CIBC comunhão (JA) e NSERC subvenção (RZ). Somos gratos a Roch M. Comeau (Brainsight) por sua ajuda em relação à câmara de infravermelhos, os rastreadores MR compatíveis e suporte de hardware. Agradecemos também a Brian Hynes (Hybex Innovations Inc.), que projetou o braço multi-articulado para suporte da bobina e forneceu algumas das figuras exibidas no vídeo. E um agradecimento especial a todos os técnicos e MR Ferreira M. do Centro McConnell Brain Imaging do Instituto Neurológico de Montreal, que nos ajudou a otimizar o projeto do experimento.

O protocolo é dividido em uma sessão de dois dias (não necessariamente consecutivas). O primeiro dia é composto de um localizador fMRI composta com um anatômicas e funcionais de exames de RM para definir para cada participante das áreas a ser alvo de TMS. O segundo dia consiste em sessões de fMRI pré-e pós-TMS TMS onde é aplicado dentro do scanner utilizando um especial MR bobina TMS compatível (Magstim Ltd., País de Gales, Reino Unido) e um sistema estereotáxica frameless (Brainsight). O último é usado para a posição em tempo real, a bobina TMS em áreas corticais em relação aos dados anatômicos e funcionais de cada participante. 1. Sessão Localizer <ul><li> Comece com a aquisição de uma imagem anatômica de alta resolução do participante. </li><li> Em seguida, a aquisição de imagens funcionais usando um gradiente de eco EPI pulso e um paradigma amostras dispersas a fim de minimizar qualquer efeito BOLD ou mascaramento auditivo devido a ruído de varredura MRI 14,15. No nosso caso, é realizada RMf durante uma tarefa melodia em que os participantes têm de determinar se dois períodos consecutivos de cinco nota-melodias são a 2,16 iguais ou diferentes. A tarefa de controle não-discriminação auditiva também está incluído, em que os sujeitos ouvir duas iguais de comprimento padrões de cinco notas, todas no mesmo tom de C5 e são instruídos a clicar com o botão esquerdo após o segundo estímulo. Períodos de silêncio também são inseridos aleatoriamente entre os ensaios de tarefas em cada execução. No total, 72 estudos são apresentados em uma ordem aleatória: 24 ensaios de discriminação melodia, 24 ensaios de controle auditivas e 24 períodos de silêncio, para uma duração total de 12 min 16 seg. </li><li> Definir o local de estimulação usando anatômicas e / ou funcionais marcos. Deve-se ter consciência de que TMS é limitado em relação à profundidade do local de estimulação devido à atenuação da intensidade do campo eléctrico em profundidade, e não podem esperar para chegar a áreas mais profundas do que 3 cm 6,17. Um passo fundamental é usar pontos de referência semelhantes para cada parteicipant, o que pode ser difícil devido às diferenças na anatomia e função entre os participantes. Aqui, temos por meta giro de Heschl em cada participante, localizado usando ambos os marcos anatômicos e funcionais. Nós usamos máscaras de giro de Heschl fornecida pelos atlas Harvard-Oxford estruturais ( <a href="http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/data/atlas-descriptions.html" target="_blank">http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/data/atlas-descriptions.html</a> ) ea meta TMS é definido individualmente pelo pico de ativação em giro de Heschl 2. Além disso, também definem a posição de vértice, o qual será utilizado como um local de controlo para controlar os efeitos não-específicos de TMS como artefatos acústicos e somatossensorial. O vértice é definida anatomicamente como um ponto intermediário entre o inion ea ponte do nariz, e equidistante dos entalhes direito e esquerdo intertragal. A ordem do local de estimulação (giro ou seja Heschl ou vértice) é contrabalançada emindivíduos. </li></ul> 2. Pré e Pós-TMS Experimento fMRI Pré-TMS sessão fMRI <ul><li> Preparar o participante para ir diretamente no scanner. Isto inclui a remoção de metal e enchimento do TMS e MR forma de triagem. </li><li> Comece a aquisição MR com um anatômicas e uma varreduras funcionais (idêntico ao realizado na sessão do localizador, ver seção 1). </li></ul> Estereotaxia sem moldura e TMS no ambiente de ressonância magnética O sistema de estereotaxia frameless é composto por uma câmera infravermelha (Polaris Spectra), algumas ferramentas e trackers (Brainsight) utilizados para o processo de registo e um computador. O computador está localizada do lado de fora do quarto do scanner, mas posicionada na entrada da sala scanner e a porta do scanner é mantida aberta durante a aplicação de TMS. As ferramentas e rastreadores são MR compatível, bem como o tripé (home-made) apoiar a câmera infravermelha e são poerefore utilizado dentro da sala de scanner. A câmera infravermelha não é MR-compatível, e, portanto, está posicionado no interior da sala do scanner, próximo a porta do scanner em cerca de dois metros da superfície do scanner (veja a discussão para procedimento de segurança). O TMS sistema estimulador está localizado em uma sala adjacente à sala de scanner de ressonância magnética. Nós usamos uma ressonância magnética da bobina TMS compatível localizado no interior da sala de scanner e conectado ao sistema de TMS através de um cabo de 7 m por meio de um tubo de filtro de RF. <ul><li> Carregar imagens anatômicas e funcionais seu participante e as metas de estimulação para o pacote de software estereotáxica (Brainsight por exemplo). Aqui, vamos ser alvo de giro de Heschl direito. </li><li> Após