This work was funded by a National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) and, in part, by a UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).

1. Geral endotelial Cultura de Células <ol><li> Culturas de células endoteliais de aorta bovina (passagens 4-9) em frascos de cultura de tecidos revestidos com gelatina (revestimento de superfície de cultura de tecido com 0,1% w / v de gelatina em PBS à temperatura ambiente durante 15 min) em EGM-2 media (com EGM-2 bala kit contendo 5% de soro fetal bovino, factores de crescimento e todos os suplementos fornecidos pelo fabricante, com excepção para a hidrocortisona). </li><li> Quando as células estão perto confluentes (cerca de 3 dias após a sementeira depois uma mistura 1: 4 de divisão), as células de colheita por meio de tratamento com 0,05% w / v de tripsina / 0,02% w / v de EDTA em PBS a 37 ° C. Depois de a maior parte das células terem separado, adicionar completas EGM-2 meios para extinguir a tripsina e em seguida de centrifugação (100 xg, 5 min). </li><li> Prepare células para estudos sobre a adesão de novo de células endoteliais a fibronectina (Experimento 1: Seção 2) ea subsequente de-adesão das células endoteliais com adesão estabelecido neste substrato (Experimento 2: Seção 3). <ol><li> Lave colhidaas células uma vez com meio isento de soro contendo 199 1% w / v de albumina de soro bovino (BSA) e re-centrifugação (100 xg, 5 min). </li><li> Re-suspender as células em meio isento de soro contendo 199 1% w / v de BSA a 2,5 x 10 5 células / ml (medições de impedância célula-substrato) ou 5 x 10 5 células / ml (análises de imagem de células vivas) e manter a 37 ° C antes de usar. NOTA: As respostas de adesão de células são altamente sensíveis às diferenças de temperatura (por exemplo, devido a efeitos de convecção) de modo a todos os equipamentos e as soluções usadas para manusear e o tratamento de células durante os seguintes protocolos deverá ser mantido a uma temperatura constante de 37 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Experiência 1: Quantificação De Novo a adesão endotelial celular em fibronectina Native e MPO-oxidada (Cell-substrato impedância) NOTA: Experiência 1 examina o grau em que MPO mediada por oxidação de fibronectina prejudica a sua capacidade para suportar de novo </em&gt; Adesão de células endoteliais em suspensão. <ol><li> Brasão fibronectina em 96 poços célula-substrato matrizes de impedância microeletrodos de ouro. Adicionar 80 ul / poço de fibronectina purificada bovino a 5 ug / ml em PBS, incubar durante 2 horas a 37 ° C e remover a solução. </li><li> Incubar as superfícies revestidas com fibronectina com MPO para permitir a ligação do MPO para a fibronectina ligado à superfície. Adicionar 80 ul / poço de MPO purificada de neutrófilos humanos a 20 nM em solução salina equilibrada de Hank (HBSS) e incubar durante 0,5 horas a 37 ° C. </li><li> Wash superfícies duas vezes com HBSS para remover qualquer MPO não ligado. </li><li> Adicionar H 2 O 2 (0-10 uM de concentração final) aos poços da placa de matriz de microeléctrodos contendo 80 jil / poço de HBSS para iniciar MPO-catalisada, oxidação fibronectina HOCl-dependente e incubar durante mais 0,5 horas a 37 ° C. </li><li> Para examinar o efeito de inibidores ou moduladores de reacções catalisadas por MPO relevantes (por exemplo, enzima MPO alternativasubstratos, inibidores de enzimas ou antioxidantes; ver 9 para mais informações), adicioná-los à HBSS imediatamente antes da H 2 O 2 disso. </li><li> Após 0,5 horas, o tratamento de superfícies com metionina para extinguir espécies oxidantes ligado à superfície residuais, ou seja, cloraminas se ligam às proteínas reativas, que podem exercer atividades celulares de confusão. Adicionar metionina 10 mM em 80 ul de HBSS por poço e incubar durante 10 min a 37 ° C. </li><li> Bloco superfícies com BSA. Adicionar 80 ul / poço de BSA a 0,2% w / v em PBS, incubar durante 2 horas a 37 ° C e remover a solução. NOTA: as regiões de superfície não revestidos residuais vai apoiar a adesão celular e bloqueando-os com uma proteína não-adesiva (isto é, ASB) assegura que as respostas de adesão celular depende estritamente sobre a célula-matriz adesiva purificada empregue, neste caso, a fibronectina. </li><li> Wash superfícies duas vezes com HBSS. NOTA: Nenhum dos tratamentos de superfície precedentes afeta sensivelmente