Os autores agradecem o apoio notável de seu laboratório, os membros da equipe e do trabalho pelo Cluster de CellNetworks Excelência na Universidade de Heidelberg, bem como pela Chica e Schaller Heinz (CHS) da fundação. Nós apreciamos que a evolução molecular de AAV via DNA família baralhar tornou-se um campo muito ativo desde a nossa primeira publicação há três anos e, portanto, peço desculpas a todos os autores de publicações relevantes, cujo trabalho não pode ser citado aqui, devido a limitações de espaço.

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	<li>Grimm, D., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+virus+evolution+to+vector+revolution:+use+of+naturally+occurring+serotypes+of+adeno-associated+virus+(AAV)+as+novel+vectors+for+human+gene+therapy.">From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy.</a> Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).</li><li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+methods+for+gene+transfer+vectors+based+on+adeno-associated+virus+serotypes.">Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes.</a> Methods. 28, 146-157 (2002).</li><li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses.">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).</li><li>Muller, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors.">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).</li><li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism:+the+adeno-associated+virus+display.">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).</li><li>Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"humanized"+green+fluorescent+protein+cDNA+adapted+for+high-level+expression+in+mammalian+cells.">A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells.</a> J. Virol. 70, 4646-4654 (1996).</li><li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+the+adeno-associated+virus+type+2+(AAV-2)+capsid:+epitope+mapping+and+identification+of+capsid+domains+involved+in+AAV-2-cell+interaction+and+neutralization+of+AAV-2+infection.">Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection.</a> J. Virol. 74, 9281-9293 (2000).</li><li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatality+in+mice+due+to+oversaturation+of+cellular+microRNA/short+hairpin+RNA+pathways.">Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways.</a> Nature. 441, 537-541 (2006).</li><li>Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unrestricted+hepatocyte+transduction+with+adeno-associated+virus+serotype+8+vectors+in+mice.">Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice.</a> J. Virol. 79, 214-224 (2005).</li><li>Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+shuffling+of+adeno-associated+virus+yields+functionally+diverse+viral+progeny.">DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny.</a> Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).</li><li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+selection+of+shuffled+AAV+genomes:+a+new+strategy+for+producing+targeted+biological+nanoparticles.">Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles.</a> Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).</li><li>Ward, P., Walsh, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+AAV+Cap+sequences+alter+gene+transduction.">Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction.</a> Virology. 386, 237-248 (2009).</li><li>Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myocardium+tropic+adeno-associated+virus+(AAV)+evolved+by+DNA+shuffling+and+in+vivo+selection.">A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).</li><li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+engineering+of+a+gene+therapy+vector:+directed+evolution+of+adeno-associated+virus.">Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus.</a> J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).</li><li>Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+adeno-associated+virus+yields+enhanced+gene+delivery+vectors.">Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors.</a> Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).</li><li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotypes:+vector+toolkit+for+human+gene+therapy.">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).</li><li>Kwon, I., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+gene+delivery+vectors:+molecular+engineering+and+evolution+of+adeno-associated+viral+vectors+for+enhanced+gene+transfer.">Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer.</a> Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).</li><li>Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+evolution+with+adeno-associated+viral+libraries.">Artificial evolution with adeno-associated viral libraries.</a> Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).</li><li>McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+recombinant+adeno-associated+virus+(scAAV)+vectors+promote+efficient+transduction+independently+of+DNA+synthesis.">Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis.</a> Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).</li></ol>

Todos os autores declaram que não têm nada a revelar.

