Os autores agradecem a MSCRF TEDCO (2009-MSCRFE-0098-00) e NIH R21CA152473 de apoio.

1. Sementeira celular <ol><li> Não permitir que as células a crescer para overconfluency. Usar células de passagem iniciais, quando a transfecção de células primárias. </li><li> Vinte e quatro horas antes da transfecção, as células Tripsinizar, contar as células utilizando um hemocitómetro, e dilui-se a suspensão de células com meio para atingir a densidade celular desejada (células / volume). Células de sementes para cultura de tecidos clara-tratado de fundo plano de 96 poços, utilizando um reservatório e pipetas multicanal. A densidade escolhida deve dar 70-80% de confluência no dia da transfecção. Por exemplo, como exibido na Tabela 1, as células foram diluídas para 25 a 50 células / ul para os dados de transfecção mostradas aqui. </li></ol> 2. A transfecção de células <ol><li> Diluição do polímero e os estoques de DNA. Descongelar polímero e soluções de reserva de ADN, à temperatura ambiente (RT). Diluir solução-mãe de polímero e solução de ADN, de uma forma clara separadamente placas de 96 poços, utilizando uma pipeta de 12 canais, Com o solvente apropriado para as concentrações necessárias para obter o peso de polímero desejada para razões de ADN de peso (p / p). Neste caso, o solvente escolhido é de 25 mM de tampão de acetato de sódio (pH = 5,2). <ol><li> DNA de diluição. Tipicamente, o DNA armazenado a 1 mg / ml é diluída em tampão de acetato de sódio a uma concentração de 0,03 a 0,06 mg / ml de uma forma clara não-tecido de cultura tratada placa de 96 poços (um bem para uma única formulação). Tabela 2 mostra o protocolo de diluição típico de DNA para uma única formulação usada para transfectar quatro cavidades replicadas em uma placa de 96 poços com células a partir do Passo 1. </li><li> Diluição do polímero. A solução de 100 mg / ml de polímero / DMSO é diluído em tampão de acetato de sódio de acordo com a concentração necessária para obter o desejado polímero de DNA proporção peso / peso. A gama de peso / peso rácios tipicamente utilizados para a entrega de genes com poli (beta-amino éster) s (PBAEs) é de 20 a 100. Polímeros PBAE são primeiro diluídos para 10 mg / ml, seguido de diluição do protocolo como mostrado na Tabela 3. As diluições de polímero pode ser realizada de uma forma clara não-tecido de cultura tratada placa de 96 poços, que corresponde à orientação da amostra da placa de diluição do DNA. </li></ol></li><li> Formação de nanopartículas. Adicionar a solução PBAE a um volume igual da solução de DNA de plasmídeo utilizando uma pipeta de 12 canais e misturar vigorosamente. Deixe a mistura incubar à temperatura ambiente durante 10 min para permitir a auto-montagem. </li><li> Transfecção de nanopartículas. Na sequência de auto-montagem, a 20 ul de nanopartículas são adicionados por poço de meio de cultura, gota a gota com a pipeta 12 de canal. Cavidades replicadas são deixados sem tratamento, ou são transfectados com reagentes disponíveis comercialmente, como controles. As células transfectadas foram incubadas a 37 ° C durante duas a quatro horas e, em seguida, os poços são substituídos por meios frescos (100 ul / poço). A escolha do tempo de incubação depende da linha celular, as condições de cultura, e um sistema de transfecção. A diferença de transfecçãoeficácia e toxicidade celular como um resultado de variação período de incubação será quantificado pelo protocolo de análise descrito no Passo 3. </li></ol> 3. Análise da eficácia de transfecção e toxicidade celular A eficiência de transfecção é analisada visualmente com um microscópio de fluorescência e quantificada utilizando um citómetro de fluxo de 48 horas após a transfecção. Toxicidade celular é analisada visualmente com um microscópio de fluorescência e quantificada utilizando o ensaio CellTiter 96 One aquosa 24 horas após a transfecção. <ol><li> A microscopia de fluorescência. Analisar visualmente os poços durante a expressão do gene repórter transfectadas (por exemplo, EGFP ou DsRed) utilizando o canal apropriado fluorescência. Aquisição de imagens para cada poço, a escolha de campos de visão que representam adequadamente a eficiência de transfecção para as formulações particulares (Figura 1). Faça uma nota de qualquer toxicidade celular observado visualmente. </li><li> Citometria de Fluxo. <ol><li> Use pipetas multicanal para preparar a placa de 96 poços por citometria de fluxo. Lavar com PBS, Tripsinizar com 