célula-substrato readings. </li><li> As células endoteliais em suspensão de sementes (adicionar 200 ul / poço a cerca de 2,5 x 10 5 células / ml, preparado em meio isento de soro 199 contendo BSA a 1%, ver 1.3) sobre as superfícies revestidas com fibronectina nativas ou MPO-oxidados. </li><li> Imediatamente após a sementeira de células (isto é, antes de qualquer adesão e espalhamento), a montagem de placa de matriz de microeléctrodos para a porta incubadora (alojados numa incubadora a 37 ° C na presença de 5% de CO 2). <ol><li> Usando o software do aparelho imediatamente tomar um &quot;vazio&quot; de ler para normalizar subsequente impedância célula-substrato (&#39;índice de célula&#39;) Os valores para os valores de fundo iniciais obtidos na ausência de células-adesão. </li><li> Iniciado aquisição de dados de índice de células contínuas (mínimo de uma célula índice de leitura / min). </li></ol></li><li> Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 2 horas, um período de tempo durante o qual a ligação de células e espalhando máxima é alcançada; esta é reflectida pelaplateauing um dos valores do índice de células (ver Figura 3A). NOTA: O experimento anterior (Experimento 1) examina como inicial oxidação MPO-mediada da fibronectina limita a capacidade das células endoteliais para estabelecer a adesão celular neste substrato. A experiência seguinte (Experimento 2) examina como oxidação fibronectina MPO-mediada promove diminuição na adesão de células-matriz (ou seja, de-adesão) em células endoteliais com adesão estabelecido para este substrato. Os tratamentos destes dois experimentos são essencialmente idênticas, excepto para o tempo de oxidação mediada por MPO fibronectina (isto é, antes da adesão da célula - Experiência 1; depois de adesão celular - Experiência 2). </li></ol> 3. Experiência 2: Quantificação celular endotelial De-adesão de fibronectina em resposta a MPO mediada Fibronectin Oxidação (impedância Cell-substrato e imagens de células vivas) <ol><li> Brasão fibronectina em 96 poços de microeletrodos de ouro umrrays para medições de impedância célula-substrato (adicionar 80 ul / poço de fibronectina a 5 jig / ml em PBS e incubar durante 2 horas a 37 ° C) ou pratos de 35 mm de cultura de células com fundo de vidro para análise de imagem de células vivas (adicionar 2 ml / prato de fibronectina a 5 jig / ml em PBS e incubar durante 2 horas a 37 ° C). </li><li> Bloco superfícies com BSA. Adicionar BSA a 0,2% w / v em PBS nos volumes indicados em 3.1 e incubar durante 2 horas a 37 ° C. </li><li> Incubar as superfícies com MPO para permitir a ligação de fibronectina a MPO. Adiciona-se 20 nM de MPO humano purificado em HBSS nos volumes indicados em 3.1 e incubar durante 0,5 horas a 37 ° C. </li><li> Wash superfícies duas vezes com HBSS para remover qualquer MPO não ligado. </li><li> Células endoteliais suspensos sementes (preparadas em Meio 199 contendo 1% w / v de BSA isento de soro; ver 1.3) sobre as superfícies revestidas com fibronectina ou nativas de rolamento MPO. <ol><li> Adicionar 200 ul / poços a 2,5 x 10 5 células / ml a 96 bem célula-substrato matrizes impedância microeléctrodos. </li> &lt;li&gt; Adicionar 2 ml / prato em 5 x 10 5 células / ml a 35 milímetros de vidro de fundo placas de cultura de células. </li></ol></li><li> Imediatamente após células semeadura (isto é, antes de qualquer adesão e espalhamento): <ol><li> Mount 96 poços placas rede de microeletrodos para o porto de impedância incubadora célula-substrato (alojado em um 37 ° C incubadora na presença de 5% de CO 2) e fazer leituras &#39;em branco&#39; para iniciar a aquisição contínua de dados do índice de células (cf. Seção 2.10 ). </li><li> Transferência de 35 milímetros de vidro de fundo pratos de cultura de células para uma incubadora a 37 ° C na presença de 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Incubar as células a 37 ° C durante 2 horas para permitir a ligação máxima e espalhamento (ver Secção 2.11). </li><li> Resumidamente remover os (leituras de índice de células pausa neste momento) placa de 96 poços rede de microeletrodos ou 35 milímetros de vidro de fundo de cultura celular prato do 37 ° C incubadora, remover o sobrenadante celular e adicionar aquecido (37 ° C) HBSS (volumes como per passo 3.1). NOTA: HBSS é empregue quando estudando MPO catalisada reacções oxidativas em vez de meio de cultura completo, como