This work was supported through funding from the NIH/NIBIB R00 Award (4R00EB008738), Okawa Foundation Research Grant Award, NIH Director's New Innovator Award (1DP2OD007265), the NSF CAREER Award (1056008), and the Alfred P. Sloan Foundation Research Fellowship. J.H.L. would like to thank Karl Deisseroth for providing the DNA plasmids used for the optogenetic experiments. The authors would also like to thank Andrew Weitz and Mankin Choy for editing the manuscript and all the Lee Lab members for their assistance with the ofMRI experiments.

Declaração de Ética: Os procedimentos experimentais aqui foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade de Stanford (IACUC). 1. Preparar Cabos e ponteira Implants Nota: Embora cabos de correção e implantes virola estão disponíveis comercialmente, produzindo estes in-house permite que projetos de especialidade e vai custar menos. <ol><li> Para preparar um cabo de fibra para a entrega de luz proveniente do laser ao implante no cérebro, primeiro clivar a fibra óptica ao comprimento desejado. <ol><li> Usando um cutelo de fibra, terminar a fibra óptica para produzir uma extremidade plana no ponto de ligação. Se a fibra tenha sido revestido com um revestimento, o revestimento tira fora com uma ferramenta de remoção de fibras de antemão. </li><li> Clivar a outra extremidade da fibra óptica para produzir o tamanho desejado para o cabo, assegurando que o cabo é longo o suficiente para estender-se desde a fonte de luz para o animal dentro do furo deo scanner. </li></ol></li><li> Misturar uma pequena quantidade de cola epóxi numa proporção de 1: 1 sobre um pedaço de folha de alumínio, pouco antes do passo seguinte, tal como a cola epoxi se torna demasiado viscosa para utilização 5 minutos após a mistura. </li><li> Utilizando uma pequena vara de madeira, aplicar suavemente cola epoxi para a parte da fibra que vai ser colocada no interior do lado côncavo do casquilho cerâmico e, em seguida, aplicar uma pequena gota sobre a superfície do lado plano da virola. Após a inseri-lo no interior da ponteira, assegurar que um pequeno comprimento de fibra (&lt;0,5 mm) sobressai a partir do lado plano da virola cerâmica. Permitir que a cola epóxi para endurecer O / N para melhores resultados. </li><li> No lado do cabo de fibra óptica que vai ligar à fonte de luz laser, aplicar suavemente cola epoxi para a parte da fibra que vai ser colocada no interior do lado côncavo da ponteira do conector de FC / PC e, em seguida, aplicar uma pequena cair sobre a superfície do lado plano da virola. Depois de o introduzir na ponteira, garantirque um pequeno comprimento de fibra (&lt;0,5 mm) sobressai a partir do lado plano da virola. Permitir que a cola epóxi para endurecer O / N para melhores resultados. </li><li> Polir a extremidade plana das virolas para ambos os lados do cabo usando um disco de polimento, utilizando uma pinça para aplicar pressão descendente suave na virola ao fazer rotações Figura-8 em folhas de lapidação óxido de alumínio (a partir de 3 micrómetros a 1 uM a 0,3 uM grit ). </li><li> Examinar a extremidade plana da virola com um microscópio uma ampliação de 100X. Certifique-se de que a superfície da extremidade plana, incluindo a própria superfície de fibra óptica, é livre de qualquer cola epoxi; continuar polimento se cola epóxi permanece sobre a superfície. Certifique-se de que a superfície de fibra óptica não tenha quebrado ou lascado. CUIDADO: Certifique-se de pessoal ter aulas de treinamento de segurança do laser adequados e usar óculos de segurança a laser antes de manusear equipamentos laser. </li><li> Conecte o cabo de fibra óptica para a fonte de luz laser através do conector FC / PC e alinhe a fponta Iber ao ponto focal do acoplador. Medir a potência de transmissão de luz da fibra com um medidor de energia para garantir a produção de luz adequada. Nota: Os passos seguintes são para a preparação de anéis de cerâmica com fibra ótica para implantação crônica no cérebro; virolas cerâmicas são ocos no centro e levar a fibra óptica para fornecer a luz de um cabo de rede para uma região de interesse (ROI) dentro do cérebro. </li><li> Usando um cutelo de fibra, terminar a fibra óptica para produzir uma extremidade plana no ponto de ligação. Se a fibra tenha sido revestido com um revestimento, o revestimento tira fora com uma ferramenta de remoção de fibras de antemão. </li><li> Clivar a outra extremidade da fibra óptica para produzir o desejado comprimento para implantação no cérebro. Determinar