Os autores gostariam de agradecer os EUA Army Medical Research e Material Command (Números Grant W81XWH-09-1-0386 e W81XWH-10-1-0806) para apoio financeiro e Shawn Dr. Rigby pela Universidade do Estado Iowa Facilidade de Citometria de Fluxo para sua assistência técnica especializada.

1. Colheita macrófagos alveolares (AMɸ) do mouse usando lavagem pulmonar <ol><li> Use equipamento de proteção individual (EPI), tais como jaleco, luvas descartáveis, e proteção ocular adequada. </li><li> Prepare completa AMɸ (cAMɸ) médio antes do início da colheita. Adicionar 2,5 mL de penicilina / estreptomicina (pen / strep) solução, 250 uL de β-mercaptoetanol (2-mercaptoetanol), e 25 mL de calor de soro fetal inactivado bovino (FBS) a 222,25 ml de Modificado Dulbelcco de Eagle Médium (DMEM). Filtro-esterilizar cAMɸ média usando um 0,2 uM de poro de tamanho filtro superior garrafa sob vácuo. </li><li> Euthanize um rato saudável por asfixia CO 2 em uma câmara de eutanásia. Embora um rato C57BL / 6 (6-8 semanas de idade) foi utilizado para os fins do presente projecto, esta técnica de lavagem pulmonar pode ser realizada em qualquer estirpe de rato. Usando um cilindro de gás comprimido, deixe o fluxo de gás para a câmara de 1 min antes de colocar o mouse na châmbar para assegurar que a câmara está totalmente carregada com CO 2. Colocar o rato na câmara por pelo menos um minuto a eutanásia no rato. Além disso, desangrar cada rato através de punção cardíaca como um método físico para confirmar a morte do rato como descrito em 1.4. </li><li> Lay rato na sua parte traseira (lado dorsal), spray com etanol a 70%, localizar o esterno e, a um ângulo de 30 graus a partir do abdómen, inserir uma agulha de calibre 23 (ligada a uma seringa de 1 mL) cerca de 50 mm para dentro da cavidade torácica . Com a colocação adequada da agulha, que deveria ser possível recolher entre 0,4 a 1 mL de sangue, dependendo do tamanho do rato. Examine o animal para a cessação dos sinais vitais. </li><li> Lugar do mouse sobre bancada do laboratório para que ele esteja mentindo sobre o seu abdome (lado ventral). Pulverização do rato com etanol a 70% para esterilizar o ambiente de trabalho. Belisque a pele da metade para baixo da coluna do mouse. Com uma tesoura de dissecção que foram esterilizadas com etanol 70%, fazer uma pequena incisão através da pele. &lt;/ Li&gt; <li> Agarrar a pele em ambos os lados da incisão e puxar a pele em direcções opostas ao longo do eixo crânio-caudal do rato. Quando feito correctamente, a pele irá ser removido da carcaça subjacente. </li><li> O pescoço do mouse deve agora mostrar músculos expostos e glândulas. Corte com cuidado o tecido e puxe-o para o anterior do mouse com a pinça, expondo assim a laringe, traquéia, esôfago e do mouse. Evitar o corte da veia jugular ou da artéria carótida. </li><li> A traqueia é agora visível e é identificável como o tecido com anéis cartilaginosos em torno dele. Delicadamente segurar a traqueia com uma pinça e suavemente levantar e separar a traqueia a partir do esófago, que está localizado no lado dorsal. </li><li> Fazer uma pequena incisão anterior para onde um detém a traqueia, mas posterior para a laringe. A incisão deve ser feita a cerca de ângulo de 45 °. Além disso, não completamente transect a traquéia, pois isso irá impedi-lo de retracção ema cavidade do corpo. </li><li> Encher uma seringa cc 1 equipado com um cateter de gato Tom com PBS estéril, em preparação para inserir o cateter para dentro do lúmen da traqueia. Segure a traquéia usando uma pinça e com a mão segure o cateter perto da ponta para aumentar o controle e gentilmente insira-o no local da incisão traqueal. Insira cuidadosamente cateter na traquéia cerca de 20 mm. Agarrar a traqueia que é em torno do tubo de cateter, libertando a outra mão. </li><li> Utilizando uma seringa de 1 ml, equipado com o cateter, suavemente infundir 0,75 mL de temperatura ambiente, PBS estéril para dentro dos pulmões e, em seguida, aspirar cuidadosamente a parte de trás PBS para a seringa. Repita este processo três vezes, enquanto externamente massageando o peito. Desligue a seringa do cateter e dispensar o fluido de lavagem para um tubo de centrífuga de 15 mL. Após o enchimento da seringa com 0,75 mL de PBS fresco e voltar a ligar a seringa ao cateter, repetir os passos 1,9 e 1,10 duas vezes para cada rato. Recuperação de fluido pode ser parcial, a obtenção de