a aquisição fMRI pré-TMS, remova a parte superior MR bobina de cabeça da bobina de cabeça de 32 canais (se usar o scanner 3T Siemens eo canal-32 configuração de bobina de cabeça). </li><li> Em seguida, deslize para baixo o participante na mesa do scanner. </li><li> Fixar a cabeça e conjunto rastreador no participcabeça formiga. </li><li> Monte o braço multi-articulado para o scanner e corrigir o MR bobina TMS compatível para o braço. </li><li> Verificar que todos os trackers ea bobina está no campo de visão da câmara. Aqui, a câmera é um pouco deslocado para o lado direito do participante para permitir um mais fácil encalço dos deslocamentos da bobina quando o direcionamento do hemisfério direito. </li><li> Calibrar cabeça do sujeito com as ferramentas de estereotaxia (isto é ferramenta de ponteiro). Isto é feito por vários pontos de referência coregistering sobre a cabeça do participante (por exemplo, no nosso caso, a ponta do nariz, o násio e o trago de ambas as orelhas) com os mesmos pontos de referência para os dados anatómicos. Neste processo, dois experimentadores são necessários, uma perto da cabeça do participante para posicionar a ferramenta de ponteiro na cabeça do participante, o experimentador e outra na entrada da sala do scanner para realizar o registo no computador. </li><li> Posicione o MR bobina TMS compatível tangencial para tele couro cabeludo, e os seguidores de bobina dirigida para a câmara de infravermelhos. A bobina está orientada com o punho apontando para trás da bobina e paralela à linha central do 2. Corrigir a posição da bobina com os parafusos no braço multi-articulado. </li><li> Na sala ao lado do aparelho de ressonância magnética, ligar o sistema TMS e começar a estimulação. TMS é aplicado seguindo um protocolo padronizado, ou seja, a estimulação disparo contínuo teta (CTBS), que consiste em 3 pulsos em 50Hz, repetido em 5Hz por 40 segundos. Usamos uma intensidade de estimulação fixa (41%) definido pela saída do estimulador 18,19. Nós escolhemos este protocolo, tal como foi mostrado para modular a plasticidade cortical por um período de até 30 minutos após a cessação do estímulo em populações saudáveis ​​20, (ver a secção de discussão do procedimento de segurança). </li></ul> Pós-TMS sessão fMRI <ul><li> Uma vez que a estimulação está completa, é importante para obter o objecto de volta para dentro do scanner o mais rapidamente possível. Remover o TMS bobina da sala de scanner, e retirar o braço multi-articulado. Deslize para trás a cabeça do participante para a bobina de cabeça MR. Garantir o seu scanner está preparado e pronto para ir. Nosso conselho é manter a plataforma levantada do corpo durante a sessão de TMS todo, e reduzir o número e duração das verificações localizador a um mínimo. </li><li> Porque os efeitos da EMTr são transitórios, a sessão de digitalização final deve começar com a leitura funcional. Mais uma vez, foram realizadas fMRI durante uma corrida de 12 min a tarefa de melodia. </li><li> Após a verificação final está completo, terminar com uma varredura anatômica. </li></ul> 3. Resultados representativos As análises dos dados de ressonância magnética são conduzidos separadamente para os fMRI sessão de pré-e pós-TMS. Para cada sessão de fMRI (ou seja, pré e pós-TMS), o contraste entre as melodias e as tarefas de controlo auditivo mostra tarefa relacionada com a atividade no esquerdo e direito Heschl giros, giros temporal superior, inferior frontal giros e precentral giros (Figura 1 A, B). Para avaliar as diferenças entre as sessões de fMRI pré e pós-TMS, realizamos uma análise do efeito aleatório de Student teste t pareado. A significância é determinada usando conjuntos identificados por az limiar&gt; 2 e um limiar de cluster corrigida de p = 0,05. Figura 1 C representa o contraste pós-minus pré-CTBS para um único participante. Os dados sugerem que CTBS visando o direito Heschl giro (círculo) induz um aumento na resposta fMRI no contralateral (esquerdo) córtex auditivo, incluindo giro de Heschl esquerda. Alterações na resposta fMRI também são encontradas no giro esquerdo pós-central, deixou insula, e no córtex occipital lateral, bilateralmente. No entanto, não houve mudança significativa na resposta fMRI é visto sob a bobina. Além disso, o protocolo semelhante TMS-fMRI combinada é repetido para estimular o (sítio controle) vértice. Comparação das sessões de pré-e pós-fMRI com CTBS aplicadas sobre o vértice não mostrou qualquer significant efeito (dados não mostrados). <img src="/files/ftp_upload/3985/3985fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Análise de dados individuais pré-TMS RMf (A), pós-TMS fMRI dados (B) e de pós-minus de dados pré-TMS RMf (C). A. Resultados do contraste discriminação melodia menos ensaios de controlo auditivos para um único participante na sessão fMRI pré-TMS (A) e na sessão fMRI pós-TMS (B). Da esquerda para a direita: vista axial, coronal e sagital. Em ambos (A) e (B), a bobina de TMS tem como alvo o direito Heschl gyrus (círculo preto), situado em x = 54, y = -13, z = 1 (MNI152 espaço padrão). Para ambas as sessões de pré e pós-TMS fMRI, as coordenadas são exibidas em x = -54, y = -13, z = 1 (MNI152 espaço padrão) para mostrar as mudanças no hemisfério esquerdo no local da estimulação (giro ou seja, direito Heschl ). C. Resultados do contraste pós-minus sessões pré-TMS fMRI Student utilizando teste t emparelhado.