o comprimento da fibra utilizando um atlas estereotáxicas para alvejar a ROI dentro do cérebro. <ol><li> Por exemplo: para segmentar hipocampo dorsal de rato em que é de 3,5 mm abaixo da bregma, garantir que o comprimento da fibra protuberante a partir do ferrule é de 3,5 mm + 0,25 mm, correspondendo a espessura do crânio e permitindo a margem de erro. Portanto, verifique se o comprimento final da fibra é de 3,5 mm + 0,25 mm + 10,5 mm (comprimento da ponteira) = 14,25 mm. </li></ol></li><li> Misturar uma pequena quantidade de cola epóxi numa proporção de 1: 1 sobre um pedaço de folha de alumínio, pouco antes do próximo passo (a cola epoxi se torna demasiado viscosa para utilização 5 minutos após a mistura). </li><li> Utilizando uma pequena vara de madeira, aplicar suavemente cola epoxi para a parte da fibra que vai ser colocada no interior do lado côncavo do casquilho cerâmico e, em seguida, aplicar uma pequena gota sobre a superfície do lado plano da virola. Após a inseri-lo no interior da ponteira, assegurar que um pequeno comprimento de fibra (&lt;0,5 mm) sobressai a partir do lado plano da virola cerâmica. Permitir que a cola epóxi para endurecer O / N para melhores resultados. </li><li> Polir a extremidade plana da virola usando um disco de polir, usando uma pinça para aplicar pressão descendente suave na ponteira ao fazer figura-8 rotaçãos em folhas de lapidação óxido de alumínio (a partir de 3 micrómetros a 1 uM a 0,3 uM grit). </li><li> Examinar a extremidade plana da virola com um microscópio uma ampliação de 100X. Certifique-se de que a superfície da extremidade plana, incluindo a própria superfície de fibra óptica, é livre de qualquer cola epoxi; continuar polimento se cola epóxi permanece sobre a superfície. Certifique-se de que a superfície de fibra óptica não tenha quebrado ou lascado. </li><li> Casal da ponteira polido para um cabo de fibra óptica com uma manga de ferrolho e conectar o cabo de rede a uma fonte de luz laser. Medir a potência de transmissão de luz na extremidade da fibra com um medidor de energia para garantir a eficiência adequada. </li><li> Manter um registo da potência necessária da virola do cabo de remendo para cada implante ponteira de saída para o nível de potência pretendido na ponta da fibra óptica (2,5 mW neste protocolo). Descarte ponteiras com uma taxa de atenuação de mais de 50% e com padrão de produção não circular. </li></ol> 2. estereotáxica ImpCirurgia lantation e injeção de vírus <ol><li> Assegurar que quaisquer procedimentos experimentais envolvendo o uso de animais são aprovados pelo IACUC local. Manter condições assépticas durante cirurgias de sobrevivência, seguindo procedimentos assépticos, incluindo o uso de luvas estéreis, máscaras estéreis, campos cirúrgicos estéreis e instrumentos cirúrgicos esterilizados. CUIDADO: Certifique-se de que os cirurgiões estão usando equipamento adequado de proteção individual (EPI), incluindo óculos de segurança antes de iniciar o procedimento. Siga os procedimentos de biossegurança padrão quando se trabalha com vetor adeno-associado (AAV), tomando cuidado para evitar respingos. Descarte de resíduos AAV em um recipiente de risco biológico. </li><li> Carregar uma seringa de microlitro com AAV suficiente para a injecção no animal mais extra para compensar perdas de volume potencial (total de 4 mL por animal), mantendo a seringa em gelo antes da utilização. Neste protocolo, AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP a um título de 4x10 12 vg / ml é utilizada. Colocar o animal sob isofluranoe anestesia com uma câmara de indução, ligado a uma precisão isoflurano conjunto vaporizador a 3 - 4% com uma fonte de gás oxigênio. </li><li> Raspar a cabeça com um barbeador elétrico e executar um matagal cirúrgica triplo na pele usando betadine e uma lavagem de etanol a 70%. </li><li> Uma vez que o animal está em anestesia profunda (confira reflex dedo do pé e taxa de respiração), imobilizar o crânio do animal em um aparelho estereotáxico com tachas de posicionamento intra-aural e bar dente. Nota: Todo o processo vai demorar 1-2 horas, desde a indução da anestesia para a recuperação. </li><li> Defina a anestesia para um nível adequado (1-3% de isoflurano no vaporizador) e continuamente monitorar os sinais vitais do animal, ajustando a anestesia como necessário para manter a taxa de respiração de ~ 40 respirações / min. Administrar pomada oftálmica sobre os olhos do animal para evitar a secura e sob anestesia. </li><li> Faça a 15 - 