30 ul / poço de tripsina / EDTA, neutralizar com 170 ul de tampão de FACS (PBS + 2% FBS), pipeta-se para baixo e, em cada poço, incluindo à volta dos rebordos, e transferir o volume de 200 uL, de todo cada poço em poços correspondentes de uma ou de fundo redondo de fundo em V-placa de 96 poços. </li><li> Centrifugar a placa a 130 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Remover 170 ul de meio de cada poço e as células pipeta para ressuspender, evitando bolhas de ar. Para utilizar uma mancha de viabilidade, como iodeto de propídio (PI), adicionam-se 10 ul de tampão FACS + PI (50:1 tampão FACS: PI de diluição; PI concentração estoque de 1 mg / ml) a cada poço. Colocar imediatamente em gelo e cobrir de luz. </li><li> Comece o C6 citômetro de fluxo Accuri, o HyperCyt de 96 poços anexo, eo software HyperView. Use HyperView Design e guias Protocolo de escolher o adequado pTipo de tarde, layout da placa e outras configurações como trepidação / SIP / lavar / agitar tempo. Para o protocolo acima, os parâmetros que se seguem foram usados, um primeiro prato de pré-, durante um minuto, e um batido de chapa pré-, durante 30 segundos a 2400 rpm. Tempo gole foi marcada para 15 segundos a 15 rpm, uma sonda enxaguar bem para cada 2 segundos, e uma inter-agitar bem a cada 12 poços para 12 segundos a 2.400 rpm. A vibração da inter-bem é importante manter as células dispersas nos meios de comunicação, bem como para a melhor capacidade de processamento dos dados, incluindo quebras temporizadas, entre grupos de cavidades (neste caso, 12 seg). </li><li> Use HyperView guia Identificação Bem para processar os dados e separados, para o bem apropriado (Figura 2). A fim de identificar os poços individuais, ele pode ajudar a usar filtro do software de ruído, bem como incluindo uma base mesmo filtro sob as configurações avançadas. </li><li> Quantificar percentual de positivamente transfectadas células vivas pela passagem apropriada para separar pop diferenteulations (Figura 3). Primeiro visualizar os dados de fluxo de um gráfico de dispersão FSC vs SSC, a fim de separar as células de detritos (Figura 3A). Se iodeto de propídio (PI) foi usado, porta a população de células individuais e vista que os dados sobre uma trama FSC vs FL3 de modo a separar as células vivas a partir de células mortas e as células vivas de porta. A fim de quantificar o número de células transfectadas, ver a população de células vivas nos canais apropriados, por exemplo, a GFP pode ser visto em FL1. Usando a população não tratada, portão as células não tratadas, a fim de identificar o sinal de fundo (Figura 3B). As células transfectadas de forma positiva pode então ser isolado usando este portão e exibindo as populações transfectadas utilizando tanto dispersão e gráficos de contorno (Figura 3C e 3D). Pode haver uma série contínua de células transfectadas de forma positiva, como células de diferentes serão transfectados para graus diferentes de fluorescência. </li></ol></li><html><li> CellTiter 96 Um ensaio aquoso <ol><li> Transfectar uma outra placa, exactamente da mesma maneira que para as medições da toxicidade celular. </li><li> Ml de pré-mistura de 96 1 de solução aquosa de ensaio CellTiter One com 10 ml de meio fresco. Remover media a partir de células e usar uma pipeta multicanal para adicionar 110 ul da solução de pré-mistura media + por poço. </li><li> Medir a absorvância a 490 nm a cada intervalo de uma hora, 1-4 horas até que a absorvância do poço com a condição sem tratamento está no intervalo linear do ensaio. Incluem quatro poços de controlo com a mídia única solução + para uma leitura absorvância de fundo. </li><li> Valores médios da absorbância dos quatro poços repetições por condição e subtrair a absorvância de fundo média de cada média. Normalizar a média corrigida para cada condição de tratamento com a média corrigida da condição sem tratamento para determinar a viabilidade celular por cento. </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 4 Nanoparticle. Dimensionamento com NTA e Plasmideo Cálculos partícula por <ol><li> Primeiro sistema de fluidos do NS500 NanoSight por uma bomba de diluente para a frente em aproximadamente 1/5th a velocidade máxima ea bomba de amostra para trás em aproximadamente 1/10th a velocidade máx. Continue até que o sistema de fluidos é lavada com o diluente. </li><li> Prepare as nanopartículas para serem analisados. No caso de PBAEs, separadamente diluir o DNA plasmídeo estoque (1 mg / ml) e estoque PBAE (100 mg / ml) em tampão de acetato de sódio (25 mM, pH 5), em tubos de Eppendorf. </li><li> Dilui-se a concentração de DNA plasmídico a 0,06 mg / ml. Concentração do polímero pode variar de acordo com a proporção de peso-peso de polímero necessária para ADN (por exemplo, por 60 wt / wt partículas, o polímero é diluído para 3,6 mg / ml). </li><li> Adicionar a solução de polímero a um volume igual da solução de DNA de plasmídeo e misturar vigorosamente. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 10 min para permitir a auto-montagem. </li><li> Dilute a solução de nanopartículas de 100 vezes em PBS para que a concentração das nanopartículas para estar no intervalo apropriado para NTA e para se obter um volume final de, pelo menos, 500 uL. </li><li> Carregar a amostra no NanoSight colocando o tubo de carregamento dentro da amostra de tubo Eppendorf (Figura 4A). Certifique-se de não introduzir bolhas de ar. </li><li> No modo de captura, aumentar o nível da câmara até que as partículas podem ser vistas. Ajustar o foco, de modo que as partículas de aparência suave (Figura 4A e 4B). </li><li> Enquanto no modo padrão, ajustar o nível da câmara para além do ponto de que todas as partículas podem ser vistas no ecrã. Em seguida, diminui o nível da câmara para o nível mais baixo de tal modo que as partículas podem ainda ser observadas. Se um nível de câmera intermediário é necessário, entrar em modo avançado e modificar o obturador da câmera e ganhar para os níveis adequados. </li><li> Visualmente verifique se há entre 20 - 100 partículas no screen. Um número ideal para o rastreamento de nanopartículas é de aproximadamente 50 partículas. Se há muitos ou poucos, lave o NS500, ajustar a diluição em PBS, e re-carregar a amostra. </li><li> Ajuste a duração da captura de acordo com a tabela de modo standard. Tipicamente 30 - 60 seg é um comprimento de captura apropriado (Figura 4B). </li><li> Para carregar a amostra seguinte, lave o sistema, em seguida, voltar a carregar a amostra nova. </li><li> Uma vez que os vídeos são capturados, avançar para a fase de processamento, abrindo um arquivo de vídeo. </li><li> Há um número de parâmetros que pode ser ajustado a fim de melhor processar um vídeo (Figura 4C). O objectivo consiste em seleccionar os parâmetros que melhor capturar todas as partículas sobre a tela, conforme indicado por uma marca de cruz vermelha na tela sobre cada partícula (Figura 5). </li><li> Aumentar o ganho de tela para ver melhor as partículas. Sob o modo padrão ou avançado, selecione o ajuste automático para os parâmetros por clicking caixas apropriadas. No caso em que as configurações de auto não adequadamente selecionar partículas, desmarque a caixa e definir manualmente os parâmetros (Figura 4C). </li><li> Uma vez que todas as partículas são colhidos na tela, clique no botão de processo do software para processar o arquivo de vídeo (Figura 4C). Isto fornece a distribuição do tamanho das partículas, a média de tamanho, assim como a concentração de partículas. </li><li> A fim de assegurar que a concentração de partículas é exacta, alterar a diluição PBS, tal como através do aumento da diluição em 2x, e repetir o procedimento acima. Medindo diluições múltiplas de uma mesma amostra é recomendado para assegurar que a medição da concentração da amostra é precisa. Uma boa variedade de medição é 10 7 -10 9 partículas / ml. </li><li> Verificar se todos os plasmídeos são incorporados em nanopartículas por electroforese em gel de execução das nanopartículas e avaliar se qualquer DNA livre está presente.Se nem todos os plasmídeos são encapsulados, utilizar técnicas padrão para medir a absorvância de DNA a fim de quantificar o total plasmídeos encapsulados. </li><li> Para calcular o número médio de partículas por plasmídeos, dividir a concentração total de plasmídeo encapsulado pela concentração de partículas medido NTA. A fim de estimar a distribuição da amostra de plasmídeo por partícula, da primeira utilização do NTA histograma de tamanho de partícula para calcular a fracção de volume de cada compartimento de 1 nm de partículas. Multiplicar esta fracção de volume de distribuição pela quantidade total de plasmídeo para obter o número de plasmídeos em cada compartimento. Dividir estes números por o número de partículas em cada compartimento para obter o número de plasmídeos a partículas por cada tamanho de partícula (Figura 6). </li></ol>

