come si vede qui, le cellule stellate si verificano spesso in gruppi al confine dello strato I / II. Cellule piramidali tendono a trovare più vicino al II / III confine Layer. Le linee tratteggiate in AC indicano il grado di BD, rispettivamente. Barre di scala: in A e B 500 pm, in C e D 100 micron. Figura 3 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3802/3802fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. La misurazione del dorso-ventrale posizione di luoghi di interesse. Un ingrandimento Allineato bassa (4x) immagini che includono l&#39;intero dorso-ventrale entità del MEC tra la posizione di interesse (contrassegnato dalla punta di un elettrodo di registrazione) e al buio entorinale / Parasubicular riferimento zona di confine (utilizzato per stabilire il bordo dorsale del MEC - vedi figura 4) B come in A, ma con una immagine sovrapposta con una bloccata sul campo di diaframma ad iride (sovrapposti con opacità ridotta) invece di un elettrodo di registrazione per contrassegnare la posizione di interesse.. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig4.jpg" /> Figura 4. La stima del bordo dorsale della MEC dalle immagini DIC di fette parasagittali. AC sezioni parasagittale (laterale a mediale) dalla corteccia entorinale. Sezioni DIC e Nissl sono da mic diversie colonna AC (i):.. intere fette parasagittali (400 micron di spessore) (allineati e composti misti di basso ingrandimento (4x) immagini) colonna AC (ii): Primo piano di corteccia entorinale con il colore scuro, caratteristica entorinale / Parasubicular regione di confine in la zona superiore di ogni immagine. AC colonna (iii) Nissl fette colorate (40 micron di spessore) da un mouse diverso allineato con le immagini in AC (ii). Il più scuro, denso strato di cellule è lo strato II. Confronto colonne (ii) e (iii) mostra come le cellule colorate Nissl apparire nelle immagini DIC colonna AC (iv):. Dettaglio di Nissl fette colorate. Colonna B e C (iv) includono cellule dal parasubiculum (parte dorsale del buio entorinale / Parasubicular regione di confine nelle immagini DIC) e cellule di MEC dorsale. In B (iv) e C (iv) la patch grande dorsale di cellule parasubicular che si estende in profondità nel layer I è facilmente visibile (frecce rosse). Il bordo ventrale di queste patch corrisponde alla dorsale border del MEC (frecce nere). In A (iv) la patch parasubicular è assente, indicando che la fetta è troppo laterale per una preparazione standard parasagittale fetta MEC. In tutti i pannelli, frecce nere indicano il confine dorsale del MEC. Frecce grigie indicano il confine approssimativa ventrale del MEC. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3802/3802fig5.jpg" /> Figura 5. Risultati rappresentativi. Una porzione ritagliata e Blended dell&#39;immagine in Figura 3 A. Le posizioni di una cella dorsale e una cellula ventrale sono indicati con blu e verdi cerchi pieni rispettivamente. La freccia nera segna il confine stimato dorsale del MEC e si estende negli strati profondi dalla linea bianca tratteggiata. La linea solido bianco un breve mostra il percorso di contorno lungo il quale è stata presa la misurazione pixel di distanza dal bordo dorsale della MEC alla cella posizione ventrale. Barra della scala: 500 micron B Electro.tracce fisiologiche le cellule indicate in A. Da sinistra a destra - le risposte sottosoglia alle operazioni correnti utilizzati per calcolare la resistenza di ingresso, spike risposta ad un grande passo positivo attuale, particolare picco.

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Niente da rivelare.