20 mm incisão na linha média do couro cabeludo com um bisturi e retrair o couro cabeludo usando hemostats cirúrgicos umttached ao periósteo. lambda Referência e bregma para posicionar a broca sobre as coordenadas para o ROI. </li><li> Perfurar uma pequena craniotomia (2-3 mm) sobre o ROI com uma broca dental, tomando cuidado para não perfurar o cérebro. Lentamente, inserir a agulha ligada à seringa microlitro através da craniotomia para o ROI no cérebro. </li><li> Com uma bomba de micro-controlador, injectar 2 ul da solução de vetor para a ROI. Usar uma taxa de fluxo de 150 nl / min para evitar danos nos tecidos. Após a injecção está completa, esperar 10 minutos antes de remover a seringa, lentamente, a uma velocidade de 0,5 mm / min. </li><li> Após a injecção, secar a superfície do crânio. lambda Referência e bregma para confirmar coordenadas e, em seguida, inserir o implante virola para a profundidade de destino (por exemplo: 3,5 mm abaixo da bregma para hipocampo dorsal) a uma taxa de cerca de 0,5 mm / min. Monte o implante ponteira ao crânio com cimento dental. Depois que o cimento dental tem solidificado, selar a incisão com suturas (size 5-0 para ratos) em volta da tampa de cimento dental. </li><li> Após a cirurgia, colocar o animal na sua gaiola alojados individualmente com metade da gaiola em cima de um aquecedor para a recuperação da anestesia. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não coloque o animal na companhia de outros animais até que ele se recuperou totalmente. </li><li> Para a gestão pós-cirúrgica da dor, administrar buprenorfina por via subcutânea a cada 12 horas a uma dosagem de 0,05 mg / kg durante 24 h. Administrar pó antibiótico diário ao longo do local da incisão durante 3 dias. </li><li> Retirar as suturas de aproximadamente duas semanas após a cirurgia, para evitar formação de crostas. </li><li> Espera 4 - 6 semanas após a injecção de vírus para a expressão de genes suficiente optogenetic antes de realizar as experiências. </li></ol> 3. RM Funcional optogenética CUIDADO: Tenha cuidado ao redor do campo magnético permanente de um scanner de ressonância magnética. seguro equipmotorrinolaringológico, incluindo o gerador de funções, fonte de luz, ventilador, tanques capnógrafo e gás, suficientemente longe (pelo menos para além do limite de 5 Gauss). <ol><li> Colocar o animal sob anestesia de gás com uma câmara de indução, ligado a uma precisão isoflurano conjunto vaporizador em 5% com uma fonte de gás oxigênio. </li><li> Uma vez que o animal está em anestesia profunda (reflexo de verificação do dedo do pé e freqüência respiratória), entubar o animal de acordo com o protocolo detalhado no Rivard et al. (2006) para permitir o monitoramento de dióxido de carbono por capnografia 26. Nota: intubação é fundamental na manutenção de níveis adequados de CO 2 expiratório durante o exame. </li><li> Garantir o animal no berço scanner. Nota: Neste protocolo, o berço foi personalizado produzido, mas tais berços também estão disponíveis comercialmente. As funções berço rato para proteger o animal dentro do scanner para entrega da anestesia, ar aquecido e para a restrição de movimento. </li><li> Entregar uma mistura de isoflurano (Ranging 1,2-1,5%) em óxido nitroso a 60% e aproximadamente 40% de oxigénio através de uma tubagem através do berço. Certifique-se de que a cabeça do animal é firmemente fixado para evitar artefatos de movimento. </li><li> Fornecer ar aquecido através de tubos no berço e inserir um termômetro retal com lubrificante para monitorar a temperatura do corpo. Administrar pomada oftálmica sobre os olhos do animal para evitar a secura e sob anestesia. </li><li> Conecte o cabo de fibra óptica a uma fonte de luz laser e medir a saída na ponta da ponteira do cabo de rede com um medidor de energia. </li><li> Ajuste até ao nível de energia apropriado (determinado anteriormente no passo 1.15) para produzir o resultado desejado (2,5 mW neste protocolo) na ponta da fibra óptica implantado no interior do cérebro. Uma vez que a saída de energia excessivo a partir da fibra óptica pode potencialmente causar danos nos tecidos no interior do cérebro ou provocar o aquecimento de tecidos que irá produzir artefactos de sinal, não aumentam significativamente a potência de saída do laseralém do resultado pretendido. </li><li> Prevenir a fuga de luz a partir do implante com um cone de fita isolante preta e cobrir os olhos do animal. Acoplar o cabo de fibra óptica para o implante virola sobre o animal