CIBC 휄로 십 (JA)와 NSERC 기금 (RZ). 우리는 적외선 카메라에 대한 그의 도움을 Roch M. Comeau (Brainsight), MR 호환 추적 및 기타 하드웨어 지원에 감사하고 있습니다. 우리는 또한 코일 홀더에 대한 다중 관절 팔을 설계하고 비디오에 표시되는 그림의 일부를 제공 브라이언 Hynes (Hybex 혁신 주​​식회사)에 감사하고 있습니다. 그리고 우리가 실험의 디자인을 최적화 도움 몬트리올 신​​경학 연구소의 맥코넬 브레인 이미징 센터의 모든 MR 기술자와 M. 페레이라에 특별 감사드립니다.

프로토콜은 이틀간의 세션 (반드시 연속)에 나누어 져 있습니다. 첫 날은 해부학과 영역이 TMS를​​ 타겟팅 할 각 참가자에 대해 정의 할 수있는 기능 MR 검사로 구성 fMRI 로컬 라이져로 구성되어 있습니다. 두 번째 날은 fMRI 세션으로 구성되어 사전 및 TMS는 특별한 MR 호환 TMS 코일 (Magstim (주), 웨일즈, 영국)과 frameless stereotactic 시스템 (Brainsight)를 사용하여 스캐너 내부에 적용 후 TMS. 후자는 각 참가자의 해부학 및 기능적 데이터를 기준으로 대뇌 피질의 영역에 실시간으로 TMS 코일의 위치로 사용됩니다. 1. 로컬 라이져 세션 <ul><li> 당신의 참가자의 고해상도 해부학 적 이미지를 획득와 함께 시작합니다. </li><li> 그런 다음, 모든 BOLD 효과 나 MRI 스캔 소음 14,15으로 인해 청각 마스킹을 최소화하기 위해 그라디언트 에코 에피 맥박과 스파 스 샘플링 패러다임을 사용하여 기능 이미지를 획득. 우리의 경우, fMRI는 D를 수행하고 있습니다참가자가 2 개의 연속 5 노트 멜로디가 동일한 또는 다른 2,16 경우 결정해야하는 멜로디 작업을 uring. 차별 금지의 청각 제어 작업은 피사체는 5 노트의 2 개의 같은 길이 패턴, C5의 동일한 피치의 모든을 듣고 두 번째 자극에 따라 왼쪽 버튼을 클릭 지시되는, 포함되어 있습니다. 침묵의 기간은 각 실행의 작업 재판 중 무작위로 삽입됩니다. 12 분 16 초 총 기간 동안, 멜로디 차별, 24 청각 제어 실험 및 침묵의 24 기간의 24 시험 : 총 72 시련은 무작위 순서로 표시됩니다. </li><li> 해부학 및 / 또는 기능 랜드 마크를 사용하여 자극 사이트를 정의합니다. 하나는 TMS 때문에 깊이에서 전기장 강도의 감쇠의 자극 사이트의 깊이에 대한 제한된다는 사실을 인식 할 수 있으며, 3cm 6,17보다 더 깊은 영역에 도달 할 예상 할 수 없습니다. 중요한 단계는 각 부분에 대해서도 이와 유사한 랜드 마크를 사용하는 것입니다때문에 참가자 사이의 해부학 적 구조와 기능의 차이 어려울 수 icipant. 여기, 우리는 해부학 및 기능 랜드 마크를 사용하여 위치 각 참가자의 Heschl의 이랑을 타겟팅합니다. 우리는 하버드 - 옥스포드 구조 atlases (에 의해 제공 Heschl의 이랑의 마스크를 사용 <a href="http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/data/atlas-descriptions.html" target="_blank">http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/data/atlas-descriptions.html</a> )와 TMS 대상은의 봉우리로 개별적으로 정의됩니다 Heschl의 이랑이 내 활성화. 또한, 우리는 또한 음향 및 somatosensory 유물 등 TMS의 비 특정 효과를 제어 할 컨트롤 사이트로 사용됩니다 정점 위치를 정의합니다. 정점은 inion과 코의 다리 사이에 점 중간으로 해부학 적 정의, 그리고 오른쪽과 왼쪽 intertragal 노치에서 등거리 있습니다. 자극의 사이트의 순서 (예 Heschl의 이랑이나 정점)이 맞은 편에 counterbalanced입니다개인. </li></ul> 2. 사전 및 사후 TMS fMRI 실험 사전 TMS fMRI 세션 <ul><li> 스캐너에 직접 가서 할 수있는 참가자를 준비합니다. 이 금속의 제거 및 TMS와 MR 검사 양식을 작성을 포함합니다. </li><li> 해부학 및 기능 검사 (로컬 라이져 세션에서 수행 한 동일한 섹션 1 참조) MR 획득을 시작합니다. </li></ul> MRI 환경에서 Frameless stereotaxy 및 TMS frameless stereotaxy 시스템은 적외선 카메라 (폴라리스 스펙트럼), 등록 절차와 컴퓨터에 사용되는 도구 및 추적 (Brainsight)로 구성되어 있습니다. 컴퓨터가 스캐너 객실 바깥에 있지만, 스캐너 객실의 입구에 위치하여 스캐너 문 TMS 응용 프로그램을하는 동안 열려 보관됩니다 수 있습니다. 도구 및 추적이 MR 호환뿐만 아니라 적외선 카메라를 지원하는 삼각대 (집에서 만든)하고 일 아르erefore는 스캐너 방 안에서 사용됩니다. 적외선 카메라는 MR-호환되지 않습니다, 따라서 스캐너 침대에서 약 2 미터 스캐너 문 근처에있는 스캐너 실, (안전 절차에 대한 논의를 참조) 내부에 위치하고 있습니다. TMS stimulator 시스템은 MRI 스캐너 룸에 인접한 방에 자리 잡고 있습니다. 우리는 스캐너 룸 내부에 위치하고 있으며 RF 필터 튜브를 통하여 7 m 케이블을 통해 TMS 시스템에 연결 MRI 호환 TMS 코일을 사용합니다. <ul><li> stereotactic 소프트웨어 패키지 (예 : Brainsight)에 참가자의 해부학 및 기능적 이미지와 자극 목표를로드합니다. 