o último contém espécies oxidáveis ​​que interferem com as reacções de oxidação. </li><li> Para examinar o efeito de inibidores / moduladores de reacções catalisadas por MPO (substratos de enzimas, inibidores de enzimas alternativas ou antioxidantes) ou inibidores da sinalização celular (por exemplo, 40 uM blebbistatin para inibir a contractilidade actomiosina), adicionar estes agora. </li><li> Colocar imediatamente a placa de matriz de microeléctrodos de volta para os (as medições de índice de células re-iniciar-se este ponto) 37 ° C ou a incubadora porta de vidro 35 milímetros de fundo de células de cultura prato de volta na incubadora a 37 ° C, e permitir que as células se equilibrar na HBSS durante 0,5 h. NOTA: Após equilíbrio 0,5 hr em HBSS, os valores do índice de células estabilizar em valores ligeiramente mais baixos; quando as células pré-incubação com substratos de enzimas, e os inibidores da enzima de sinalização celular ou anti-oxidantes, por um lado assegurar que tstas não afectam significativamente os valores obtidos após equilíbrio. </li><li> Iniciado MPO-catalisada, oxidação fibronectina HOCl-dependente e de-adesão. <ol><li> Para os estudos de células de impedância, utilizando placas de 96 poços de matriz microeléctrodo: <ol><li> Remova a placa de rede de microeletrodos da incubadora e pausar medidas do índice de célula. </li><li> Adicionar H 2 O 2 (concentração final de 0-10 mM) para a HBSS e misturar suavemente por pipetagem repetida. </li><li> Imediatamente, re-montar a rede de microeletrodos de volta para a porta C incubadora de 37 ° e re-iniciar a aquisição de leituras de índice celular. </li></ol></li><li> Para os estudos de imagens de células vivas usando 35 milímetros vidro de fundo de cultura de células prato: <ol><li> Remova a placa de cultura da incubadora e montar para a 37 ° C fase aquecida de um microscópio confocal invertido equipado com uma lente objetiva de 63X água com óptica DIC adequados para a gravação de filmes de células vivas. </li><li> Concentre-se em células eotimizar óptica DIC (iluminação Köhler, retardo viés e deslocamento da câmera / ganho; para detalhes, ver 13). </li><li> Iniciado DIC filme e registrar leituras iniciais de células não tratadas durante 1 min. </li><li> Adicionar H 2 O 2 (concentração final de 0-10 uM) e misturar suavemente por pipetagem repetida. Mude o foco do microscópio (se necessário) e continuar a gravação de filmes DIC das células tratadas para o período de tempo necessário. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Análise de Dados e Apresentação <ol><li> Dados impedância Cell-substrato <ol><li> Exportação de dados brutos (índice em função do tempo de células) em uma planilha. </li><li> Para os estudos de células de aderência (Experiência 2: Secção 3), normalizar os dados, definindo valores registados imediatamente antes do início da oxidação mediada fibronectina MPO-em um valor de 1 (isto é, imediatamente antes da adição de H 2 O 2 em 3,11 .1.1). NOTA: Isso garante que, em relaçãomudanças nos valores de índice de células induzidas pela oxidação fibronectina MPO mediada não são mascarados por pequenas diferenças iniciais nos valores do índice de células absolutas entre poços. <ol><li> Os presentes dados como parcelas de índice normalizado de células (eixo y) versus tempo (eixo x). </li></ol></li></ol></li><li> Dados imagens de células vivas (estudos de células de-adesão no Experimento 2: Seção 3) <ol><li> Abra DIC vivo filmes de imagiologia celular registados imediatamente antes e após a iniciação da oxidação da fibronectina MPO mediada por um programa de análise de imagem padrão (por exemplo, o software ImageJ). </li><li> Em pelo menos dois filmes DIC separadas aleatoriamente selecionar várias células e medir a sua área projetada em quadros sequenciais (por exemplo, em intervalos de 1 min), traçando manualmente seu bordo da membrana e quantificar o número de pixels fechados. </li><li> Exportar dados brutos (área celular projetado em função do tempo) para uma planilha Excel e normalizar os dados da área de células, definindo valores registados imediatamente antes daa iniciação da oxidação da fibronectina MPO mediada por um valor de 1 (isto é, imediatamente antes da adição de H 2 O 2 em 3.11.2.3). </li><li> Os presentes dados como um gráfico de área normalizada de células (eixo y) versus tempo (eixo x). </li></ol></li></ol>