com uma manga de ferrolho. </li><li> Coloque a bobina na cabeça do animal. Insira o suporte com animais para dentro do furo do scanner. Nota: Neste protocolo, o de circuito único transmissor-receptor de bobina personalizado foi produzido e pré-ajustado para receber a frequência de rádio ideal do tecido cerebral. </li><li> Monitor de freqüência e temperatura corporal respiração durante todo este processo, ajustando o ventilador artificial e aquecedor como necessário para manter valores fisiológicos dentro dos limites (garantir que CO expiratória 2 é 3 - 4%, girando os botões no ventilador para ajustar a frequência do curso e do volume e que a temperatura é de 37 ° C, clicando nas setas para ajuste de temperatura). </li><li> Seleccione uma sequência de posicionamento para a imagem da localização cabeça animal. Se a bchuva não está em iso-centro, ajustar a cabeça de localização de animais e repetir a verificação de posicionamento até que o cérebro está em iso-centro. Seleccione uma sequência shimming linear e clique de carga na janela de seleção sequência. Em seguida, clique em começar a reduzir heterogeneidades do campo magnético. Nota: calço é um passo crítico que irá influenciar diretamente a integridade dos dados de fMRI. </li><li> Seleccione uma sequência ponderada em T2 e clique de carga na janela de seleção sequência. Em seguida, clique em Iniciar para adquirir imagens de alta resolução anatômicas coronais ponderadas em T2 antes da fMRI para verificar a integridade global do cérebro e para confirmar a localização do implante de fibra óptica. Nota: Estas imagens podem ser usadas como sobreposições de anatomia para a série de digitalização ofMRI. </li><li> Ligar cabos BNC a partir da porta de disparo do scanner de IRM para o gerador de função de modo a que a fonte de luz laser é conduzido de acordo com um paradigma experimental estimulação. Nota: Neste protocolo, a estimulação pAradigm é 30 segundos da linha de base seguido por 20 seg on / 40 seg off para seis min. </li><li> Selecione um multi-slice gradiente lembrou sequência de eco (GRE) e clique de carga na janela de seleção sequência. Em seguida, clique em Iniciar para adquirir 35 mm x 35 mm (2D FOV) no plano coronal com 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm Resolução espacial. Nota: A sequência GRE usada aqui tem um tempo de repetição (TR) e tempo de eco (TE) da TR / TE = 750/12 ms e um ângulo de 30 ° aleta. </li><li> Na conclusão da digitalização, remover o animal do scanner e monitor até que tenha despertado da anestesia e pode manter decúbito esternal. </li></ol> 4. Análise de Dados ofMRI Nota: Os passos seguintes são realizados em MATLAB, conforme descrito em uma publicação on-alto rendimento ofMRI 27. <ol><li> Depois que os dados de varredura em bruto foi transferido para o computador utilizado para análise, utilizar o deslizar reconstrução janela para atualizar a imagem a cada TR, comuma leitura espiral de quatro intercalam, 750 TR ms e 12 ms tempo de eco para adquirir 23 fatias por série de digitalização. Em vez de reconstrução convencional, onde novas imagens de fMRI são reconstruídos apenas após todos os intercala são adquiridos para cada fatia, o método de reconstrução janela deslizante reconstrói imagens após a aquisição de cada interleaf 27. </li><li> Processar os dados brutos para a reconstrução bidimensional gridding, correção de movimento, eo cálculo das séries temporais, como descrito anteriormente 27. </li><li> Usar um método para determinar a coerência limiar voxels activados através do cálculo da modulação por cento do sinal NEGRITO de cada voxel em relação ao período da linha de base recolhido antes da estimulação, tal como descrito anteriormente 27. Calcular valores de coerência como a magnitude da transformada de Fourier com a frequência dos ciclos de estimulação repetida dividido pela soma dos quadrados de-de todos os componentes de frequência 8. </li><li> Usando os dados de séries temporais para cada vOxel, imagens médias corrigidas-motion que pertencem a varreduras consecutivas do mesmo paradigma de estimulação primeiros. Em seguida, alinhar as imagens médias 4D para um quadro de coordenadas comum com uma transformação de seis graus de liberdade do corpo rígido, mais isotrópico dimensionamento para comparação dentro e entre os animais, como descrito anteriormente 27. </li></ol>

