Agradecemos o apoio do Reino Unido National Institute for Health Research, o Dr. Hadwen confiança para Pesquisa Humana, o financiamento do Reino Unido caridade líder investigação médica exclusivamente técnicas de pesquisa sem animais para substituir a experimentação animal, eo Wellcome Trust (Grant 089.215). Reconhecemos também a Novartis Pharmaceuticals UK Ltd (educacional irrestrita de subvenção).

<ol>
	<li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BSAC+standardized+disc+susceptibility+testing+method+(version+8).">BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8).</a> J. Antimicrob. Chemother. 64, 454-489 (2009).</li><li>Worlitzsch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients.">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> J. Clin. Invest. 109, 317-325 (2002).</li><li>Smith, A. L., Fiel, S. B., Mayer-Hamblett, N., Ramsey, B., Burns, J. 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Microbiol. 43, 5085-5090 (2005).</li><li>Fung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+mucin-containing+synthetic+growth+medium+mimicking+cystic+fibrosis+lung+sputum.">Gene expression of Pseudomonas aeruginosa in a mucin-containing synthetic growth medium mimicking cystic fibrosis lung sputum.</a> J. Med. Microbiol. 59, 1089-1100 (2010).</li><li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BSAC+standardized+disc+susceptibility+testing+method+(version+8).">BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8).</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 64, 454-489 (2009).</li><li>Rybtke, M. 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Bacteriol. 189, 4964-4968 (2007).</li><li>Winstanley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+introduced+genomic+prophage+islands+are+critical+determinants+of+in+vivo+competitiveness+in+the+Liverpool+Epidemic+Strain+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa.</a> Genome Res. 19, 12-23 (2009).</li><li>Carter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subtype+of+a+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+epidemic+strain+exhibits+enhanced+virulence+in+a+murine+model+of+acute+respiratory+infection.">A subtype of a Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis epidemic strain exhibits enhanced virulence in a murine model of acute respiratory infection.</a> J. Infect. Dis. 202, 935-942 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste estudo foi utilizado um novo modelo in vitro com base em ASM para replicar P. aeruginosa condições de biofilme dentro do pulmão 4 CF. O modelo foi modificado com sucesso em pequena escala, o teste de alto rendimento de agentes antimicrobianos. Os passos críticos deste ensaio são: <ol><li> Preparação consistente dos meios de comunicação ASM e esterilidade manutenção. Temos dedicado longas horas para optimizar a forma em que cada componente é adicionado para obter resultados reprodutíveis de cada vez. A filtração do ASM é lento, mas é preferível a autoclavagem, o que pode danificar o componente de mucina. Isso não se recomenda a adição de antibióticos, como sugerido por outros 11 porque este pode impor consideráveis ​​pressões selectivas, mutações de unidade, induzem a lise profago 16 e alterar significativamente a expressão de vários genes bacterianos. </li><li> O ensaio deve ser optimizada de acordo com o volume of ASM utilizado. Velocidades de agitação são aumentadas para volumes menores e menor biofilme ciclo de vida é observado. </li></ol> Uma aplicação óbvia do modelo de biofilme em pequena escala ASM é a determinação mais realista do biofilme susceptibilidades antimicrobianas (BSMIC 90). Nichos anaeróbios e microaerófilos estão presentes no pulmão CF e há evidências de que o oxigénio é limitada no fundo de biofilmes madura 2, 17. Aqui demonstramos que 10/14 P. clínica aeruginosa de paciente com FC apresentam um escarro (4 - ≥ vezes 128) considerável diminuição na sensibilidade à tobramicina em condições de microaerofilia em ASM. Os resultados deste estudo sugerem que os antibióticos, tais como a tobramicina, pode ser menos eficaz contra P. infecções aeruginosa no pulmão CF do que os indicados por métodos de ensaio convencionais susceptibilidade. Estes resultados refletem estudos anteriores sobre a susceptibilidade antimicrobiana de biofilmes 10. Pequeno-escala ensaios ASM, assim, proporcionar uma plataforma de transferência simples de alta para gerar dados significativos de susceptibilidade aos antimicrobianos para informar melhor as decisões terapêuticas. O ensaio é limitada da mesma maneira como os testes de susceptibilidade aos antibióticos convencionais em que as colónias únicas são escolhidas para o rastreio que não pode ser representativa de toda a população. No entanto, acreditamos que uma abordagem (i) utilizando superfície não-crescimento do biofilme em anexo e (ii) aplicáveis ​​a condições microaerofílicas, representa uma alternativa clara e uma melhoria potencial aos