menos do que o volume infundido. Se recolher células a partir de mais de um rato, colocar o tubo 15 mL com as células colhidas em gelo até que todas as lavagens de pulmão foram realizados. </li></ol> 2. Processamento de Colheita lavagem pulmonar AMɸ <ol><li> Centrifugar fluido lavagem pulmonar a 250 X g durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Utilizando uma técnica asséptica, decante o sobrenadante em recipiente adequado de lixo dentro de uma cabine de segurança biológica. Ressuspender o sedimento de células por suavemente raking do tubo de centrifugação através da parte superior de um suporte de tubos de ensaio. Adicionar 1 mL de meio de cAMɸ para ressuspender as células. </li><li> Enumerar as células utilizando um contador de partículas Coulter Z1 por pipetagem de 20 uL de células em 10 mL de Isoton II diluente em Coulter frasco contador. Adicionar 3 a 4 gotas de Zap-oglobin reagente II lítica em frasco, inverter cuidadosamente 3 a 4 vezes e, em seguida, carregar o frasco de amostra para o contador para se obter uma concentração de células. Certifique-se de programar o contador com um fator de diluição de 2 x 10 4 para exibir aconcentração de células como o número de células por mL. </li><li> Diluir as células a 2,5 x 10 5 por mL utilizando meio cAMɸ. </li><li> Pipetar 2 mL de 2,5 x 10 5 células / ml em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços. </li><li> Para enriquecer para AMɸ, pratos de cultura dentro de uma incubar a 37 ° C incubadora humidificada com uma atmosfera de 5% de CO2 durante 6 h para permitir que as células aderem ao fundo do poço. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante a não perturbar as células aderentes. </li><li> Lavar os poços utilizando PBS estéril (cálcio e magnésio livre) para remover as células não aderentes e detritos. Adicionar 2 mL de meio de cAMɸ a cada poço. </li><li> Incubar as células durante a noite no interior de um 37 ° C incubadora humidificada com uma atmosfera de 5% de CO 2 antes da adição de estimulantes. Após este passo de enriquecimento, aproximadamente 87% das células são positivas para o macrófago marcadores CD11b e F4/80 (Figura 2c). </li></ol> 3. A adição de PolyanhydridNanopartículas de e os tratamentos <ol><li> Fabricar nanopartículas através nanoencapsulação polianidrido anti-solvente 15. Neste processo, o polímero é dissolvido em cloreto de metileno (4 ° C a uma concentração de 25 mg / mL) e precipitado em pentano (-20 ° C a uma razão de 1:200 cloreto de metileno: pentano). </li><li> Pesar nanopartículas polianidrido usando esterilizado pesar papel em um equilíbrio que pode medir com precisão quantidades microgramas. Adicionar partículas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Volte a suspender as nanopartículas no gelo frio cAMɸ. Os cálculos são feitos de tal forma que não mais do que 0,3 mL de meio é adicionado a cada poço para obter a concentração desejada de nanopartículas. Manter as partículas resuspensas em gelo até que as nanopartículas são adicionadas ao poço de cultura. </li><li> Antes de adicionar as nanopartículas para as culturas AMɸ, sonicar partículas usando um sonicador de bancada com uma microponta. Esterilizar microtip por pulverização com etanol a 70% e wiping com um Kimwipe estéril antes da sonicação. Sonicar a 10-20 joules por 30 a 45 s, mantendo o tubo em gelo. Observe suspensão de nanopartículas macroscopicamente. Se as partículas não são suficientemente disperso, permitir que a suspensão para definir em gelo durante 1 a 2 min para assegurar que as nanopartículas são abaixo da temperatura de transição vítrea do polímero antes sonicando novamente por 30 a 45 seg. A finalidade deste passo de sonicação é adequadamente dispersar as nanopartículas, como o CPTEG 50:50: nanopartículas CPH tendem a agregar quando expostos a um ambiente aquoso. No entanto, alguns pequenos agregados de nanopartículas ainda pode permanecer na suspensão. </li><li> Suspensão de nanopartículas (adequadamente dispersa) deve ser mantido em gelo e ser usado imediatamente para evitar prematura erosão de superfície ou de agregação. </li><li> Remova as placas de cultura contendo o AMɸ da incubadora e coloque no gabinete de biossegurança. Tilt placa em aproximadamente um ângulo de 45 graus e pipeta fora a quantidade de mediUM que será adicionada à suspensão de nanopartículas (também não deve exceder 0,3 mL). Não perturbe as células