<ol>
	<li>Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+for+gene+delivery+across+length+scales.">Polymers for gene delivery across length scales.</a> Nature Materials. 5, 439-451 (2006).</li><li>Sheyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+cells+in+regenerative+medicine+and+tissue+engineering.">Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rita+Schaffer+Lecture:+Nanoparticles+for+Intracellular+Nucleic+Acid+Delivery.">Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).</li><li>Lynn, D. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradable+poly(beta-amino+esters):+Synthesis,+characterization,+and+self-assembly+with+plasmid+DNA.">Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).</li><li>Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+transfection+with+polymeric+nanoparticles+are+dependent+on+polymer+end-group+structure,+but+largely+independent+of+nanoparticle+physical+and+chemical+properties.">Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties.</a> Mol. Pharm. , (2012).</li><li>Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+nanoparticles+specific+for+human+microvasculature+and+macrovasculature.">Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).</li><li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+terminal+functionalization+and+molecular+weight+of+a+gene+delivery+polymer+and+transfection+efficacy+in+mammary+epithelial+2-D+cultures+and+3-D+organotypic+cultures.">The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures.</a> Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).</li><li>Tzeng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+gene+delivery+nanoparticles+based+on+poly(beta-amino+esters)+for+treatment+of+glioblastoma.">Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma.</a> Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).</li><li>Sunshine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+End-Groups+of+Linear+Polymer+Determine+Cell-Type+Gene-Delivery+Efficacy.">Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy.</a> Adv. Mater. 21, 4947 (2009).</li><li>Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+quantifying+the+number+of+plasmids+encapsulated+by+polymer+nanoparticles.">A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles.</a> Small. 8, 367-373 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences.">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET.">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).</li><li>Kreiss, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+DNA+size+does+not+affect+the+physicochemical+properties+of+lipoplexes+but+modulates+gene+transfer+efficiency.">Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency.</a> Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).</li><li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-sized+self-assembling+lamellar+complexes+between+plasmid+DNA+and+cationic+micelles+promote+gene+transfer.">Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).</li><li>Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+solution+of+(Lys)(16)-containing+bifunctional+synthetic+peptide/DNA+nanoparticles+for+gene+delivery.">Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).</li><li>Green, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+vectors+for+gene+delivery+to+human+endothelial+cells.">Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells.</a> Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).</li></ol>