Per facilitare studio di proprietà del circuito MEC che seguono un dorso-ventrale organizzazione che abbiamo descritto in dettaglio una procedura per la produzione di una preparazione parasagittale sezione che conserva il dorso-ventrale entità del MEC. Passaggi critici Rimozione del cervello dell&#39;animale. Prestare particolare attenzione per evitare di esercitare pressione sul cervello. Questo è più importante rapida rimozione del cervello. <...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Taglio ACSF (mM) </td><td> ACSF standard (mM) </td><td> Soluzione interna (mm) </td><td> CASNumber </td><td> Fornitore Numero di catalogo </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 86 </td><td> 124 </td><td></td><td> 7647-14-5 </td><td> Sigma S9888 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 1,2 </td><td> 1,2 </td><td></td><td> 13472-35-0 </td><td> Sigma 71505 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 </td><td> 2,5 </td><td> 10 </td><td> 7447-40-7 </td><td> Sigma P3911 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 25 </td><td> 25 </td><td></td><td> 144-55-8 </td><td> Fischer S/4240 </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> 25 </td><td> 20 </td><td></td><td> 50-99-7 </td><td> Sigma G5767 </td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> 75 </td><td></td><td></td><td> 57-50-1 </td><td> Sigma S5016 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0,5 </td><td> 2 </td><td></td><td> 10043-52-4 </td><td> VWR 190464K </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 7 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 7786-30-3 </td><td> Sigma 63020 </td></tr><tr><td> K Gluconato </td><td></td><td></td><td> 130 </td><td> 299-27-4 </td><td> Sigma G4500 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 7365-45-9 </td><td> Sigma H3375 </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td></td><td> 0,1 </td><td> 67-42-5 </td><td> Sigma E4378 </td></tr><tr><td> Na 2 ATP </td><td></td><td></td><td> 2 </td><td> 34369-07-8 </td><td> Sigma A7699 </td></tr><tr><td> Na 2 GTP </td><td></td><td></td><td> 0,3 </td><td> 36051-31-7 </td><td> Sigma G8877 </td></tr><tr><td> NaPhospho-Creatina </td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 19333-65-4 </td><td> Sigma P7936 </td></tr><tr><td> Biocitina (opzionale) </td><td></td><td></td><td> 2,7 </td><td> 576-19-2 </td><td&gt; Sigma B4261 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Taglio ACSF, standard ACSF e K-gluconato ricette soluzione interna.

preparation of parasagittal slices for the investigation of dorsal-ventral organization of the rodent medial entorhinal cortex

Calcolo nel cervello si basa su neuroni che rispondono in modo appropriato ai rispettivi ingressi sinaptici. I neuroni si differenziano per il loro complemento e distribuzione di canali ionici della membrana che determinano il modo in cui rispondono agli ingressi sinaptici. Tuttavia, il rapporto tra queste proprietà cellulari e la funzione neuronale in comportamenti animali non è ben compreso. Un approccio a questo problema è di investigare topograficamente organizzati circuiti neurali in cui la posizione dei singoli neuroni mappe su informazioni che codificano o calcoli essi effettuati 1. Gli esperimenti che utilizzano questo approccio suggeriscono i principi per l&#39;ottimizzazione della risposta sinaptica alla base codifica dell&#39;informazione nei circuiti sensoriali e cognitive 2,3. L&#39;organizzazione topografica delle rappresentazioni spaziali lungo l&#39;asse dorso-ventrale della corteccia entorinale mediale (MEC) fornisce l&#39;opportunità di stabilire relazioni tra i meccanismi cellulari e calcoli importante per la cognizione spaziale. I neuroni nello strato II del MEC roditore posizione utilizzando la codifica di tipo grid cottura campi 4-6. Per neuroni trovati in posizioni dorsali in MEC la distanza tra i singoli campi di cottura che formano una griglia è dell&#39;ordine di 30 cm, mentre per i neuroni in posizioni progressivamente più ventrali questa distanza aumenta a maggiore di 1 m. Diversi studi hanno rivelato proprietà cellulari di neuroni strato II del MEC che, come la spaziatura tra i campi della griglia di cottura, anche differire a seconda delle dorso-ventrale posizione, suggerendo che queste proprietà cellulari sono importanti per il calcolo spaziale 2,7-10. Qui si descrivono le modalità di preparazione e registrazione elettrofisiologica di fettine di cervello che mantengono la dorsale-ventrale l&#39;ampiezza delle investigazioni MEC consente l&#39;organizzazione topografica delle proprietà biofisiche e anatomiche dei neuroni MEC. Il dorso-ventrale posizione di n identificatoeurons relativi punti di riferimento anatomici è difficile stabilire con precisione con protocolli che utilizzano fette orizzontali di MEC 7,8,11,12, poiché è difficile stabilire punti di riferimento per l&#39;esatto dorso-ventrale posizione della fetta. Le procedure che descrivono consentono la misurazione accurata e coerente di localizzazione delle cellule registrate lungo l&#39;asse dorso-ventrale del MEC, nonché la visualizzazione dei gradienti molecolari 2,10. Le procedure sono state sviluppate per l&#39;utilizzo con topi adulti (&gt; 28 giorni) e sono stati impiegati con successo con i topi fino a 1,5 anni. Con aggiustamenti potrebbero essere utilizzati con più giovani topi o altre specie di roditori. Un sistema standardizzato di preparazione e misura aiuterà un&#39;indagine sistematica delle proprietà cellulari e microcircuito di questa zona.