aderentes ao retirar do meio. </li><li> Vórtice a suspensão de nanopartículas polianidrido brevemente antes de a adicionar aos poços apropriados. Pipetar a quantidade de suspensão de nanopartículas (não mais do que 0,3 mL) para dentro do poço específico (s), no entanto, não pipetar cima e para baixo para misturar. Esta ação poderia retirar o aderente AMɸ do poço. As partículas irão assentar no fundo do poço, e contactar as células. Para os estudos descritos neste relatório, a concentração final de nanopartículas co-cultivados com o AMɸ foi de 125 ug / mL. Prossiga com os poços e os grupos subseqüentes tratamento desejado. Incluem grupos de controlo positivo e negativo, como único meio e 200 lipopolissacárido ng / mL (LPS) a poços designados. </li><li> Retornar os pratos de cultura para a 37 ° C humidificada incubadora com atmosfera de 5% de CO2 durante 48 h. Os estudos cinéticos em nossa Laboratory demonstraram 48 horas para ser o período de cultura óptima para a avaliação tanto a expressão do marcador de superfície celular ea secreção de citocinas como o que permite um tempo adequado para a transcrição ea síntese de proteínas a ocorrer. Embora os níveis mais elevados de citocinas acumular-se durante um período de cultura prolongada (isto é, 72 hr), avaliando célula expressão do marcador de superfície, neste ponto do tempo pode ser confundida com a contribuição dos níveis elevados de citocinas. As alterações na expressão do marcador de superfície observada pode não ser directamente atribuível à estimulação com as nanopartículas em si. </li></ol> 4. Avaliando AMɸ Ativação utilizando citometria de fluxo <ol><li> Preparar fluorescência-activated separação de células (FACS) tampão (0,1% de azida sódica e 0,1% de albumina de soro bovino (BSA)) em 0,1 M de fosfato salino tamponado (pH 7,4) antes da colheita dos macrófagos banhados que foram co-cultivados com nanopartículas oestimulantes r. </li><li> Prepare soluções de trabalho do tampão de bloqueio e os anticorpos monoclonais. Para preparar o tampão de bloqueio, diluir rato IgG (Sigma) e anti-CD16/32 (eBioscience) a 1 mg / mL e 10 ug / mL, respectivamente, em tampão de FACS. Diluir superfície do painel de anticorpo marcador em tampão FACS, quer o fabricante concentração recomendada ou a concentração do usuário optimizado. Para os resultados apresentados neste trabalho, o painel de marcador de superfície é constituído por anticorpos contra MHC II, CD86, CD40 e CIRE (CD209). Anti-rato de anticorpos contra os marcadores de macrófagos F4/80 e CD11b também estão incluídos no painel para identificar positivamente o fenótipo de macrófagos durante a análise de dados. Cuidados devem ser tomados ao selecionar anticorpos contra moléculas de MHC II, como linhagens puras, muitas vezes diferem em seus haplótipos MHC II. Os anticorpos selecionados devem reagir com os aloantígenos específicos de MHC expressas pelo seu estirpe de ratinhos de interesse. </li><li> Após 48 h de incubação com nanopartículas e / ouestimulantes, os pratos de cultura de células lugar em gelo durante 20 min. Para remover os macrófagos aderentes a partir das placas, raspe poços com um raspador de células de 24 cm. </li><li> Usando uma pipeta de 5 mL serológica, aspirar cuidadosamente as células e meio de cima e para baixo cinco vezes para gerar uma única suspensão celular. Pipetar os conteúdos dos poços individuais em separado 5 tubos de poliestireno mL de modo a não se misturam as células de diferentes tratamentos experimentais. </li><li> Adicionar 2 mL de tampão de FACS a cada tubo. </li><li> Centrifugar os tubos de células a 250 x G a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender suavemente pellet celular em líquido residual por flanqueando os tubos através da parte superior de um suporte de tubos de ensaio. </li><li> A fim de impedir a ligação não específica dos anticorpos monoclonais, adicionam-se 10 uL de tampão de bloqueio (preparado em 4,2) a cada tubo de células. Tubos de vórtice e incubar em gelo durante 30 min. </li><li> Adicionar volume apropriado de diluídos anticorpos monoclonais a cada tubo e incubcomeu no escuro em gelo durante 15 min. Os tubos que contêm amostras a serem analisadas devem receber a combinação de anticorpos do painel polycromatic (optimização anterior de combinação de anticorpos devem ser realizados por laboratórios individuais). Grupos de controlo adicionais devem ser incluídos