여기, 우리는 바로 Heschl의 이랑을 대상으로합니다. </li><li> 사전 TMS fMRI 취득 후, 32 채널 헤드 코일 (지멘스 3T 스캐너 및 32 채널 헤드 코일 구성을 사용하는 경우)의 상부 MR 헤드 코일 부분을 제거합니다. </li><li> 다음, 스캐너 침대 참가자를 끼 웁니다. </li><li> particip의 헤드 밴드와 추적기 세트를 수정개미의 머리. </li><li> 스캐너 침대에 다중 관절 팔을 장착하고 팔 위에 MR 호환 TMS 코일을 해결할 수 있습니다. </li><li> 모든 추적 및 코일 카메라의 시야에 있는지 확인합니다. 여기, 카메라가 약간 오른쪽 뇌를 타겟팅 할 때 코일 변위의 쉽게 추적 활성화를 위해 참가자의 오른쪽으로 이동합니다. </li><li> stereotaxy 도구 (즉, 포인터 도구)를 사용하여 피사체의 머리를 보정합니다. 이것은 해부학 적 데이터에 같은 랜드 마크와 참가자의 머리 (코 nasion하고 두 귀 tragus의 끝 우리 같은 경우에는 예를 들어)에 여러 랜드 마크를 coregistering 통해 이루어집니다. 이 절차에서는 두 experimenters는 한 참가자의 머리에 포인터 도구를 위치로 참가자의 머리를 가까이 필요하며, 스캐너 객실의 입구에있는 다른 실험은 컴퓨터에 등록을 수행 할 수 있습니다. </li><li> t에 접선 MR 호환 TMS 코일의 위치를그는 두피와 코일 추적은 적외선 카메라를 향해 지시했다. 코일은 중간 선 2 역 및 병렬 가리키는 코일 핸들 방향입니다. 다중 관절 팔에 나사를 사용하여 코일의 위치를​​ 수정했습니다. </li><li> MRI 스캐너에 인접한 객실에서, TMS 시스템에 활성화하고 자극을 시작합니다. TMS는 40 대에 5Hz에서 반복 50Hz에서 3 펄스에 구성된 패턴 프로토콜, 즉 지속적인 세타 버스트 자극 (cTBS)에 따라 적용됩니다. 우리는 stimulator 출력 18,19에 의해 정의 된 고정 된 자극의 강도를 (41 %)을 사용합니다. 이 (안전 절차에 대한 토론 섹션을 참조), 건강 인구 (20)에서 자극을 중지 한 후 30 분에 진행되는 동안 대뇌 피질의 소성을 조절하기 위해 표시되었습니다 우리는이 프로토콜을 선택했습니다. </li></ul> 후 TMS의 fMRI 세션 <ul><li> 일단 자극이 완료, 그것은 가능한 한 빨리 스캐너에 따라 다시하는 것이 중요합니다. T를 제거MS의 스캐너 방에서 코일, 그리고 다중 관절 팔을 제거합니다. MR 헤드 코일에 참가자의 머리를 다시 밀어 넣습니다. 스캐너가 준비하고 갈 준비가되어 있는지 확인하십시오. 우리 조언는 전체 TMS 세션 동안 모금 된 몸 플랫폼을 유지하고, 최소로 로컬 라이져 검사의 수와 기간을 감소시키는 것입니다. </li><li> rTMS의 효과는 일시적이기 때문에, 최종 스캔 세션 기능 검사로 시작해야합니다. 다시 말하지만, 우리는 멜로디 작업의 12 분 실행되는 동안 fMRI를 실시했다. </li><li> 최종 검사가 완료되면 해부학 스캔으로 마무리. </li></ul> 3. 대표 결과 fMRI 데이터의 분석은 전후 TMS fMRI 세션 모두에 대해 개별적으로 실시하고 있습니다. 각 fMRI 세션의 경우 (즉, 사전 및 사후 TMS), 멜로디와 청각 제어 작업 사이의 대비는 왼쪽과 오른쪽 Heschl의 gyri, 우수한 시간적 gyri, 열악한 정면 gyri와 precen에서 작업 관련 활동을 보여줍니다tral gyri (그림 1 A, B). 사전 및 사후 TMS fMRI 세션 간의 차이를 평가하기 위해, 우리는 학생의 짝을 t-테스트를​​ 사용하여 임의 효과 분석을 수행합니다. 의의는 AZ&gt; 2 임계 값 및 P의 수정 클러스터 임계 값 = 0.05으로 식별 클러스터를 사용하여 결정됩니다. 그림 1 C은 하나의 참가자에 대한 대비 이후 마이너스 사전 cTBS를 나타냅니다. 데이터는 오른쪽 Heschl의 이랑 (검정색 원)을 대상 cTBS은 왼쪽 Heschl의 이랑을 포함하여 contralateral (왼쪽) 청각 피질에서 fMRI 응답의 증가를 유도하는 것이 좋습니다. fMRI 응답의 변화도 왼쪽 postcentral 이랑에서 발견되며, insula 왼쪽, 그리고 측면 뒤통수 피질의 양자. 그러나, fMRI 응답에 큰 변화는 코일에서 볼 수 없습니다. 또한, 유사한 결합 TMS-fMRI 프로토콜은 꼭지점 (제어 사이트)를 자극 반복됩니다. 꼭지점으로 적용 cTBS과 전후 fMRI 세션의 비교는 significa를 표시하지 않았습니다NT 효과 (데이터 표시되지 않습니다.) <img src="/files/ftp_upload/3985/3985fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 개인 사전 TMS fMRI 데이터 (A), 후 TMS fMRI 데이터 (B) 및 사후 마이너스 사전 TMS fMRI 데이터 (C) 분석. 사전 TMS fMRI 세션 (A)과 후 TMS fMRI 세션 (B)에서 한 참가자에 대한 대비 멜로디 차별 마이너스 청각 제어 재판의 A. 결과. 왼쪽에서 오른쪽으로 : 축 코로나 및 시상 전망을 즐기실 수 있습니다. 에서 모두 (A)와 (B), TMS 코일은에있는 오른쪽 Heschl의 이랑 (검은 색 원)을 목표로하고있다 X = 54, Y = -13, z는 = 1 (MNI152 표준 공간). 모두 사전 및 사후 TMS fMRI 세션를 들어, 좌표에 표시됩니다 X = -54, y = -13, z는 자극의 사이트 (즉, 오른쪽 Heschl의 이랑에서 왼쪽 반구의 변화를 게재 할 수 = 1 (MNI152 표준 공간) ). C.에 대비 결과 학생의 짝을 t-테스트를​​ 사용하여 이후 마이너스 사전 TMS fMRI 세션.