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós descrevemos um protocolo combinando TMS offline e fMRI para investigar a organização funcional do córtex auditivo. Nas próximas seções, vamos discutir os fatores metodológicos a considerar na realização de tal abordagem. Aquisição e tempo de pós-TMS sessão fMRI Ordem de aquisição exames e contrabalançando de sessões de fMRI pré e pós-TMS É crucial para adquirir uma verificação anatómica MR, antes e de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome de material </td><td> Tipo </td><td> Companhia </td></tr><tr><td> A estimulação magnética transcraniana </td><td> Magstim Super Rapid2 estimulador, Rapid-2 Plus One Módulo </td><td> Magstim Ltd., País de Gales, Reino Unido </td></tr><tr><td> Bobina para estimulação magnética </td><td> MRI-compatível 70 milímetros figura-de-oito-coil </td><td> Magstim Ltd., País de Gales, Reino Unido </td></tr><tr><td> A ressonância magnética </td><td> 3-T do scanner Trio Siemens, bobina de cabeça de 32 canais </td><td> Siemens, Inc., Alemanha </td></tr><tr><td> Estereotaxia Frameless </td><td> Brainsight </td><td> Vampira Research Inc., de Montreal, Canadá </td></tr><tr><td> Sistema de medição óptica </td><td> Polaris Spectra </td><td> Northern Digital Inc, Ontario, Canadá </td></tr><tr><td> Multi-articulado braço para suporte da bobina </td><td> Padrão </td><td> Hybex inoíons Inc., Anjou, Canadá </td></tr><tr><td> MRI-Compatível fones de inserção </td><td> Sensimetrics, Modelo S14 </td><td> Sensimetrics Corporation, MA, EUA </td></tr></tbody></table>