para configurar correctamente os parâmetros de aquisição no citómetro de fluxo, incluindo um tubo de células que não foram marcadas, e os tubos de compensação que correspondem a células marcadas usando cada cor única separadamente. Para configurar corretamente as portas para a análise por citometria de fluxo, a fluorescência Minus One (FMO) controlos devem ser incluídos durante a aquisição. Controles FMO são células marcadas com todos os anticorpos conjugados com fluorocromo que são utilizados no painel excepto aquele que é substituído pelo seu controlo de isotipo correspondente. Populações positivas e negativas (ie, alíquotas separadas de células tratadas com um estimulante de controlo positivo e apenas meio) deve também ser incluídos na FMO e tubos de controlo de compensação. </li><li&gt; Adicionar 2 mL de tampão de FACS para cada tubo de vórtice, e centrifugar a 250 x G a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em células de fluido residual por flanqueando os tubos através da parte superior de um suporte de tubos de ensaio. </li><li> Se o painel de anticorpos constituída por um anticorpo não directamente conjugado com um fluorocromo mas é preferivelmente conjugado com biotina, um fluorocromo-estreptavidina é necessário para visualizar o marcador de superfície. Neste passo, adicionar um volume apropriado da estreptavidina fluorocromo-diluído e incubar no escuro durante 15 min em gelo. Como em 4,2, o estreptavidina irá ser diluído para uma concentração recomendada pelo fabricante ou para um optimizado pelo utilizador. Este passo só é necessário para painéis contendo biotiniladas anticorpos primários. </li><li> Executar um passo de lavagem como descrito em 4,10. </li><li> Diluir um volume apropriado de BD estabilização 01:03 fixador em água desionizada. Adicionar 100 uL de fixador diluído a cada tubo, enquanto suavemente vortexing para evitar aglomeração das células. Células marcadas e fixadas podem ser estavelmente armazenadas no escuro a 4 ° C durante aproximadamente uma semana antes da aquisição de um citómetro de fluxo. </li></ol> 5. Os dados representativos As nanopartículas fabricadas na etapa 3,1 tinha um diâmetro médio de 163 ± 24 nm e uma morfologia consistente com aquele obtido em estudos anteriores 5,16. Nanopartículas em solução antes e após a sonicação são mostrados na Figura 1 para demonstrar a necessidade de sonicação para assegurar a dispersão adequada das partículas. Análise de citometria de fluxo de AMɸs colhidas obtidos através de lavagem pulmonar é mostrado na Figura 2. Marcação das células com uma combinação de anti-rato CD11b e anti-rato F4/80 anticorpos, bem como os controlos correspondentes FMO permite o estabelecimento de rotulagem de fundo, identificando AMɸs e gating para análise posterior. Tratamento de macrófagos alveolares com polianidridonanopartículas aumenta a activação como mostrado pela intensidade média de fluorescência aumentada de MHC II, CD40, CD86, e CIRE (Figura 3). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig1.jpg" /> . Figura 1 50:50 CPTEG: CPH nanopartículas antes de (A) e após (B) s 30 de sonicação. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig2.jpg" /> Figura 2. Análise por citometria de fluxo de colhidas macrófagos alveolares marcadas com (A) Alexa Fluor 700 anti-CD11b ea PE-Cy7 FMO de controlo, (B) Alexa Fluor 700 FMO de Controlo e do anti-F4/80 PE-Cy7 e (C ) Alexa Fluor 700 anti-CD11b e PE-Cy7 anti-F4/80. O número no canto superior direito representa a porcentagem de células positivas duplo. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig3.jpg" /> Figura 3. Histogramas demonstrando um aumento na intensidade de fluorescênciadade para a expressão de superfície de MHC II (A), CD40 (B), CD86 (C) e CIRE (D) após co-cultura de macrófagos alveolares com CPTEG 50:50: polianidrido de CPH nanopartículas durante 48 horas. Os histogramas mostram resultados para AMɸ rotulados como controles (FMO <img alt="Gráfico da Linha 1" src="/files/ftp_upload/3883/3883line1.jpg" /> ), Não tratado AMɸ rotulado com anticorpos contra todos os marcadores de superfície celular ( <img alt="Gráfico da Linha 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883line3.jpg" /> ) E AMɸ cultivadas com nanopartículas e marcadas com anticorpos contra todos os marcadores de superfície celular ( <img alt="Gráfico da Linha 2" src="/files/ftp_upload/3883/3883line2.jpg" /> ).

