Gli autori ringraziano il supporto eccezionale di loro laboratorio, i membri del team e il lavoro del cluster di eccellenza CellNetworks all&#39;Università di Heidelberg così come dalla Chica e Heinz Schaller (CHS) fondazione. Apprezziamo che l&#39;evoluzione molecolare AAV via DNA shuffling famiglia è diventata un campo molto attivo dato che la nostra prima pubblicazione, tre anni fa e quindi chiedere scusa a tutti gli autori di pubblicazioni rilevanti il ​​cui lavoro non potevano essere citati qui a causa di vincoli di spazio.

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	<li>Grimm, D., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+virus+evolution+to+vector+revolution:+use+of+naturally+occurring+serotypes+of+adeno-associated+virus+(AAV)+as+novel+vectors+for+human+gene+therapy.">From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy.</a> Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).</li><li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+methods+for+gene+transfer+vectors+based+on+adeno-associated+virus+serotypes.">Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes.</a> Methods. 28, 146-157 (2002).</li><li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses.">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).</li><li>Muller, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors.">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).</li><li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism:+the+adeno-associated+virus+display.">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).</li><li>Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"humanized"+green+fluorescent+protein+cDNA+adapted+for+high-level+expression+in+mammalian+cells.">A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells.</a> J. Virol. 70, 4646-4654 (1996).</li><li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+the+adeno-associated+virus+type+2+(AAV-2)+capsid:+epitope+mapping+and+identification+of+capsid+domains+involved+in+AAV-2-cell+interaction+and+neutralization+of+AAV-2+infection.">Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection.</a> J. Virol. 74, 9281-9293 (2000).</li><li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatality+in+mice+due+to+oversaturation+of+cellular+microRNA/short+hairpin+RNA+pathways.">Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways.</a> Nature. 441, 537-541 (2006).</li><li>Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unrestricted+hepatocyte+transduction+with+adeno-associated+virus+serotype+8+vectors+in+mice.">Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice.</a> J. Virol. 79, 214-224 (2005).</li><li>Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+shuffling+of+adeno-associated+virus+yields+functionally+diverse+viral+progeny.">DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny.</a> Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).</li><li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+selection+of+shuffled+AAV+genomes:+a+new+strategy+for+producing+targeted+biological+nanoparticles.">Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles.</a> Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).</li><li>Ward, P., Walsh, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+AAV+Cap+sequences+alter+gene+transduction.">Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction.</a> Virology. 386, 237-248 (2009).</li><li>Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myocardium+tropic+adeno-associated+virus+(AAV)+evolved+by+DNA+shuffling+and+in+vivo+selection.">A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).</li><li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+engineering+of+a+gene+therapy+vector:+directed+evolution+of+adeno-associated+virus.">Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus.</a> J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).</li><li>Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+adeno-associated+virus+yields+enhanced+gene+delivery+vectors.">Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors.</a> Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).</li><li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotypes:+vector+toolkit+for+human+gene+therapy.">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).</li><li>Kwon, I., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+gene+delivery+vectors:+molecular+engineering+and+evolution+of+adeno-associated+viral+vectors+for+enhanced+gene+transfer.">Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer.</a> Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).</li><li>Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+evolution+with+adeno-associated+viral+libraries.">Artificial evolution with adeno-associated viral libraries.</a> Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).</li><li>McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+recombinant+adeno-associated+virus+(scAAV)+vectors+promote+efficient+transduction+independently+of+DNA+synthesis.">Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis.</a> Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).</li></ol>

Tutti gli autori dichiarano di non avere nulla da rivelare.

Qui, abbiamo delineato i passaggi essenziali e le linee guida sperimentali per la AAV capside engineering attraverso la famiglia rimescolamento del DNA e per l&#39;evoluzione in cellule o negli animali. In sostanza, questi protocolli sono versioni standard delle procedure che per primi hanno riportato all&#39;interno del campo AAV nel 2008 3. Mentre una raffica di follow-up da altri studi hanno riportato numerose modifiche ad esempio, 10-13, i siti attuali rappresentano strategie fondament...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> DNasi I </td><td> Invitrogen </td><td> 18068-015 </td></tr><tr><td> Polietilenimmina (PEI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408727 </td></tr><tr><td> Gli enzimi di restrizione </td><td> NEB </td><td> Vario </td></tr><tr><td> DNA ligasi T4 </td><td> NEB </td><td> M0202T </td></tr><tr><td> Gel kit di estrazione </td><td> Qiagen </td><td> 28704 </td></tr><tr><td> Phusion polimerasi II Kit </td><td> Finnzymes (NEB) </td><td> F-540S </td></tr><tr><td> HotStar Hifi polimerasi Kit </td><td> Qiagen </td><td> 202602 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Finnzymes (NEB) </td><td> F-540S (parte del kit) </td></tr><tr><td> EDTA (25 mM) </td><td> Invitrogen </td><td> 18068-015 (parte del kit) </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Roth </td><td> 4.855,2 </td></tr><tr><td> Ampicilin sale di sodio </td><td> Roth </td><td> K029.2 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mM, 100 pl) </td><td> Invitrogen </td><td> 18427013 </td></tr><tr><td> Iodixanolo (OptiPrep) </td><td> Axis-Shield </td><td> 1114739 </td></tr><tr><td> Phenolred </td><td> Merck </td><td> 107241 </td></tr><tr><td> Plasmide kit di preparazione mega </td><td> Qiagen </td><td> 12181 </td></tr><tr><td> Ultracentrifuga </td><td> Beckman-Coulter </td><td> Optima L90K </td></tr><tr><td> Quick-Seal provette da centrifuga; </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 342414 </td></tr><tr><td> Elettroporazione unità </td><td> Bio-Rad </td><td> GenePulserXcell </td></tr><tr><td> Termociclatore </td><td> Eppendorf </td><td> Vapo Protect </td></tr><tr><td> Riscaldamento blocco </td><td> BIOER </td><td> MB-102 </td></tr><tr><td> Microscopio a fluorescenza </td><td> Olimpo </td><td> IX81 </td></tr><tr><td> FACS analizzatore </td><td> Beckman-Coulter </td><td> Cytomics FC500 MLP </td></tr><tr><td> MegaX DH10B T1R cellule </td><td> Invitrogen </td><td> C640003 </td></tr><tr><td> Benzonase </td><td> Merck </td><td> 101695 </td></tr><tr><td> Adenovirus-5 </td><td> ATCC </td><td> VR-5 </td></tr><tr><td> pBlueScript II KS (+) plasmide </td><td> Stratagene </td><td> 212207 </td></tr><tr><td> cap5F (Pac sito che ho in giallo, CAP5 specifiche sequenze in grassetto): GACTCTTAATTAACAGGT ATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC </td><td> IDTDNA </td><td> Primer personalizzato </td></tr><tr><td> cap5R (Asc sito che ho in verde, CAP5 specifiche sequenze in grassetto): GTGAGGGCGCGCC TTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC </td><td> IDTDNA </td><td> Primer personalizzato </td></tr></tbody></table>

engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (aav) gene therapy vectors via dna family shuffling

Virali adeno-associati (AAV) vettori rappresentano alcuni dei veicoli più potenti e promettenti per il trasferimento del gene terapeutico umano a causa di una combinazione unica di proprietà benefiche 1. Questi includono la apathogenicity dei virus di tipo selvatico sottostanti e le metodologie più avanzate per la produzione di alta titolo di elevata purezza e vettori ricombinanti clinico-grado 2. Un ulteriore vantaggio particolare del sistema di AAV su altri virus è la disponibilità di una ricchezza di natura sierotipi che differiscono nelle proprietà essenziali ancora possono essere facilmente costruiti come vettori usando un protocollo comune 1,2. Inoltre, una serie di gruppi tra cui il nostro ha recentemente messo a punto le strategie per utilizzare questi virus naturali come modelli per la creazione di vettori sintetici, che combinano sia i beni di sierotipi di input, o che esaltano le proprietà di un singolo isolato. Le rispettive tecnologie per raggiungere questi obiettivi are sia DNA shuffling famiglia 3, ossia la frammentazione di vari geni del capside di AAV seguita dalla loro rimontaggio basato su omologie parziali (tipicamente&gt; 80% per la maggior parte sierotipi di AAV), o visualizzare peptide 4,5, inserimento cioè di solito in sette aminoacidi un ciclo esposta del capside virale in cui il peptide idealmente media ri-targeting per un tipo cellulare desiderato. Per il massimo successo, entrambi i metodi sono applicati in un high-throughput di moda in cui i protocolli sono up-scalati per produrre librerie di circa un milione di varianti distinte del capside. Ciascun clone è quindi composto da una combinazione unica di numerosi virus parentale (DNA shuffling approccio) o contiene un peptide distintivo all&#39;interno della stessa dorsale virale (approccio visualizzazione peptide). Il successivo passo finale è iterativa selezione di tale libreria sulle cellule bersaglio, al fine di arricchire per capsidi individuali che soddisfano la maggior parte o idealmente tutti i requisiti del processo di selezione. Quest&#39;ultimo preferibilmente pettineines pressione positiva, come la crescita su un tipo di cellula certo interesse, con la selezione negativa, per esempio, l&#39;eliminazione di tutti i capsidi che reagiscono con gli anticorpi anti-AAV. Questa combinazione aumenta la probabilità che capsidi sintetici sopravvissuti alla selezione corrispondono alle esigenze del data applicazione in un modo che probabilmente non sono stati trovati in ogni naturale AAV isolare. Qui, ci concentriamo sul metodo famiglia DNA shuffling come teoricamente e sperimentalmente più impegnativo delle due tecnologie. Descriviamo e dimostrare tutti i passi essenziali per la generazione e la selezione di librerie mischiate AAV (Fig. 1), e poi discutere le insidie ​​e gli aspetti critici dei protocolli che bisogna essere a conoscenza al fine di avere successo con l&#39;evoluzione molecolare AAV.

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Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Dimostriamo la tecnica di base per progettare molecolare ed evolvere sintetici virale adeno-associati (AAV) vettori di terapia genica attraverso la famiglia shuffling DNA. Inoltre, fornire linee guida generali ed esempi rappresentativi per la selezione e l&#39;analisi delle singole capsidi chimerici con proprietà migliorate sulle cellule bersaglio in coltura o nei topi.

Ingegneria ed evoluzione del sintetico virus adeno-associato (AAV) Vettori Terapia genica attraverso la famiglia Shuffling DNA

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

engineering-evolution-synthetic-adeno-associated-virus-aav-gene

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

28.2K Views.  Heidelberg University. Dimostriamo la tecnica di base per progettare molecolare ed evolvere sintetici virale adeno-associati (AAV) vettori di terapia genica attraverso la famiglia shuffling DNA. Inoltre, fornire linee guida generali ed esempi rappresentativi per la selezione e l'analisi delle singole capsidi chimerici con proprietà migliorate sulle cellule bersaglio in coltura o nei topi.