Aqui, nós descrevemos essenciais etapas experimentais e diretrizes para AAV capsídeo de engenharia através da família de DNA shuffling e para a evolução em células ou em animais. Em essência, estes protocolos são versões padronizadas de os procedimentos relatados, primeiro dentro do campo AAV em 2008 3. Enquanto uma onda de estudos de acompanhamento por outros relataram por exemplo, inúmeras modificações, 10-13, nossas versões atuais representam estratégias básicas que rend...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Invitrogen </td><td> 18068-015 </td></tr><tr><td> Polietilenoimina (PEI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408727 </td></tr><tr><td> As enzimas de restrição </td><td> NEB </td><td> Vário </td></tr><tr><td> DNA-ligase de T4 </td><td> NEB </td><td> M0202T </td></tr><tr><td> Gel extraction kit </td><td> Qiagen </td><td> 28704 </td></tr><tr><td> Phusion Kit polimerase II </td><td> Finnzymes (NEB) </td><td> F-540S </td></tr><tr><td> HotStar Kit polimerase Hifi </td><td> Qiagen </td><td> 202602 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Finnzymes (NEB) </td><td> F-540S (parte do kit) </td></tr><tr><td> EDTA (25 mM) </td><td> Invitrogen </td><td> 18068-015 (parte do kit) </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Roth </td><td> 4855,2 </td></tr><tr><td> Ampicilina sal de sódio </td><td> Roth </td><td> K029.2 </td></tr><tr><td> dNTPs (10 mM, 100 ul) </td><td> Invitrogen </td><td> 18427013 </td></tr><tr><td> Iodixanol (OptiPrep) </td><td> Axis-Shield </td><td> 1114739 </td></tr><tr><td> Phenolred </td><td> Merck </td><td> 107241 </td></tr><tr><td> Kit de preparação plasmídeo mega- </td><td> Qiagen </td><td> 12181 </td></tr><tr><td> Ultracentrífuga </td><td> Beckman-Coulter </td><td> Optima L90K </td></tr><tr><td> Seal-Quick tubos de centrífuga </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 342414 </td></tr><tr><td> Unidade de Eletroporação </td><td> Bio-Rad </td><td> GenePulserXcell </td></tr><tr><td> Termociclador </td><td> Eppendorf </td><td> Vapo Protect </td></tr><tr><td> Bloco de aquecimento </td><td> BIOER </td><td> MB-102 </td></tr><tr><td> Microscópio de fluorescência </td><td> Olimpo </td><td> IX81 </td></tr><tr><td> Analisador FACS </td><td> Beckman-Coulter </td><td> Cytomics FC500 MLP </td></tr><tr><td> MegaX DH10B células T1R </td><td> Invitrogen </td><td> C640003 </td></tr><tr><td> Benzonase </td><td> Merck </td><td> 101695 </td></tr><tr><td> Adenovírus-5 </td><td> ATCC </td><td> VR-5 </td></tr><tr><td> pBluescript II KS (+) do plasmídeo </td><td> Stratagene </td><td> 212207 </td></tr><tr><td> cap5F (Pac site que em amarelo, CAP5-sequências específicas em negrito): GACTCTTAATTAACAGGT ATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC </td><td> IDTDNA </td><td> Cartilha personalizado </td></tr><tr><td> cap5R (Asc site que em verde, CAP5-sequências específicas em negrito): GTGAGGGCGCGCC TTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC </td><td> IDTDNA </td><td> Cartilha personalizado </td></tr></tbody></table>

engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (aav) gene therapy vectors via dna family shuffling

Virais adeno-associados (AAV) vectores representam alguns dos veículos mais potentes e promissora para a transferência de gene terapêutico humano devido a uma combinação única de propriedades benéficas 1. Estes incluem o apathogenicity dos vírus tipo selvagem subjacentes e as metodologias altamente avançadas para a produção de título elevado, de elevada pureza e grau clínico vectores recombinantes 2. Uma outra vantagem particular do sistema de AAV sobre outros vírus é a disponibilidade de uma variedade de ocorrência natural serotipos que diferem em propriedades essenciais ainda podem ser facilmente concebido como vectores utilizando um protocolo comum 1,2. Além disso, um número de grupos incluindo o nosso próprio recentemente desenvolvido estratégias para usar estes vírus naturais como modelos para a criação de vectores sintéticos que ou se combinam os activos de serotipos de entrada múltiplas, ou que melhoram as propriedades de um único isolado. As respectivas tecnologias para alcançar essas metas are ambas as famílias de DNA baralhar 3, isto é, a fragmentação de vários genes de AAV cápside, seguida da sua re-montagem com base em homologias parciais (tipicamente&gt; 80% para a maioria dos serotipos de AAV), ou de exibição de péptidos 4,5, inserção ou seja, de geralmente sete aminoácidos na um circuito exposta da cápside viral em que o peptídeo idealmente medeia re-direccionamento para um tipo de célula desejado. Para o máximo sucesso, ambos os métodos são aplicados de uma forma de alto rendimento em que os protocolos são-up escalado para produzir bibliotecas de cerca de um milhão distintas variantes do capsídeo. Cada clone é então constituído por uma combinação única de numerosos vírus parentais (ADN abordagem baralhar) é ou contém um péptido distintivo dentro da espinha dorsal mesmo viral (abordagem de exibição de péptidos). O passo final subsequente é iterativo selecção de uma biblioteca em células alvo, a fim de enriquecer para cápsides individuais que preenchem mais ou, idealmente, todos os requisitos do processo de selecção. O último de preferência penteines pressão positiva, como o crescimento de um tipo de célula certa de interesse, com seleção negativa, para a eliminação exemplo de todos os capsídeos reagem com anticorpos anti-AAV. Esta combinação aumenta a probabilidade de que cápsides sintéticos sobreviventes a selecção correspondem às necessidades da aplicação dada de uma forma que, provavelmente, não têm sido encontrados em qualquer AAV que ocorre naturalmente isolar. Aqui, vamos nos concentrar no método DNA família baralhar como teórica e experimentalmente mais desafiador das duas tecnologias. Descrevemos e demonstrar todas as etapas essenciais para a geração e seleção de bibliotecas embaralhadas AAV (Fig. 1), e depois discutir as armadilhas e os aspectos críticos dos protocolos de que é preciso estar ciente, a fim de ter sucesso com a evolução molecular de AAV.

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Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Nós demonstramos a base técnica para projetar e evoluir molecularmente sintéticos virais adeno-associados (AAV) vetores de terapia genética através de DNA da família baralhar. Além disso, fornecer orientações gerais e exemplos representativos para a selecção ea análise de individuais cápsides quiméricos com propriedades melhoradas sobre células alvo em cultura ou em ratinhos.

Engenharia e Evolução da Synthetic vírus adeno-associado (AAV) Gene vetores de terapia através de DNA Família Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

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