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	<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+local+fMRI+signals+driven+by+neurons+defined+optogenetically+by+type+and+wiring.">Global and local fMRI signals driven by neurons defined optogenetically by type and wiring.</a> Nature. 465 (7299), 788-792 (2010).</li><li>Weitz, A. J., Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+with+optogenetic+functional+MRI+and+its+translational+implications.">Progress with optogenetic functional MRI and its translational implications.</a> Future Neurol. 8 (6), 691-700 (2013).</li><li>Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informing+brain+connectivity+with+optogenetic+functional+magnetic+resonance+imaging.">Informing brain connectivity with optogenetic functional magnetic resonance imaging.</a> NeuroImage. 62 (4), 2244-2249 (2012).</li><li>Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+Activity+Across+the+Whole+Brain+Neural+Network+with+Optogenetic+Functional+Magnetic+Resonance+Imaging.">Tracing Activity Across the Whole Brain Neural Network with Optogenetic Functional Magnetic Resonance Imaging.</a> Front. Neuroinform. 5 (October), 1-7 (2011).</li><li>Kahn, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Functional+MRI+Response+Temporal+Linearity+via+Optical+Control+of+Neocortical+Pyramidal+Neurons.">Characterization of the Functional MRI Response Temporal Linearity via Optical Control of Neocortical Pyramidal Neurons.</a> J. Neurosci. 31 (42), 15086-15091 (2011).</li><li>Takata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Activation+of+CA1+Pyramidal+Neurons+at+the+Dorsal+and+Ventral+Hippocampus+Evokes+Distinct+Brain-Wide+Responses+Revealed+by+Mouse+fMRI.">Optogenetic Activation of CA1 Pyramidal Neurons at the Dorsal and Ventral Hippocampus Evokes Distinct Brain-Wide Responses Revealed by Mouse fMRI.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0121417 (2015).</li><li>Iordanova, B., Vazquez, A. L., Poplawsky, A. J., Fukuda, M., Kim, S. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+and+hemodynamic+responses+to+optogenetic+and+sensory+stimulation+in+the+rat+somatosensory+cortex.">Neural and hemodynamic responses to optogenetic and sensory stimulation in the rat somatosensory cortex.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 35 (6), 922-932 (2015).</li><li>Weitz, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+fMRI+reveals+distinct,+frequency-dependent+networks+recruited+by+dorsal+and+intermediate+hippocampus+stimulations.">Optogenetic fMRI reveals distinct, frequency-dependent networks recruited by dorsal and intermediate hippocampus stimulations.</a> NeuroImage. 107, 229-241 (2015).</li><li>Desai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+brain+networks+in+awake+mice+using+combined+optical+neural+control+and+fMRI.">Mapping brain networks in awake mice using combined optical neural control and fMRI.</a> J. Neurophysiol. 105 (December 2010), 1393-1405 (2011).</li><li>Liang, Z., Watson, G. D. R., Alloway, K. D., Lee, G., Neuberger, T., Zhang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+functional+network+of+medial+prefrontal+cortex+by+combining+optogenetics+and+fMRI+in+awake+rats.">Mapping the functional network of medial prefrontal cortex by combining optogenetics and fMRI in awake rats.</a> NeuroImage. 117, 114-123 (2015).</li><li>Byers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+in+vivo+assessment+of+human+stem+cell+graft-host+neural+circuits.">Direct in vivo assessment of human stem cell graft-host neural circuits.</a> NeuroImage. 114, 328-337 (2015).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat. Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Carter, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+arousal+with+optogenetic+modulation+of+locus+coeruleus+neurons.">Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons.</a> Nat. Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2+and+optical+control+of+excitable+cells.">Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells.</a> Nat. Methods. 3 (10), 785-792 (2006).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat. Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li><li>Ogawa, S., Lee, T. M., Kay, A. R., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+magnetic+resonance+imaging+with+contrast+dependent+on+blood+oxygenation.">Brain magnetic resonance imaging with contrast dependent on blood oxygenation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (24), 9868-9872 (1990).