Os autores relatam nenhum conflito de interesse.

Os protocolos acima descrevem métodos para avaliar a eficácia de transfecção de formulações de nanopartículas, bem como uma maneira de caracterizar o tamanho de partícula e carga de DNA das nanopartículas. O número de plasmídeos por partícula é um parâmetro importante que pode ajudar a prever a eficácia da partícula e pode também ser usado para a determinação de dose. Análise de rastreamento de nanopartículas pode ser realizado em uma variedade de diferentes soluções aquosas, tais como os que dife...

A determinação do número de plasmídeos complexados por nanopartículas é importante desenhar eficazes de nanopartículas à base de estratégias de distribuição de genes, em particular para co-entrega de plasmídeos múltiplos para a mesma célula-alvo, tal como muitas vezes é necessário reprogramar os estudos de células estaminais 12. Algumas abordagens para calcular o número de plasmídeos associados com uma nanopartícula única têm sido descritos, e cada método tem desvantagens das técnicas usadas para a estimativa de 13-16. Quantum dot rotulagem (QD), combinada com MET foi utilizada para estimar os plasmídeos por partícula de quitosano baseada em nanopartículas. Estimativa com esta técnica QD é complicado devido à necessidade de rotular o DNA, o que pode alterar as suas propriedades de auto-montagem, a possibilidade de que o DNA não marcado encapsulado não é directamente detectada; plasmídeos potencialmente sobrepostos e QDs nas imagens de TEM 2D de partículas, e outras hipóteses simplificadoras 13. Uma abordagem alternativa, que é umAPLICÁVEL microdomínios quando ordenados existir nas partículas tem sido usado para estudar lipopoliamina-DNA por meio de complexos de crio-microscopia electrónica de transmissão (Cryo-TEM), dispersão de raios X e dispersão dinâmica de luz (DLS) 14,15. Infelizmente, os materiais, tais como as nanopartículas de polímeros investigados aqui, não são aplicáveis ​​a este método. . Em outro estudo, Collins et al utilizaram um fluxo de partículas técnica de análise de imagem para o estudo (Lys) 16 contendo peptídeos / DNA complexos, no entanto, o seu método só pode avaliar maiores, micron de tamanho de partículas 16. Assim, foi recentemente desenvolvido um ensaio de novo e flexível para quantificar o número de plasmídeos por nanopartículas de 11.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Tampão fosfato salino, 1x (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10010 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2MV BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> De tampão de acetato de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7899 </td><td> Diluir a 25 mM em água desionizada </td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276855 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP DNA </td><td> Biopharmaceuticals Elim </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> DNA DsRed </td><td> Addgene </td><td> 21718 </td><td></td></tr><tr><td> PEI, ramificado </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408727 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> CellTiter aquosa 96 Um </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materiais </td></tr><tr><td> Fundo plano claro placa de 96 poços, estéril </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581.001 </td><td></td></tr><tr><td> Fundo redondo clara placa de 96 poços, estéril </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> 12 canais Finnpipette </td><td> Thermo Scientific </td><td> NA </td><td> 5-50 e 50-300 ul </td></tr><tr><td> Microscópio de fluorescência </td><td> Zeiss </td><td> NA </td><td> Número do Modelo: AX10 </td></tr><tr><td> C6 citômetro de fluxo Accuri </td><td> BD Biosciences </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> Anexo HyperCyt </td><td> Intellicyt </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> NS500</td><td> NanoSight </td><td> NA </td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry

Non-viral de entrega de genes utilizando nanopartículas poliméricas emergiu como uma abordagem atraente para a terapia de gene para tratar uma doença genética e como uma tecnologia para a medicina regenerativa 2. Ao contrário dos vírus, que têm problemas de segurança significativos, as nanopartículas de polímeros pode ser concebido para ser não-tóxico, não-imunogénicas, não mutagénica, mais fáceis de sintetizar quimicamente versátil, capaz de transportar cargas maiores de ácidos nucleicos e biodegradável e / ou ambientalmente sensíveis. Os polímeros catiónicos auto-montar com o DNA carregado negativamente pela interacção electrostática, para formar os complexos da ordem de 100 nm, que são normalmente chamados de nanopartículas poliméricas. Exemplos de biomateriais usados ​​para formar nanopartículas nanoescala de entrega de genes policatiónicos incluem polilisina, polyphosphoesters, poli (amidoaminas) s e polietilenoimina (PEI), que é um não-degradável off-the-shelf polímero catiónico vulgarmente utilizados para a entrega de ácidos nucleicos 1,3. Poli (beta-aminoéster) s (PBAEs) são uma nova classe de polímeros catiónicos que sejam 4 hidroliticamente degradável 5,6 e têm-se mostrado eficazes na entrega de genes em tipos de difícil transfectam de células, tais como células endoteliais humanas da retina (HRECs) 7, células epiteliais mamárias de rato 8, células cerebrais humanas cancerosas 9 e macrovasculares (veia umbilical humana, HUVECs) células endoteliais 10. Um novo protocolo para a caracterização de nanopartículas poliméricas utilizando análise de nanopartículas de rastreamento (NTA) é descrito. Nesta abordagem, tanto a distribuição do tamanho de partícula e da distribuição do número de plasmídeos por partícula são obtidos 11. Além disso, um alto rendimento de ensaio de transfecção placa de 96 poços para rastreio rápido da eficácia de transfecção de nanopartículas poliméricas é apresentado. Neste protocolo, o poli (beta-amino éster) s (PBAEs) são utilizados como polímeros de modelo e da retina humana (células endoteliais HRECs) são utilizados como model células humanas. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para avaliar qualquer nanopartícula de polímero e de qualquer tipo de células de interesse num formato de placa de multi-poços.

A Figura 1 mostra uma imagem de microscopia de fluorescência de um exemplo de uma transfecção bem sucedida de HRECs com o plasmídeo EGFP. A imagem de campo claro é útil para assegurar que as células mantêm a sua morfologia normal. Além disso, os ensaios de viabilidade celular, tais como ensaios de MTS ou semelhantes, pode ser utilizado para avaliar a toxicidade das nanopartículas 7. A citometria de fluxo, tal como descrito, pode ser utilizado para quantificar a eficiência da transf...

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Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Um protocolo para a análise de nanopartículas de seguimento (NTA) e de alto rendimento de citometria de fluxo para avaliar as nanopartículas poliméricas entrega de genes é descrito. NTA é utilizada para caracterizar a distribuição do tamanho de partícula das nanopartículas e a distribuição de partículas por plasmídeo. De alto rendimento de citometria de fluxo permite a avaliação da eficácia de transfecção quantitativo para uma biblioteca de biomateriais de entrega de genes.

Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

evaluation-polymeric-gene-delivery-nanoparticles-nanoparticle

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.7K visualizações.  Johns Hopkins University School of Medicine. Um protocolo para a análise de nanopartículas de seguimento (NTA) e de alto rendimento de citometria de fluxo para avaliar as nanopartículas poliméricas entrega de genes é descrito. NTA é utilizada para caracterizar a distribuição do tamanho de partícula das nanopartículas e a distribuição de partículas por plasmídeo. De alto rendimento de citometria de fluxo permite a avaliação da eficácia de transfecção quantitativo para uma biblioteca de biomateriais...