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리는 오프라인 TMS 및 청각 피질의 기능 조직을 조사 할 fMRI를 결합 프로토콜을 설명합니다. 다음 섹션에서, 우리는 이러한 접근 방식을 실시 할 때 방법 론적 요소가 고려 설명합니다. 후 TMS의 fMRI 세션에 대한 수집 및 타이밍 스캔 획득의 순서와 전후 TMS fMRI 세션의 counterbalancing 이 두 기능 검사 사이에 강력한 등록을 위해 TMS ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 재료 이름 </td><td> 유형 </td><td> 회사 </td></tr><tr><td> Transcranial 자석 자극 </td><td> Magstim 슈퍼 Rapid2 stimulator, 빠른-2 플러스 한 모듈 </td><td> Magstim (주), 웨일즈, 영국 </td></tr><tr><td> 자기 자극에 대한 코일 </td><td> MRI 호환 70mm의 그림 -의 8 코일 </td><td> Magstim (주), 웨일즈, 영국 </td></tr><tr><td> 자기 공명 영상 </td><td> 3 T 지멘스 트리오 스캐너, 32 채널 헤드 코일 </td><td> 지멘스, 주식회사, 독일 </td></tr><tr><td> Frameless Stereotaxy </td><td> Brainsight </td><td> 악성 연구 주식회사, 몬트리올, 캐나다 </td></tr><tr><td> 광학 측정 시스템 </td><td> 폴라리스 스펙트럼 </td><td> 북부 디지털 Inc의 온타리오, 캐나다 </td></tr><tr><td> 코일 홀더를위한 다중 관절 팔 </td><td> 표준 </td><td> Hybex Innovat이온 주식회사, 안주, 캐나다 </td></tr><tr><td> MRI 호환 삽입 이어폰 </td><td> Sensimetrics, 모델 S14 </td><td> Sensimetrics 공사, MA, USA </td></tr></tbody></table>