</li><li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+signal+changes+accompanying+sensory+stimulation:+functional+brain+mapping+with+magnetic+resonance+imaging.">Intrinsic signal changes accompanying sensory stimulation: functional brain mapping with magnetic resonance imaging.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5951-5955 (1992).</li><li>Kwong, K. K., Belliveau, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+magnetic+resonance+imaging+of+human+brain+activity+during+primary+sensory+stimulation.">Dynamic magnetic resonance imaging of human brain activity during primary sensory stimulation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5675-5679 (1992).</li><li>Canals, S., Beyerlein, M., Murayama, Y., Logothetis, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+stimulation+fMRI+of+the+perforant+pathway+to+the+rat+hippocampus.">Electric stimulation fMRI of the perforant pathway to the rat hippocampus.</a> Magn. Reson. Imaging. 26, 978-986 (2008).</li><li>Antal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+artifacts+induced+by+electrical+stimulation+during+conventional+fMRI+of+the+brain.">Imaging artifacts induced by electrical stimulation during conventional fMRI of the brain.</a> NeuroImage. 85 (3), (2014).</li><li>Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ReaChR:+a+red-shifted+variant+of+channelrhodopsin+enables+deep+transcranial+optogenetic+excitation.">ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation.</a> Nat. Neurosci. 16 (10), 1499-1508 (2013).</li><li>Christie, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRI+response+to+blue+light+delivery+in+the+na&#239;ve+brain:+Implications+for+combined+optogenetic+fMRI+studies.">FMRI response to blue light delivery in the na&#239;ve brain: Implications for combined optogenetic fMRI studies.</a> NeuroImage. 66, 634-641 (2013).</li><li>Aravanis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+neural+interface:+in+vivo+control+of+rodent+motor+cortex+with+integrated+fiberoptic+and+optogenetic+technology.">An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology.</a> J. Neural Eng. 4, S143-S156 (2007).</li><li>Pashaie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+brain+interfaces.">Optogenetic brain interfaces.</a> IEEE Rev. Biomed. Eng. 7, 3-30 (2014).</li><li>Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+deconstruction+of+parkinsonian+neural+circuitry.">Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry.</a> Science. 324, 354-359 (2009).</li><li>Rivard, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+intubation+and+ventilation+for+surgical+research.">Rat intubation and ventilation for surgical research.</a> J. Invest. Surg. 19, 267-274 (2006).</li><li>Fang, Z., Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+optogenetic+functional+magnetic+resonance+imaging+with+parallel+computations.">High-throughput optogenetic functional magnetic resonance imaging with parallel computations.</a> J. Neurosci. Meth. 218 (2), 184-195 (2013).</li><li>Da Silva, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EEG:+Origin+and+measurement.">EEG: Origin and measurement.</a> EEG - fMRI: Physiological Basis, Technique, and Applications. , 19-38 (2010).</li><li>Becker, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+dose+isoflurane+exerts+opposing+effects+on+neuronal+network+excitability+in+neocortex+and+hippocampus.">Low dose isoflurane exerts opposing effects on neuronal network excitability in neocortex and hippocampus.</a> PLoS ONE. 7 (6), 3-9 (2012).</li><li>Nishikawa, K., Maciver, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agent-selective+Effects+of+Volatile+Anesthetics+on+GABA+A+Receptor+-+mediated+Synaptic+Inhibition+in+Hippocampal+Interneurons.">Agent-selective Effects of Volatile Anesthetics on GABA A Receptor - mediated Synaptic Inhibition in Hippocampal Interneurons.</a> Anesthesiology. 94 (2), 340-347 (2001).</li><li>Jackson, J. I., Meyer, C. H., Nishimura, D. G., Macovski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+convolution+function+for+Fourier+inversion+using+gridding.">Selection of a convolution function for Fourier inversion using gridding.</a> IEEE Trans. Med. Imag. 10 (3), 473-478 (1991).</li><li>Glover, G. H., Lee, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motion+artifacts+in+fMRI:+comparison+of+2DFT+with+PR+and+spiral+scan+methods.">Motion artifacts in fMRI: comparison of 2DFT with PR and spiral scan methods.</a> Magn. Reson. Med. 33 (20), 624-635 (1995).</li><li>Kim, D. H., Adalsteinsson, E., Spielman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+analytic+variable+density+spiral+design.">Simple analytic variable density spiral design.