mapping the after-effects of theta burst stimulation on the human auditory cortex with functional imaging

Córtex auditivo se refere ao processamento de som, que está na base da fala ou música relacionada com o processamento 1. No entanto, apesar dos recentes progressos consideráveis, as propriedades funcionais e de lateralização do córtex auditivo humano estão longe de serem totalmente compreendidos. Estimulação Magnética Transcraniana (TMS) é uma técnica não-invasiva que pode transitoriamente ou duradoura modular a excitabilidade cortical através da aplicação de pulsos localizados de campo magnético, e representa um método exclusivo de explorar a plasticidade e conectividade. Ele só recentemente começou a ser aplicada para entender a função auditiva cortical 2. Uma questão importante no uso de TMS é que as consequências fisiológicas da estimulação são difíceis de estabelecer. Apesar de muitos estudos TMS fazer a suposição implícita de que a área alvo da bobina é a área afectada, esta necessidade não é o caso, em particular para as funções cognitivas complexas which dependem de interações em várias regiões cerebrais 3. Uma solução para este problema é combinar TMS com ressonância magnética funcional (fMRI). A idéia aqui é que fMRI irá fornecer um índice de mudanças na atividade cerebral associada com TMS. Assim, fMRI daria um meio independente de avaliar quais áreas são afetadas pela TMS e como eles são modulados 4. Além disso, a IRMf permite a avaliação de conectividade funcional, o que representa uma medida do acoplamento temporal entre regiões distantes. Assim, pode ser útil não só para medir a actividade de modulação de líquido induzido pela TMS em determinados locais, mas também do grau em que as propriedades da rede são afectados pela TMS, via quaisquer alterações observadas na conectividade funcional. Abordagens diferentes para combinar TMS e de imagem funcional de acordo com a ordem temporal dos métodos. RM funcional pode ser aplicado antes, durante, após ou antes e depois da TMS. Recentemente, Alguns estudos intercalados TMS e fMRI, a fim de proporcionar linha de mapeamento das alterações funcionais induzidas por TMS 5-7. No entanto, esta combinação de linha tem muitos problemas técnicos, incluindo os artefactos estáticos resultantes da presença da bobina TMS na sala de scanner, ou os efeitos dos impulsos de TMS sobre o processo de formação de imagens MR. Mas, mais importante, o ruído acústico alto induzida por TMS (aumentada em comparação com a utilização padrão, devido à ressonância do scanner furo) e as vibrações de aumento da bobina (TMS causado pelas fortes forças mecânicas devido ao campo magnético estático do scanner de MR) constituem um problema crucial quando se estuda o processamento auditivo. Esta é uma razão pela qual fMRI foi realizado antes e depois da TMS no presente estudo. Abordagens semelhantes têm sido utilizados para atingir o córtex motor 8,9, córtex pré-motor 10, principal córtex somatossensorial 11,12 e língua áreas relacionadas com a 13, Mas até agora nenhum estudo combinado TMS-fMRI investigou o córtex auditivo. O objetivo deste artigo é o de fornecer pormenores sobre o protocolo e considerações necessárias para combinar com sucesso essas duas ferramentas neurocientíficas para investigar processamento auditivo. Anteriormente nós mostramos que TMS (EMTr) em freqüências altas e baixas (resp. 10 Hz e 1 Hz) aplicados sobre o tempo de resposta córtex auditivo modulado (RT) em uma tarefa de discriminação melodia 2. Também mostramos que a RT de modulação foi correlacionada com a conectividade funcional na rede auditivo avaliadas utilizando fMRI: quanto maior a conectividade funcional entre os córtices auditivos esquerdo e direito durante o desempenho da tarefa, maior é o efeito facilitador (isto é, redução RT) observada com a rTMS. No entanto, essas conclusões foram principalmente correlacional, como fMRI foi realizada antes da EMTr. Aqui, fMRI foi realizada antes e imediatamente após o TMS para fornecer medidas diretasda organização funcional do córtex auditivo, e mais especificamente da reorganização de plástico da rede neural auditiva que ocorre após a intervenção neural fornecida pelo TMS. RMf combinadas e TMS aplicados sobre o córtex auditivo deve permitir uma melhor compreensão dos mecanismos cerebrais de processamento auditivo, fornecendo informações fisiológicas sobre efeitos funcionais do TMS. Este conhecimento pode ser útil para muitas aplicações de neurociência cognitiva, bem como para optimizar a aplicações terapêuticas de TMS, particularmente em distúrbios relacionados auditivo.