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	<li>Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+focal+adhesions+and+barrier+function.">Endothelial focal adhesions and barrier function.</a> J Physiol. 569, 359-366 (2005).</li><li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions.">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).</li><li>Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. 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Os autores não têm divulgações a fazer.

Adesão de células-matriz e de processos de adesão pode ser quantificada de forma precisa e em tempo real com alta resolução temporal utilizando impedância célula-substrato e analisa imagens de células vivas. Estas abordagens em tempo real fornecem uma grande vantagem sobre as análises de ponto final de adesão celular, que fornecem baixa resolução temporal. Ao quantificar com precisão as respostas de-adesão rápidas com alta resolução temporal, estas análises podem fornecer uma visão crítica sobre como...

Contactos adesivas estáveis ​​entre as células e a sua matriz extracelular circundante são necessários para a manutenção da homeostase dos tecidos. Por exemplo, a adesão de células endoteliais com a matriz subendotelial em vasos sanguíneos desempenha um papel crítico na manutenção da integridade da camada endotelial e sua função homeostática como uma barreira vascular reguladora, semi-permeável 1. O citoesqueleto de actina é acoplado mecanicamente ao adesivo moléculas de matriz em locais de adesão célula-matriz e contactos adesivas na interface de célula-matriz desempenham um papel importante na determinação da posição da membrana celular por resistir forças de tracção dirigidas actomiosina centralmente. Estímulos extracelulares que alteram a adesão célula-matriz necessariamente alterar o equilíbrio de forças na interface de células-matriz, um evento que é rapidamente &quot;detectado&quot; por proteínas de sinalização sensível ao mecano, resultando na transdução de &quot;fora-de sinalização&quot;. Esta aposta cross-talkween células e a sua matriz extracelular circundante desempenha um papel chave no controlo da forma celular, motilidade, função, proliferação e sobrevivência 2. Processos patofisiológicos diversas (desenvolvimento embrionário, inflamação, reparação de feridas e metástases do cancro) são caracterizadas por remodelação dinâmica de substratos de matriz adesiva por oxidantes e / ou enzimas que degradam a matriz 3,4. Por exemplo, as proteínas da matriz adesiva subendoteliais nos vasos sanguíneos (por exemplo, fibronectina) estão implicados como importantes alvos para a alteração ou degradação em doenças inflamatórias humanas devido à produção localizada de oxidantes reactivos (por exemplo, ácido hipocloroso, HOCl) pela enzima derivada de leucócitos mieloperoxidase (MPO), que se acumula no interior da sub-endotélio vascular durante a doença inflamatória (Figura 1) 5-9. As alterações na adesão célula-matriz induzidas pelos oxidantes derivados de MPO e outros estímulos de modificação de matriz são likely a desempenhar papéis importantes na modificação da homeostase vascular durante um variedade de processos patológicos, por exemplo, alterando a sinalização celular endotelial, a morfologia e a viabilidade, o que por sua vez perturba a função endotelial e a integridade da barreira. No entanto, as respostas celulares e morfológicas de sinalização de células aderentes às modificações da matriz extracelular só agora começam a ser entendido. Para entender como modificações da matriz conduzir alterações na dinâmica de adesão celular e as vias de sinalização celulares dependentes de adesão, são necessárias técnicas que quantificar com precisão alterações na adesão célula-matriz em tempo real, com elevada resolução temporal. Aqui, descrevemos impedância célula-substrato complementar e técnicas de imagens de células vivas que preenchem estes critérios e proporcionar uma plataforma para quantificar a adesão celular e processos de aderência de uma forma não-invasiva. Nós mostramos como estes impedância célula-substrato e apro imagens de células vivasdores podem ser prontamente utilizados para (i) monitorizar a dinâmica de adesão e espalhamento (ou seja, de novo, a adesão de células) em substratos de matriz nativos e modificados e (ii) para medir a dinâmica de desprendimento de células-matriz (isto é, de aderência ) por células aderentes expostas aos estímulos de modificação de matriz. O sistema xCELLigence célula-substrato impedância biosensor fornece uma medição contínua da área de contato de matriz celular por meio da quantificação de impedância elétrica na superfície de 96 poços matrizes de microeletrodos de ouro e expressa essas medidas de impedância elétrica como &quot;índice de célula &#39;, um valor sem dimensão, que é em grande parte proporcional à área de contacto célula-substrato 10 (Figura 2), sendo simultaneamente sensíveis a alterações na distância média entre o (isolante) da membrana celular e a superfície do eléctrodo 11. Um aumento adicional nos valores de índice de célula também é conseguido mediante a formação de apertado contactos célula-célula that restringir o fluxo de corrente paracelular, 11 condições que não prevalecem dentro das experiências descritas neste estudo. Medição da área projetada de células individuais ao longo do tempo por análise de imagem de time-lapse contraste de interferência diferencial (DIC) filmes fornece uma medida complementar de mudanças na área de contato célula-substrato e fornece informações adicionais sobre a natureza precisa e dinâmica do alterações morfológicas quantificados pela abordagem impedância célula-substrato. Especificamente, descreve-se a aplicação destas abordagens para controlar a forma como a oxidação das proteínas da matriz subendotelial adesivas (por exemplo, fibronectina) (i) MPO mediada reduz a aderência de novo de células endoteliais em suspensão em fibronectina purificada e (ii) desencadeia célula-matriz de -adhesion em células endoteliais com a adesão estabelecida com fibronectina. Através da realização de sinalização celular paralelo análises ao longo do tempo usando biochem relevanteensaios iCal (por exemplo, transferência de Western), as relações temporais e causais entre processos de adesão / de-adesão e suas alterações em células de eventos de sinalização dependentes de adesão pode ser determinada. Estas abordagens foram recentemente utilizados para demonstrar que a oxidação da matriz extracelular catalisada por depósitos subendoteliais de MPO provoca uma rápida perda de aderência célula-matriz de células endoteliais que é accionado por pré-existente forças contrácteis 9 actomiosina. É importante notar que, permitindo o relacionamento temporal entre mudanças tanto na adesão celular e adesão celular dependente de sinalização a ser determinado, estas abordagens identificaram que a modificação da matriz induzida por MPO e de aderência celular provoca alterações em vias de sinalização celulares dependentes de adesão importantes, incluindo Src cinase fosforilação dependente de paxilina e cadeia leve da miosina II fosforilação (Figura 1) 9. Este modo de sinalização dependentes de redox, involving a activação dos acontecimentos de sinalização intracelular através de reacções oxidativas extracelulares que perturbam a adesão de células-matriz, representa um novo modo de sinalização celular denominado &quot;fora-de sinalização redox&quot; (Figura 1) 9. Em geral, estes complementar biossensor impedância célula-substrato e abordagens imagem de células vivas deve ser valioso em revelar como diferentes estímulos ou agentes de modificação da matriz conduzir alterações na dinâmica de adesão celular, a morfologia e a sinalização dentro de diferentes tipos de células-sujeitas a uma grande variedade de aderentes configurações experimentais. O protocolo a seguir descreve como quantificar o impacto da oxidação matriz MPO mediada no de novo a adesão das células endoteliais (Experimento 1) e célula processos de-adesão endotelial (2 Experiment). MPO liga avidamente a fibronectina e outras proteínas da matriz extracelular subendoteliais adesivas e noses de peróxido de hidrogénio (H 2 O 2), para converter os iões cloreto (Cl -) para a cloração oxidante altamente reactivo do ácido hipocloroso (HOCl), que reage localmente com estas proteínas de matriz e interrompe as suas propriedades de adesão celular (Figura 1) 8,9, 12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1328">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:223px;">Company</td>
			<td style="width:151px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:551px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array</td>
			<td style="width:223px;">ACEA Biosciences / Roche</td>
			<td style="width:151px;">E-Plate 96</td>
			<td>single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">blebbistatin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">B0560</td>
			<td>selective inhibitor of non-muscle myosin-II</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Lonza</td>
			<td style="width:151px;">BW-6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">05470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGM-2 BulletKit</td>
			<td style="width:223px;">Lonza</td>
			<td style="width:151px;">CC-3162</td>
			<td>endothelial cell growth media kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Fibronectin, lyophilized powder</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">F-4759</td>
			<td>from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish</td>
			<td style="width:223px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:151px;">FD35-100</td>
			<td>Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Gelatin from bovine skin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">G9391</td>
			<td>cell culture substratum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:223px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">107298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Medium-199</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">11150-059</td>
			<td>serum-free cell media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Methionine</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M9500</td>
			<td>quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes</td>
			<td style="width:223px;">Millipore</td>
			<td style="width:151px;">475911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system</td>
			<td style="width:223px;">ACEA Biosciences / Roche</td>
			<td style="width:151px;">-</td>
			<td>Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Trypsin-EDTA (0.5%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using cell-substrate impedance and live cell imaging to measure real-time changes in cellular adhesion and de-adhesion induced by matrix modification