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Não há conflitos de interesse declarados.

Plataformas polianidrido vacina nanopartículas demonstraram eficácia quando administrada por via intranasal em regimes de dose única 5. Medindo a activação das populações de células fagocíticas residentes nos pulmões induzidos por esta plataforma de entrega de vacina permite a avaliação da sua capacidade potencial para, em última análise promover respostas imunes adaptativas. Especificamente, a colheita macrófagos alveolares no lavado pulmonar e tratá-los com difer...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> CAM Mídia </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 15-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> 50 mM 2-mercaptoetanol </td><td> Sigma </td><td> M3148-25ML </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina 10.000 mg / ml Solução </td><td> Cellgro </td><td> 30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão FACS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S671-500 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> MK7868500 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de potássio </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217500 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de potássio </td><td> Fisher Scientific </td><td> P288-200 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (albumina de soro bovino) </td><td> Sigma </td><td> A7888 </td><td></td></tr><tr><td> Azida de sódio </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td> Antibodies </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rat IgG </td><td> Sigma </td><td> I4341 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Ms CD16/32 </td><td> eBioscience </td><td> 16-0161 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Ms MHC haplótipo II IA / IE, clone M5/114.15.2, conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) </td><td> EBIOScience </td><td> 11-5321 </td><td></td></tr><tr><td> CD86 anti-rato, o clone GL-1, conjugado com aloficocianina (APC)-Cy7 </td><td> Biolegend </td><td> 105030 </td><td></td></tr><tr><td> CD40 anti-rato, o clone 1C10, conjugada com a APC </td><td> eBioscience </td><td> 17-0401 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rato CD209, clone 5H10, conjugado com biotina </td><td> eBioscience </td><td> 13-2091 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rato CD11b, clone M1/70, conjugado com Alexa Fluor 700 </td><td> eBioscience </td><td> 56-0112 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-ratinho F4/80, clone BM8, conjugado com ficoeritrina (PE)-Cy7 </td><td> eBioscience </td><td> 25-4801 </td><td></td></tr><tr><td> PE-estreptavidina Texas vermelho conjugado </td><td> BD Biosciences </td><td> 551487 </td><td></td></tr><tr><td> Outros Fornecimentos e Reagentes </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A405-20 </td><td> Usado como 70% (v / v) </td></tr><tr><td> Comprimido CO 2 </td><td> Linweld </td><td> 16000060 </td><td></td></tr><tr><td> Seringa de 1 mL </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Soberano 3 ½ &quot;Pe. Tom Catcatheter </td><td> Kendall </td><td> 703021 </td><td></td></tr><tr><td> Gabinete de Biossegurança </td><td> NUAIRE </td><td> Série 22 </td><td></td></tr><tr><td> Tesouras de dissecação </td><td> Pescador </td><td> 138082 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps </td><td> Roboz </td><td> RS-8254 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 1X sem cálcio e magnésio </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CM </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Tubos da centrífuga com tampa de rosca </td><td> VWR International </td><td> 21008-216 </td><td></td></tr><tr><td> Seis bem Cultura tecido tratado Placas </td><td> Costar </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> Tubo de plástico Racks </td><td> Nalgene </td><td> 5970 </td><td></td></tr><tr><td> Célula Scraper 24 centímetros </td><td> TPP </td><td> 99002 </td><td></td></tr><tr><td> 5 mL de poliestireno Tubo de fundo redondo </td><td> Falcão </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetar ajuda-XL </td><td> Drummond </td><td> 4-000-105 </td><td></td></tr><tr><td> 10, 5, e 2 mL Pipetas </td><td> Pescador </td><td> 13-675 </td><td></td></tr><tr><td> 200 e 10 uL micropipetas </td><td> Gilson Pipetman </td><td> F123601 </td><td></td></tr><tr><td> 200 e 10 L ponteiras </td><td> Pescador </td><td> 02-707 </td><td></td></tr><tr><td> BD de estabilizaçãoFixador </td><td> BD Biosciences </td><td> 338036 </td><td></td></tr><tr><td> Isoton II Diluente </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 8546719 </td><td></td></tr><tr><td> Zap-oglobin II Reagente Lítico </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 7546138 </td><td></td></tr><tr><td> Coulter Counter frascos de poliestireno </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 14310-684 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de ensaio </td><td> BD Biosciences </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Equipamento </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga refrigerada </td><td> Labnet </td><td> 50075040 </td><td></td></tr><tr><td> Incubadora de CO 2 umidificado </td><td> Nuaire </td><td> Modelo Autoflow 8500 </td><td></td></tr><tr><td> FACSCanto citómetro de fluxo </td><td> BD Biosciences </td><td> 338960 </td><td></td></tr><tr><td> Coulter do contador de partículas Z1 </td><td> Beckman-Coulter </td><td> WS-Z1DUALPC </td><td></td></tr><tr><td> Sonicador equipamento de processamento de líquido com MicroTip </td><td> Misonix </td><td> Modelo No. S-4000 </td><td></td></tr></tbody></table>