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Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Processamento auditivo é a base de voz e música relacionada com o processamento. Estimulação Magnética Transcraniana (TMS) foi usado com sucesso para estudar cognitivas, sistemas sensoriais e motores, mas raramente tem sido aplicada para a audição. Aqui nós investigamos TMS combinados com ressonância magnética funcional para entender a organização funcional do córtex auditivo.

Mapear as sequelas de Theta Explosão Estimulação no córtex auditivo humano com Imagem Funcional

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

mapping-after-effects-theta-burst-stimulation-on-human-auditory

Research

JoVE Journal

Biology

13.7K visualizações.  McGill University. Processamento auditivo é a base de voz e música relacionada com o processamento. Estimulação Magnética Transcraniana (TMS) foi usado com sucesso para estudar cognitivas, sistemas sensoriais e motores, mas raramente tem sido aplicada para a audição. Aqui nós investigamos TMS combinados com ressonância magnética funcional para entender a organização funcional do córtex auditivo.

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Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

Rotulagem e hESCs hMSCs com óxido de ferro nanopartículas para Não-invasiva em Rastreamento vivo com ressonância magnética

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Biologia

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Functional Imaging with Reinforcement, Eyetracking, and Physiological Monitoring

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcement.  However, the use of reinforcers such as juice and airpuffs can create challenges for fMRI.  Reinforcer delivery can cause head movement, which creates artifacts in the fMRI signal.  Reinforcement can also lead to changes in heart rate and respiration that are mediated by autonomic pathways.  Changes in heart rate and respiration can directly affect the fMRI (BOLD) signal in the brain and can be confounded with signal changes that are due to neural activity.  In this presentation, we demonstrate methods for administering reinforcers in a controlled manner, for stabilizing the head, and for measuring pulse and respiration.

This presentation demonstrates the use of fMRI to study neural circuits that underlie decision-making. Simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcements to investigate how outcomes affect decision processes.

Imagem Funcional com reforço, eyetracking e Monitoramento Fisiológico

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

Ressonância paramagnética eletrônica Micro-imagem das Espécies ao vivo para o Mapeamento de oxigênio

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Um alelo-específico do ensaio Expressão Gênica para testar as bases funcionais das Associações de Genética

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

Imagem Funcional de gordura marrom em ratos com FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Método de Avaliação de efeitos de uma gama de comprimentos de onda e intensidades de Terapia da Luz Vermelha / near-infrared sobre o estresse oxidativo<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Gap juncional intercelular comunicação: um biomarcador funcional para avaliar os efeitos adversos de tóxicos e toxinas, e Benefícios para a saúde de produtos naturais

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

SA-&amp;#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

Ensaio de triagem à base de SA-β-galactosidase para a identificação de medicamentos Senoterapêuticos

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

Aplicação do movimento passivo da cabeça para gerar acelerações definidas nas cabeças dos roedores

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...