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Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

Si descrivono procedure di preparazione e registrazione elettrofisiologica da fette di cervello che mantengono il dorso-ventrale asse mediale corteccia entorinale (MEC). A causa di codifica neurale della posizione segue un dorso-ventrale organizzazione all&#39;interno della MEC, queste procedure di facilitare studio dei meccanismi cellulari importanti per la navigazione e la memoria.

Preparazione di sezioni parasagittali delle inchieste sui dorso-ventrale organizzazione della corteccia entorinale Rodent mediale

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.5K Views.  University of Edinburgh. Si descrivono procedure di preparazione e registrazione elettrofisiologica da fette di cervello che mantengono il dorso-ventrale asse mediale corteccia entorinale (MEC). A causa di codifica neurale della posizione segue un dorso-ventrale organizzazione all'interno della MEC, queste procedure di facilitare studio dei meccanismi cellulari importanti per la navigazione e la memoria.

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Brain Imaging Investigation of the Neural Correlates of Emotion Regulation

The ability to control/regulate emotions is an important coping mechanism in the face of emotionally stressful situations. Although significant progress has been made in understanding conscious/deliberate emotion regulation (ER), less is known about non-conscious/automatic ER and the associated neural correlates. This is in part due to the problems inherent in the unitary concepts of automatic and conscious processing1. Here, we present a protocol that allows investigation of the neural correlates of both deliberate and automatic ER using functional magnetic resonance imaging (fMRI). This protocol allows new avenues of inquiry into various aspects of ER. For instance, the experimental design allows manipulation of the goal to regulate emotion (conscious vs. non-conscious), as well as the intensity of the emotional challenge (high vs. low). Moreover, it allows investigation of both immediate (emotion perception) and long-term effects (emotional memory) of ER strategies on emotion processing. Therefore, this protocol may contribute to better understanding of the neural mechanisms of emotion regulation in healthy behaviour, and to gaining insight into possible causes of deficits in depression and anxiety disorders in which emotion dysregulation is often among the core debilitating features.

We present a protocol that allows investigation of the neural correlates of deliberate and automatic emotion regulation, using functional magnetic resonance imaging. This protocol can be used in healthy participants, both young and older, as well as in clinical patients.

Indagine del cervello Imaging i correlati neurali delle emozioni regolamento

The ability to control/regulate emotions is an important coping mechanism in the face of emotionally stressful situations. Although significant progress ...

Ricerca

Neuroscienze

Brain Imaging Investigation of the Memory-Enhancing Effect of Emotion

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the neural mechanisms underlying this enhancing effect of emotion on memory. A method that has proven particularly influential in the 
investigation of the memory-enhancing effect of emotion is the so-called subsequent memory paradigm (SMP). This method was originally used to investigate the 
neural correlates of non-emotional memories3, and more recently we and others also applied it successfully to studies of emotional memory (reviewed in4, 5-7). 
Here, we describe a protocol that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion using the SMP in conjunction with 
event-related functional magnetic resonance imaging (fMRI). An important feature of the SMP is that it allows separation of brain activity specifically 
associated with memory from more general activity associated with perception. Moreover, in the context of investigating the impact of emotional stimuli, 
SMP allows identification of brain regions whose activity is susceptible to emotional modulation of both general/perceptual and memory-specific processing. 
This protocol can be used in healthy subjects8-15, as well as in clinical patients where there are alterations in the neural correlates of emotion perception 
and biases in remembering emotional events, such as those suffering from depression and post-traumatic stress disorder (PTSD)16, 17.

We present a protocol that uses functional magnetic resonance imaging to investigate the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion. This protocol allows identification of brain activity specifically linked to memory-related processing, contrary to more general perceptual processing, and can be used with healthy and clinical populations.

Indagine Imaging cerebrale della memoria effetto di intensificazione delle emozioni

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the ...