métodos existentes. Concluímos que este ensaio é de um modelo adequado para estudar p biofilme populações aeruginosa. Mais testes em ambientes clínicos seria verificar se as suscetibilidades aos antibióticos baseado em biofilme cresceu P. aeruginosa pode levar a diferentes opções de antibióticos com potencial melhora nos resultados microbiológicos e clínicos. Estudos similares com modelos clássicos de biofilme demonstraram que valores BSMIC levarpara diferentes recomendações para o tratamento antibiótico 5,17. Além dos testes para a eficácia dos agentes anti-bacterianos, o sistema ASM representa uma alternativa barata, simples e reprodutível de modelos animais para estudos como os que visam a compreensão da diversificação de P. populações aeruginosa. Observamos grande heterogeneidade em populações naturais de P. aeruginosa recuperado de paciente com FC escarros 18, 19. Diversificação fenotípica e genotípica semelhante pode ser observada durante o crescimento em ASM 4 (e os nossos dados não publicados), tornando-se uma atraente modelo in vitro das condições pulmonares FC. A relativa simplicidade do modelo ASM torna mais fácil para conceber experiências de longo prazo de adaptação como objectivo, por exemplo, no controlo dos efeitos dos antibióticos ou outras tensões sobre P. divergência população aeruginosa. Além disso, outros agentes patogénicos bacterianos podem ser cultivadas emASM. Por exemplo, Fouhy et al. Usaram ASM 2007 para estudar a formação de biofilme por S. maltophillia 20.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DNA de esperma de peixe </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 74782 </td></tr><tr><td> Mucina de porco estômago, do tipo II </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2378 </td></tr><tr><td> L-Alanina </td><td> Acros Organics </td><td> 102830250 </td></tr><tr><td> L-Arginina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5006 </td></tr><tr><td> L mono-hidrato de (+)-Asparagina </td><td> Acros Organics </td><td> 175271000 </td></tr><tr><td> L de ácido (+)-aspártico </td><td> Acros Organics </td><td> 105041000 </td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td> Sigma-Adrich </td><td> 168149 </td></tr&gt; <tr><td> L (+)-ácido glutâmico </td><td> Acros Organics </td><td> 156211000 </td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3126 </td></tr><tr><td> Glycine </td><td> Acros Organics </td><td> 220911000 </td></tr><tr><td> L-Histidina </td><td> Sigma-Adrich </td><td> H8000 </td></tr><tr><td> L-Isoleucina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I2752 </td></tr><tr><td> L-leucina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L8000 </td></tr><tr><td> L monocloridrato (+)-lisina </td><td> Acros Organics </td><td> 125222500 </td></tr><tr><td> L-Metionina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9625 </td></tr><tr><td> L-fenilalanina </td><td> Acros Organics </td><td> 130310250 </td></tr><tr><td> L-Prolina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0380 </td></tr><tr><td> L-serina </td><td> Acros Organics </td><td> 132660250 </td></tr><tr><td> L-Treonina </td><td> Acros Organics </td><td> 138930250 </td></tr><tr><td> L (-)-Triptofano </td><td> Acros Organics </td><td> 140590250 </td></tr><tr><td> L-Tyrosine </td><td> Acros Organics </td><td> 140641000 </td></tr><tr><td> L-Valina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> V0500 </td></tr><tr><td> Ácido dietileno </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 32318 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S/3160/60 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> BDH </td><td> BDH0258 </td></tr><tr><td&gt; KOH </td><td> BDH </td><td> BDH0262 </td></tr><tr><td> A gema de ovo emulsão </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 17148 </td></tr><tr><td> ME 2 bomba de vácuo do diafragma </td><td> VACUUBRAND </td><td> 696126 </td></tr><tr><td> Filtros Steritop (tamanho de poro: 0,22, tamanho do pescoço: 45 mm) </td><td> Millipore </td><td> SCGPT10RE </td></tr><tr><td> Luria-Bertani médio </td><td> Sigma </td><td> L2897 </td></tr><tr><td> Placas de 96 poços de microtítulo </td><td> Sarstedt </td><td> 82,1581 </td></tr><tr><td> De 24 poços de cultura de tecidos tratados placas </td><td> Iwaki </td><td> 3820-024 </td></tr><tr><td> Geração CampyGen pacotes de gás </td><td> Oxoid </td><td> CN0025 </td></tr><tr><td> Câmara de microaerofilia </td><td> Oxoid </td><td> HP0011 </td></tr><tr><td> Tobramicina sulfato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1783 </td></tr><tr><td> Celulase, a partir de Aspergillus niger </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 22178 </td></tr><tr><td> Resazurina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 199303 </td></tr><tr><td> 2 0 Citrate.H </td><td> BDH </td><td> BDH0288 </td></tr><tr><td> Fluostar omega leitor de microplacas </td><td> BMG-Labtech </td><td> SPECTROstar Omega </td></tr></tbody></table>