harvesting murine alveolar macrophages and evaluating cellular activation induced by polyanhydride nanoparticles

Nanopartículas biodegradáveis ​​surgiram como uma plataforma versátil para a concepção e implementação de novas vacinas intranasais contra doenças respiratórias infecciosas. Especificamente, polianidrido nanopartículas composto do ácido alifático sebácico (SA), a aromático 1,6-bis (p-carboxifenoxi)-hexano (CPH), ou o anfifílico 1,8-bis (p-carboxifenoxi) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) exibem grandes quantidades única e cinética de erosão de superfície 1,2 e pode ser explorado para libertar lentamente biomoléculas funcionais (por exemplo, os antigénios de proteínas, imunoglobulinas, etc) in vivo 3,4,5. Estas nanopartículas também possuem atividade adjuvante intrínseco, tornando-os uma excelente escolha para uma plataforma de entrega de vacina 6,7,8. A fim de elucidar os mecanismos que regulam a ativação da imunidade inata após a vacinação da mucosa nasal, deve-se avaliar as respostas moleculares e celulares da p antígenocélulas ressentindo (APCs) responsáveis ​​pelo início respostas imunes. As células dendríticas são as principais APCs encontradas na condução das vias aéreas, enquanto os macrófagos alveolares (AMɸ) predominam no parênquima pulmonar 9,10,11. AMɸ são altamente eficientes na limpeza dos pulmões de micróbios patogénicos e restos celulares 12,13. Além disso, este tipo de célula desempenha um papel importante no transporte de antigénios microbianos para os nódulos linfáticos de drenagem, que é um primeiro passo importante na iniciação de uma resposta imunitária adaptativa 9. AMɸ também expressam níveis elevados de reconhecimento de padrões inata e receptores de catadores, pró-inflamatórias secretam mediadores, e principais células T naive 12,14. Uma população relativamente pura de AMɸ (por exemplo, superior a 80%) pode ser facilmente obtida por meio de lavagens pulmonares para o estudo em laboratório. Residente AMɸ colhidas a partir de animais imunes competentes proporcionar um fenótipo representante dos macrófagos que irá encounter vacina da partícula baseada em in vivo. Descrevemos os protocolos utilizados para colheita e cultura AMɸ de camundongos e examinar o fenótipo de ativação dos macrófagos após o tratamento com nanopartículas polianidrido in vitro.

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Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Descrevemos os protocolos para a colheita murinos macrófagos alveolares, que são residentes as células imunes inatas no pulmão, e examinando a sua ativação em resposta a co-cultura com nanopartículas polianidrido.

Colheita Murino macrófagos alveolares e Avaliação de ativação celular induzida por nanopartículas polianidrido

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

harvesting-murine-alveolar-macrophages-evaluating-cellular-activation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.7K visualizações.  Iowa State University. Descrevemos os protocolos para a colheita murinos macrófagos alveolares, que são residentes as células imunes inatas no pulmão, e examinando a sua ativação em resposta a co-cultura com nanopartículas polianidrido.