A adesão celular de matriz desempenha um papel chave no controlo da morfologia das células e sinalização. Os estímulos que perturbam a adesão de células-matriz (por exemplo, mieloperoxidase e outras oxidantes modificadores da matriz / enzimas libertados durante a inflamação) estão implicados em provocar alterações patológicas em função celular, fenótipo e viabilidade de uma série de doenças. Aqui, descrevemos como impedância célula-substrato e abordagens imagens de células vivas podem ser facilmente usadas para quantificar com precisão as alterações em tempo real na adesão celular e de-adesão induzida pela modificação da matriz (usando células endoteliais e myeloperoxidase como um estímulo de modificação da matriz fisiopatológico) com alta resolução temporal e de um modo não-invasivo. O sistema da impedância célula-substrato xCELLigence quantifica de forma contínua a área de adesão célula-matriz através da medição da impedância eléctrica na interface célula-substrato em células cultivadas em matrizes de microeléctrodos de ouro. A análise das imagens de time-lapse differencial filmes de contraste de interferência quantifica mudanças na área projectada de células individuais ao longo do tempo, que representa as alterações na área de contacto célula-matriz. Ambas as técnicas quantificar com precisão as rápidas mudanças nos processos de adesão celular e de aderência. Impedância Cell-substrato em matrizes de microeletrodos biossensores fornece uma plataforma para medições robusto, de alta taxa de transferência. Imagens de células vivas analisa fornecer detalhes adicionais sobre a natureza ea dinâmica das alterações morfológicas quantificados por medidas de impedância célula-substrato. Estas abordagens complementares fornecer valiosos novos insights sobre como catalisada por mieloperoxidase modificação oxidativa da subcelulares componentes da matriz extracelular desencadeia mudanças rápidas na adesão celular, morfologia e sinalização em células endoteliais. Estas abordagens são aplicáveis ​​também para o estudo da dinâmica de adesão celular em resposta a outros estímulos de modificação da matriz e em células aderentes relacionados (por exemplo, células epiteliais).

Quantificação em tempo real da célula de-adesão endotelial de fibronectina em resposta à oxidação fibronectina MPO-mediada (Experimento 2). A semeadura de suspensões de células endoteliais para nativa (MPO livre) fibronectina ou MPO-rolamento resultados fibronectina na fixação das células máxima e se espalhando dentro de 2 horas, tal como avaliado por um plateauing de valores de índice de células na medições de impedância do substrato celular (Figura 3A). Esta fase ini...

Watch this Scientific Journal Video about Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification at JoVE.

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar continuamente os processos de adesão celular e de aderência com alta resolução temporal de uma forma não-invasiva por impedância célula-substrato e imagens de células vivas analisa. Estas abordagens revelar a dinâmica dos processos de adesão célula / de aderência desencadeadas por modificação da matriz e a sua relação temporal com os eventos de sinalização dependentes de adesão.

Usando impedância Cell-substrato e imagens de células vivas para medir as mudanças em tempo real no celular Adesão e De-adesão Induzidas por Matrix Modificação

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.8K visualizações.  University of New South Wales.  Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar continuamente os processos de adesão celular e de aderência com alta resolução temporal de uma forma não-invasiva por impedância célula-substrato e imagens de células vivas analisa. Estas abordagens revelar a dinâmica dos processos de adesão célula / de aderência desencadeadas por modificação da matriz e a sua relação temporal com os eventos de sinalização dependentes de adesão. 