use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung

Há uma crescente preocupação com a relevância do teste de susceptibilidade aos antimicrobianos in vitro quando aplicado a amostras de P. aeruginosa de fibrose cística (FC) dos pacientes. Os métodos existentes dependem única ou a poucas isolados cresceram em aerobiose e planktonically. Predeterminados cut-off são usados ​​para definir se as bactérias são sensíveis ou resistentes a qualquer antibiótico administrado 1. No entanto, durante infecções pulmonares crônicas na CF, P. populações aeruginosa existir em biofilmes e há evidências de que o ambiente é em grande parte microaerofílica 2. A diferença gritante em condições entre bactérias no pulmão e os que durante os testes de diagnóstico foi posta em causa a relevância, fiabilidade e até mesmo de estes 3 ​​testes. Médio de expectoração artificial (ASM) é um meio de cultura contendo os componentes da CF expectoração paciente, incluindo aminoácidos, a mucina e DNA livre. P. aeruginosa &lt;/ Em&gt; crescimento no crescimento imita ASM durante infecções CF, com a formação de estruturas auto-agregação de biofilme e divergência população 4,5,6. O objetivo deste estudo foi desenvolver um teste de microtitulação placa para estudar a susceptibilidade antimicrobiana de P. aeruginosa com base no crescimento em ASM, que é aplicável a ambas as condições microaerofílicas e aeróbicas. Um ensaio de ASM foi desenvolvido em um formato de placa de microtitulação. P. biofilmes aeruginosa foram autorizados a desenvolver durante 3 dias antes da incubação com agentes antimicrobianos em diferentes concentrações de 24 horas. Após interrupção do biofilme, a viabilidade das células foi medida por coloração com resazurina. Este ensaio foi utilizado para determinar a concentração mínima inibitória séssil célula (SMIC) de tobramicina para 15 p diferente aeruginosa em condições aeróbias e microaerófilos e valores SMIC foram comparados com aqueles obtidos com o crescimento em caldo padrão. Embora se verifiquealguma evidência de aumento de valores de CIM para isolados cultivados em ASM, quando comparados a suas contrapartes planctônicas, as maiores diferenças foram encontradas com bactérias testadas em condições de microaerofilia, que mostraram uma resistência muito aumentada até um&gt; 128 vezes, para tobramicina no sistema ASM quando em comparação com os ensaios realizados em condições aeróbias. A falta de associação entre os métodos atuais de testes de suscetibilidade e evolução clínica tem questionado a validade dos métodos atuais 3. Vários modelos in vitro têm sido utilizados previamente para estudar p biofilmes aeruginosa 7, 8. No entanto, estes métodos dependem biofilmes de superfície em anexo, enquanto que os biofilmes ASM assemelham aos observados no pulmão CF 9. Além disso, a concentração de oxigénio reduzido no muco foi mostrado para alterar o comportamento de P. aeruginosa 2 e afetar a susceptibilidade a antibióticos 10. Portanto using ASM em condições de microaerofilia pode proporcionar um ambiente mais realista para se estudar a susceptibilidade antimicrobiana.

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Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Testes de susceptibilidade antimicrobiana Atualmente, o diagnóstico baseia-se no crescimento planctônico dos isolados em ricas em nutrientes, condições aeróbicas. Aqui, nós utilizamos um meio de escarro alternativa artificial para estudar susceptibilidade antimicrobiana de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa em ambas as condições de aerobiose e microaerofilia mais representativas do pulmão da fibrose cística.

Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Em condições mais relevantes para o Pulmão Fibrose Cística

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

use-artificial-sputum-medium-to-test-antibiotic-efficacy-against

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

32.4K visualizações.  University of Liverpool. Testes de susceptibilidade antimicrobiana Atualmente, o diagnóstico baseia-se no crescimento planctônico dos isolados em ricas em nutrientes, condições aeróbicas. Aqui, nós utilizamos um meio de escarro alternativa artificial para estudar susceptibilidade antimicrobiana de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa em ambas as condições de aerobiose e microaerofilia mais representativas do pulmão da fibrose cística.

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