mapping the after-effects of theta burst stimulation on the human auditory cortex with functional imaging

청각 피질 음성 또는 음악 관련 처리 (1)의 기초에 있습니다 소리의 처리에 관계된. 그러나, 상당한 최근 진행에도 불구하고, 인간의 청각 피질의 기능 속성과 lateralization 훨씬 완전히 이해되지 않도록합니다. Transcranial 자석 자극 (TMS)은 transiently 또는 lastingly 지역화 된 자기장 펄스의 응용 프로그램을 통해 대뇌 피질의 흥분을 조절 할 수있는 비 침습적 기술이며, 소성 및 연결을 탐험의 독특한 방법을 나타냅니다. 단지 최근에 청각 대뇌 피질의 기능 2를 이해하는 적용하기 시작했습니다. TMS를 사용하는 중요한 문제는 자극의 생리적 결과가 수립하기 어려운 점입니다. 많은 TMS 연구는 코일의 대상이 지역은 면적이 영향을 것을 암시 가정을하지만,이 특히 복잡한인지 기능을 위해, whi의 경우 필요가 없습니다채널은 여러 뇌 영역 3에서 상호 작용에 따라 달라집니다. 이 문제를 해결하는 한 가지 방법은 기능성 자기 공명 영상 (fMRI)으로 TMS를​​ 결합하는 것입니다. 여기 아이디어는 fMRI는 TMS와 관련된 뇌 활동의 변화의 색인을 제공한다는 것입니다. 따라서, fMRI는 영역이 TMS 및 방법 4 변조 된 아르에 의해 영향을하는 평가의 독립적 인 방법을 제공합니다. 또한, fMRI는 먼 지역 사이의 시간적 커플 링의 측정을 나타내는 기능 연결의 평가를 할 수 있습니다. 이 때문에 기능 연결에서 관찰 된 변화를 통해 주어진 위치에서 TMS에 의해 유도 그물 활동 변조뿐만 아니라 네트워크 속성 TMS의 영향에 대한 정도를 측정하는데 유용뿐만 아니라이 될 수 있습니다. 다른 접근 방법은 방법의 시간적 순서에 따라 TMS 및 기능 영상을 결합 존재합니다. 기능성 MRI는 이후시 이전에 적용, 또는 TMS 이전과 이후 모두 할 수 있습니다. 최근에일부 연구는 5-7 TMS에 의해 유도 기능 변경의 온라인 매핑을 제공하기 위해 TMS와 fMRI를 인터리브. 그러나,이 온라인 조합은 스캐너 방에 TMS 코일, 또는 MR 이미지 형성 과정에 대한 TMS 펄스의 효과의 존재로 인해 정적 유물 등 많은 기술적 인 문제를 가지고 있습니다. 하지만 더 중요한 것은, 큰 음향 소음은 TMS (때문에 스캐너 구멍의 공명의 표준 사용에 비해 증가)와 증가 TMS 코일 진동 (MR 스캐너의 정적 자기장으로 인해 강한 기계적 힘에 의해 발생)에 의해 유도 청각 처리를 공부할 때 중요한 문제를 구성합니다. 이 fMRI는 본 연구에서 TMS 이전과 이후 실시 된 이유 중의 하나입니다. 비슷한 접근 방식은 모터 피질 8,9, premotor 피질 10, 기본 somatosensory 피질 11,12 및 언어 관련 분야 13를 타겟팅하는 데 사용 된하지만, 아직까지 결합 TMS-fMRI 연구는 청각 피질을 조사 없습니다. 이 문서의 목적은 성공적으로 청각 처리를 조사하기 위해 두 neuroscientific 도구를 결합하는 데 필요한 프로토콜 및 고려 사항에 관한 세부 정보를 제공하는 것입니다. 이전에 우리는 보여 그 멜로디 차별 작업 2에 청각 피질 변조 된 응답 시간 (RT)을 통해 적용 높고 낮은 주파수 (resp. 10 Hz에서 1 Hz에서)에서 반복적 인 TMS (rTMS). 우리는 또한 RT 변조는 fMRI를 사용하여 청각 네트워크의 기능 연결과 평가 상호 것을 보여 주었다 : 작업 수행시 왼쪽과 오른쪽 청각 cortices 사이의 높은 기능 연결, facilitatory 효과 (예 : RT 감소)가 rTMS를 관찰 높다. fMRI는 rTMS 전에 수행 한 그러나 이러한 연구 결과는 주로 correlational했다. 여기 fMRI는 이전에 수행 된 즉시 TMS 후 직접 조치를 제공하기 위해청각 피질의 기능 조직의 등을 구체적으로 TMS에서 제공 한 신경 개입 이후 발생하는 청각 신경 네트워크의 플라스틱 개편의. 결합 fMRI와 청각 피질을 통해 적용 TMS는 TMS의 기능 효과에 대한 생리 정보를 제공, 청각 처리의 뇌 메커니즘에 대한 이해를 설정해야합니다. 이 기술은 많은인지 신경 과학의 응용 프로그램에 대한뿐만 아니라 특히 청각 관련 장애에 TMS의 치료 응용 프로그램을 최적화에 유용 할 수 있습니다.