Vídeo: Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Em células vivas, imagens de células que expressam proteínas fluorescentes Migrando-marcado em uma matriz tridimensional

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Bioengenharia

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Colheita Murino macrófagos alveolares e Avaliação de ativação celular induzida por nanopartículas polianidrido

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to investigate mechanisms governing cell adhesion under dynamic flow conditions. For instance, cancer cells labeled with multiple fluorophores can be perfused over a potentially reactive substrate to model mechanisms of cancer metastasis. However, multi-channel single camera systems and color cameras exhibit shortcomings in image acquisition for real-time live cell analysis. To overcome these limitations, we used a dual camera emission splitting system to simultaneously capture real-time image sequences of fluorescently labeled cells in the flow chamber. Dual camera emission splitting systems filter defined wavelength ranges into two monochrome CCD cameras, thereby simultaneously capturing two spatially identical but fluorophore-specific images. Subsequently, psuedocolored one-channel images are combined into a single real-time merged sequence that can reveal multiple target molecules on cells moving rapidly across a region of interest.

Dual camera emission splitting systems for two-color fluorescence microscopy generate real-time image sequences with exceptional optical and temporal resolution, a requirement of certain live cell assays including parallel plate flow chamber adhesion assays. When software is employed to merge images from simultaneously acquired emission channels, pseudocolored image sequences are produced.

Simultaneamente Capturar imagens em tempo real em dois canais de emissão Usando um sistema de separação, Dual Camera Emissão: Aplicações de Adesão Celular

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

O uso de chips microfluídicos para Imagens ao vivo e estudo das respostas Lesão em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. To this end, cells are grown in special culture chambers on top of opposing, circular gold electrodes. A constant small alternating current is applied between the electrodes and the potential across is measured. The insulating properties of the cell membrane create a resistance towards the electrical current flow resulting in an increased electrical potential between the electrodes. Measuring cellular impedance in this manner allows the automated study of cell attachment, growth, morphology, function, and motility. Although the ECIS measurement itself is straightforward and easy to learn, the underlying theory is complex and selection of the right settings and correct analysis and interpretation of the data is not self-evident. Yet, a clear protocol describing the individual steps from the experimental design to preparation, realization, and analysis of the experiment is not available. In this article the basic measurement principle as well as possible applications, experimental considerations, advantages and limitations of the ECIS system are discussed. A guide is provided for the study of cell attachment, spreading and proliferation; quantification of cell behavior in a confluent layer, with regard to barrier function, cell motility, quality of cell-cell and cell-substrate adhesions; and quantification of wound healing and cellular responses to vasoactive stimuli. Representative results are discussed based on human microvascular (MVEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), but are applicable to all adherent growing cells.

This protocol reviews Electric Cell-substrate Impedance Sensing, a method to record and analyze the impedance spectrum of adherent cells for the quantification of cell attachment, proliferation, motility, and cellular responses to pharmacological and toxic stimuli. Detection of endothelial permeability and assessment of cell-cell and cell-substrate contacts are emphasized.

Elétrica Cell-substrato impedância Sensing para a quantificação do endotelial Proliferação, Barreira Function, e Motilidade

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today&#8217;s preclinical research and clinical practice.

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

Universal de mão tridimensional Optoacoustic imagem Sonda para Deep Tissue Angiografia Humano e Estudos pré-clínicos funcionais em Tempo Real

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, we report a combined photoacoustic and clinical ultrasound imaging system by integrating an ultrasound probe with light delivery for small animal imaging. We demonstrate this by showing sentinel lymph node imaging in small animals along with minimally invasive real-time needle guidance. A clinical ultrasound platform with access to raw channel data allows the integration of photoacoustic imaging leading to a handheld real-time clinical photoacoustic imaging system. Methylene blue was used for sentinel lymph node imaging at 675 nm wavelength. Additionally, needle guidance with dual modal ultrasound and photoacoustic imaging was shown using the imaging system. Depth imaging of up to 1.5 cm was demonstrated with a 10 Hz laser at a photoacoustic imaging frame rate of 5 frames per second.

A clinical handheld photoacoustic imaging system will be demonstrated for real-time non-invasive small animal imaging.

Hand-Held fotoacústico clínico sistema de imagem para imagens de animais em tempo real não-invasiva pequenas

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualizando a formação de adesão em células por meio de avançados girando a reflexão interna Total disco microscopia de fluorescência

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Medição de metaloproteinase matriz celular Global e atividade metabólica em hidrogel 3D

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Um modelo de cultura de matriz-adipócito extracelular humano para estudar crosstalk metabólico de matriz e células

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...