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Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Analisando internalização celular de nanopartículas e bactérias multi-espectral por Citometria de Fluxo Imagem

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Bioengenharia

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

Alta capacidade de síntese de hidratos de carbono e funcionalização de nanopartículas polianidrido

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular choice for drug delivery applications, particularly since it is already FDA-approved for use in humans in the form of resorbable sutures. Hydrophobic and hydrophilic drugs are encapsulated in PLGA particles via single- or double-emulsion. Briefly, the drug is dissolved with polymer or emulsified with polymer in an organic phase that is then emulsified with the aqueous phase. After the solvent has evaporated, particles are washed and collected via centrifugation for lyophilization and long term storage. PLGA degrades slowly via hydrolysis in aqueous environments, and encapsulated agents are released over a period of weeks to months. Although PLGA is a material that possesses many advantages for drug delivery, reproducible formation of nanoparticles can be challenging; considerable variability is introduced by the use of different equipment, reagents batch, and precise method of emulsification. Here, we describe in great detail the formation and characterization of microparticles and nanoparticles formed by single- or double-emulsion using the emulsifying agent vitamin E-TPGS. Particle morphology and size are determined with scanning electron microscopy (SEM). We provide representative SEM images for nanoparticles produced with varying emulsifier concentration, as well as examples of imaging artifacts and failed emulsifications. This protocol can be readily adapted to use alternative emulsifiers (e.g. poly(vinyl alcohol), PVA) or solvents (e.g.&#160;dichloromethane, DCM).

We describe the production and characterization of nanoparticles and microparticles composed of poly(lactic-co-glycolic acid) using vitamin E-TPGS as an emulsifier. By varying formulation parameters such as the concentration of emulsifier, it is possible to produce nanoparticles with mean diameters ranging from 220 nm to&#160;1.98 &#181;m.

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Usando impedância Cell-substrato e imagens de células vivas para medir as mudanças em tempo real no celular Adesão e De-adesão Induzidas por Matrix Modificação

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea (ureolysis) in naturally occurring environments through secretion of an enzyme urease. This process of ureolysis, through a chain of chemical reactions, leads to the formation of calcium carbonate precipitates. This is known as Microbiologically Induced Calcite Precipitation (MICP). The proper culture protocols for MICP are detailed here. Finally, visualization experiments under different modes of microscopy were performed to understand various aspects of the precipitation process. Techniques like optical microscopy, Scanning Electron Microscopy (SEM) and X-Ray Photo-electron Spectroscopy (XPS)&#160;were employed to chemically characterize the end-product. Further, the ability of these precipitates to clog pores inside a natural porous medium was demonstrated through a qualitative experiment where sponge bars were used to mimic a pore-network with a range of length scales. A sponge bar dipped in the culture medium containing the bacterial cells hardens due to the clogging of its pores resulting from the continuous process of chemical precipitation. This hardened sponge bar exhibits superior strength when compared to a control sponge bar which becomes compressed and squeezed under the action of an applied external load, while the hardened bar is able to support the same weight with little deformation.

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

Microbiologicamente induzida Calcita Precipitation Mediada por<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Produção de nanopartículas metálicas por ablação a laser pulsada em líquidos: uma ferramenta para estudar as propriedades antibacterianas das nanopartículas

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

Functionalization superfície de nanopartículas de vírus de hepatite E usando métodos de conjugação química

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling molecules at low levels and damaging molecules at high levels. Accumulation of ROS in stressed plants can damage metabolites, enzymes, lipids, and DNA, causing a reduction of plant growth and yield. The ability of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) to catalytically scavenge ROS in vivo provides a unique tool to understand and bioengineer plant abiotic stress tolerance. Here, we present a protocol to synthesize and characterize poly (acrylic) acid coated nanoceria (PNC), interface the nanoparticles with plants via leaf lamina infiltration, and monitor their distribution and ROS scavenging in vivo using confocal microscopy. Current molecular tools for manipulating ROS accumulation in plants are limited to model species and require laborious transformation methods. This protocol for in vivo ROS scavenging has the potential to be applied to wild type plants with broad leaves and leaf structure like Arabidopsis thaliana.

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Here, we present a protocol for the synthesis and characterization of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) for ROS (reactive oxygen species) scavenging in vivo, nanoceria imaging in plant tissues by confocal microscopy, and in vivo monitoring of nanoceria ROS scavenging by confocal microscopy.

Limpeza catalítica de planta reativas de oxigênio espécies na Vivo por nanopartículas de óxido de cério aniônicos

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...