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Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

청각 처리는 음성 및 음악 관련 처리의 기초이다. Transcranial 자석 자극 (TMS)은인지, 감각 및 모터 시스템을 공부하고 성공적으로 사용되어 왔습니다 있지만, 거의 오디션 적용되지 않았습니다. 여기 청각 피질의 기능 조직을 이해하기 위해 기능 자기 공명 영상과 함께 TMS를​​ 조사했다.

쎄의 후유증을 매핑하는 기능 영상과 함께 인간 청각 컴퓨터에 접속 자극을 버스트

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.8K 조회수.  McGill University. 청각 처리는 음성 및 음악 관련 처리의 기초이다. Transcranial 자석 자극 (TMS)은인지, 감각 및 모터 시스템을 공부하고 성공적으로 사용되어 왔습니다 있지만, 거의 오디션 적용되지 않았습니다. 여기 청각 피질의 기능 조직을 이해하기 위해 기능 자기 공명 영상과 함께 TMS를​​ 조사했다.

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Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

이런 산화물로 hESCs과 hMSCs을 라벨링하는 MR 영상과 생체내 추적 비침습에 대한 Nanoparticles

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

연구

생물학

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

광학 이미징과 비침습 감지를위한 형광 염료와 함께 줄기 세포를 라벨링

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Functional Imaging with Reinforcement, Eyetracking, and Physiological Monitoring

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcement.  However, the use of reinforcers such as juice and airpuffs can create challenges for fMRI.  Reinforcer delivery can cause head movement, which creates artifacts in the fMRI signal.  Reinforcement can also lead to changes in heart rate and respiration that are mediated by autonomic pathways.  Changes in heart rate and respiration can directly affect the fMRI (BOLD) signal in the brain and can be confounded with signal changes that are due to neural activity.  In this presentation, we demonstrate methods for administering reinforcers in a controlled manner, for stabilizing the head, and for measuring pulse and respiration.

This presentation demonstrates the use of fMRI to study neural circuits that underlie decision-making. Simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcements to investigate how outcomes affect decision processes.

강화, Eyetracking 및 생리 감시 기능 이미징

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

전자 스핀 공명 산소 매핑에 대한 라이브 종의 마이크로 이미징

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

유전자 협회의 기능 기초를 테스트하는 Allele 특정 유전자 발현 분석

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

FDG micro-PET/CT와 마우스의 브라운 지방의 기능 영상

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

파장과 산화 스트레스에 레드 / 근적외선 치료의 강렬의 범위의 효과의 평가를위한 방법<em&gt; 체외</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

갭 접합부 세포 간 통신 : 천연 제품의 독성 물질과 독소의 반작용을 평가하기위한 기능성 바이오 마커, 보건 혜택

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

SA-&amp;#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

SA-β-갈락토시다아제 계 선별 분석법

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

설치류의 머리에서 정의된 가속도를 생성하기 위한 수동 머리 움직임의 적용

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...