Vídeo: Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale (nanoparticles). Nanoparticles can be engineered in a precise fashion where their size, composition and surface chemistry can be carefully controlled. This enables unprecedented freedom to modify some of the fundamental properties of their cargo, such as solubility, diffusivity, biodistribution, release characteristics and immunogenicity. Since their inception, nanoparticles have been utilized in many areas of science and medicine, including drug delivery, imaging, and cell biology1-4. However, it has not been fully utilized outside of "nanotechnology laboratories" due to perceived technical barrier. In this article, we describe a simple method to synthesize a polymer based nanoparticle platform that has a wide range of potential applications. 
The first step is to synthesize a diblock co-polymer that has both a hydrophobic domain and hydrophilic domain. Using PLGA and PEG as model polymers, we described a conjugation reaction using EDC/NHS chemistry5 (Fig 1). We also discuss the polymer purification process. The synthesized diblock co-polymer can self-assemble into nanoparticles in the nanoprecipitation process through hydrophobic-hydrophilic interactions.
The described polymer nanoparticle is very versatile. The hydrophobic core of the nanoparticle can be utilized to carry poorly soluble drugs for drug delivery experiments6. Furthermore, the nanoparticles can overcome the problem of toxic solvents for poorly soluble molecular biology reagents, such as wortmannin, which requires a solvent like DMSO. However, DMSO can be toxic to cells and interfere with the experiment. These poorly soluble drugs and reagents can be effectively delivered using polymer nanoparticles with minimal toxicity. Polymer nanoparticles can also be loaded with fluorescent dye and utilized for intracellular trafficking studies. Lastly, these polymer nanoparticles can be conjugated to targeting ligands through surface PEG. Such targeted nanoparticles can be utilized to label specific epitopes on or in cells7-10.

This article describes a nanoprecipitation method to synthesize polymer-based nanoparticles using diblock co-polymers. We will discuss the synthesis of diblock co-polymers, the nanoprecipitation technique, and potential applications.

Formulação de nanopartículas poliméricas através da técnica de dibloco Nanoprecipitation

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Bioengenharia

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays de polímeros para Discovery High Throughput de Biomateriais

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

Síntese combinatória de alta capacidade e liberação de proteínas a partir de polímero de Cinema e Bibliotecas Nanopartículas

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Analisando internalização celular de nanopartículas e bactérias multi-espectral por Citometria de Fluxo Imagem

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

Alta capacidade de síntese de hidratos de carbono e funcionalização de nanopartículas polianidrido

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Polimérico Fabrication matriz Microneedle por fotolitografia

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, as well its ability to protect and subsequently release its payload in response to a trigger. While silk can be formulated into various material formats, silk nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems. Therefore, this article covers the procedures for reverse engineering silk cocoons to yield a regenerated silk solution that can be used to generate stable silk nanoparticles. These nanoparticles are subsequently characterized, drug loaded and explored as a potential anticancer drug delivery system. Briefly, silk cocoons are reverse engineered first by degumming the cocoons, followed by silk dissolution and clean up, to yield an aqueous silk solution. Next, the regenerated silk solution is subjected to nanoprecipitation to yield silk nanoparticles &#8211; a simple but powerful method that generates uniform nanoparticles. The silk nanoparticles are characterized according to their size, zeta potential, morphology and stability in aqueous media, as well as their ability to entrap a chemotherapeutic payload and kill human breast cancer cells. Overall, the described methodology yields uniform silk nanoparticles that can be readily explored for a myriad of applications, including their use as a potential nanomedicine.

Nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems for a broad range of indications. Here, we describe a simple yet powerful method to manufacture silk nanoparticles using reverse engineered Bombyx mori silk. These silk nanoparticles can be readily loaded with a therapeutic payload and subsequently explored for drug delivery applications.

Fabricação e entrega da droga Aplicações de seda Nanopartículas

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Uso do elevado-Throughput Microbioreactor sistema automatizado para produção de IgG1 modelo em células CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Flash NanoPrecipitation para o encapsulamento de compostos hidrofóbicos e hidrofílicos em nanopartículas poliméricas

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...