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional distractibility) effects (reviewed in 1). Complementing our recent protocol 2 describing a method that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion (see also 1, 3-5), here we present a protocol that allows investigation of the neural correlates of the detrimental impact of emotion on cognition. The main feature of this method is that it allows identification of reciprocal modulations between activity in a ventral neural system, involved in 'hot' emotion processing (HotEmo system), and a dorsal system, involved in higher-level 'cold' cognitive/executive processing (ColdEx system), which are linked to cognitive performance and to individual variations in behavior (reviewed in 1). Since its initial introduction 6, this design has proven particularly versatile and influential in the elucidation of various aspects concerning the neural correlates of the detrimental impact of emotional distraction on cognition, with a focus on working memory (WM), and of coping with such distraction 7,11, in both healthy 8-11 and clinical participants 12-14.

We present a protocol that allows investigation of the neural mechanisms mediating the detrimental impact of emotion on cognition, using functional magnetic resonance imaging. This protocol can be used with both healthy and clinical participants.

Imaging cerebrale Indagine di compromettere l&#39;effetto delle emozioni sulla cognizione

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Elettroencefalografia simultanea, in tempo reale misura della concentrazione di lattato e la manipolazione Optogenetic di attività neuronale nella corteccia cerebrale Rodentia

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

A Comprehensive Protocol for Manual Segmentation of the Medial Temporal Lobe Structures

The present paper describes a comprehensive protocol for manual tracing of the set of brain regions comprising the medial temporal lobe (MTL): amygdala, hippocampus, and the associated parahippocampal regions (perirhinal, entorhinal,&#160;and parahippocampal proper). Unlike most other tracing protocols available, typically focusing on certain MTL areas (e.g., amygdala and/or hippocampus), the integrative perspective adopted by the present tracing guidelines allows for clear localization of all MTL subregions. By integrating information from a variety of sources, including extant tracing protocols separately targeting various MTL structures, histological reports, and brain atlases, and with the complement of illustrative visual materials, the present protocol provides an accurate, intuitive, and convenient guide for understanding the MTL anatomy. The need for such tracing guidelines is also emphasized by illustrating possible differences between automatic and manual segmentation protocols. This knowledge can be applied toward research involving not only structural MRI investigations but also structural-functional colocalization and fMRI signal extraction from anatomically defined ROIs, in healthy and clinical groups alike.

The present work provides a comprehensive set of guidelines for manually tracing the medial temporal lobe (MTL) structures. This protocol can be applied to research involving structural and/or combined structural-functional magnetic resonance imaging (MRI) investigations of the MTL, in both healthy and clinical groups.

Un protocollo completo per Segmentazione manuale delle Strutture mediale del lobo temporale

The present paper describes a comprehensive protocol for manual tracing of the set of brain regions comprising the medial temporal lobe (MTL): amygdala, ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Preparazione di fettine di cervello acuto utilizzando un' ottimizzata N-metilico-D-metodo di ripristino protettivo glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

La preparazione di Oblique Spinal Cord Fette per ventrale Root Stimolazione

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific frequency and in turn modulate ongoing cortical oscillatory activity. This neurotool allows the establishment of a causal link between endogenous oscillatory activity and behavior. Most of the tACS studies have shown online effects of tACS. However, little is known about the underlying action mechanisms of this technique because of the AC-induced artifacts on Electroencephalography (EEG) signals. Here we show a unique approach to investigate online physiological frequency-specific effects of tACS of the primary motor cortex (M1) by using single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) to probe cortical excitability changes. In our setup, the TMS coil is placed over the tACS electrode while Motor Evoked Potentials (MEPs) are collected to test the effects of the ongoing M1-tACS. So far, this approach has mainly been used to study the visual and motor systems. However, the current tACS-TMS setup can pave the way for future investigations of cognitive functions. Therefore, we provide a step-by-step manual and video guidelines for the procedure.

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) allows the modulation of cortical excitability in a frequency-specific fashion. Here we show a unique approach which combines online tACS with single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) in order to "probe" cortical excitability by means of Motor Evoked Potentials.

Effetti della stimolazione transcranica con corrente alternata la corteccia motoria primaria di approccio combinato Online con stimolazione magnetica transcranica

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

Valutazione di densità di sinapsi nelle fette Hippocampal del cervello del roditore

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Preparazione di ritmicamente-attivo In Vitro neonatale del roditore del tronco cerebrale-spinale e fetta sottile

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...