</a> Magn. Reson. Med. 50, 214-219 (2003).</li><li>Friston, K. J., Harrison, L., Penny, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+causal+modeling.">Dynamic causal modeling.</a> Neuroimage. 19, 1273-1302 (2003).</li><li>Alkire, M. T., McReynolds, J. R., Hahn, E. L., Trivedi, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamic+microinjection+of+nicotine+reverses+sevoflurane-induced+loss+of+righting+reflex+in+the+rat.">Thalamic microinjection of nicotine reverses sevoflurane-induced loss of righting reflex in the rat.</a> Anesthesiology. 107 (2), 264-272 (2007).</li><li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection.">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Mol. Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li><li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Transduction+Efficiency,+Tropism+and+Axonal+Transport+of+AAV+Serotypes+1,+2,+5,+6,+8+and+9+in+the+Mouse+Brain.">Analysis of Transduction Efficiency, Tropism and Axonal Transport of AAV Serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the Mouse Brain.</a> PLoS ONE. 8 (9), 1-16 (2013).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-selective+control+of+cortical+and+subcortical+networks+by+central+thalamus.">Frequency-selective control of cortical and subcortical networks by central thalamus.</a> eLife. 4, e09215 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Movimento do assunto durante a imagem é uma fonte significativa de artefato que pode levar à corrupção de dados. Apropriadamente garantir o animal no suporte de imagem pode minimizar tais artefactos como irá manter níveis adequados de anestesia. Aqui, utilizou-se isoflurano mas anestésicos alternativos, tais como medetomidina ou cetamina e xilazina, deve também ser considerado. No entanto, os níveis e escolha do anestésico pode influenciar muitos parâmetros no cérebro, incluindo a resposta BOLD 28. Isoflurano pode causar alterações na excitabilidade neuronal 29. Outros anestésicos também pode afetar GABA inibição sináptica 30. Assim, a escolha da anestesia é importante quando se realiza ofMRI dada a sua capacidade de afetar a atividade neuronal. ofMRI na ausência de anestesia é possível, mas pode ser um desafio com o aumento do movimento do animal, o que pode ser reduzido se o animal está habituado; tais estudos ofMRI acordado previamente realizada umand evitaria o efeito de confusão da anestesia no cérebro 9,10. De pós-processamento de algoritmos de correcção de movimento pode ser usado para atenuar grandemente os efeitos de movimento. Vários desses métodos existem, incluindo o inverso algoritmo de Gauss-Newton empregada neste protocolo, o que minimiza a soma dos quadrados função custo da imagem de referência e imagem sob a correção. O algoritmo é útil porque permite a correção de movimento rápido e robusto, usando um design da plataforma paralela GPU para reduzir os tempos de processamento 27. Para a reconstrução dos dados neste protocolo, software personalizado escrito em um ambiente MATLAB foi utilizado para reconstrução gridding bidimensional, onde as amostras em espiral são reconstruídos em k-espaço em imagens em grade 31-33. dados de séries de tempo foram gerados através do cálculo da modulação por cento do sinal NEGRITO de cada voxel em relação ao período da linha de base recolhido antes da estimulação. Voxels cuja séries temporais foram synchronized aos blocos de estimulação optogenética com um valor de coerência de 0,35 ou superior foram definidos como voxels activados; este valor coerência corresponde a um menor que 10 -9 valor P 8. Valores de coerência foram calculados como a magnitude da transformada de Fourier com a frequência dos ciclos de estimulação repetida dividido pela soma dos quadrados de-de todos os componentes de frequcia de 8,27. erro Familywise pode ser controlada usando a correção de Bonferroni para comparações múltiplas. métodos alternativos de análise pode ser utilizado, incluindo testes estatísticos paramétricos, tais como os modelos lineares gerais (MLG). O método requer o conhecimento de coerência menos antes da HRF em comparação com o modelo linear geral convencional. Portanto, é vantajoso quando está a explorar os dados usando ofMRI. No entanto, o método de coerência só pode ser usado para dados com desenhos ou bloco seleccionado modelos de eventos relacionados com um intervalo fixo interstimulus e não pode ser utilizado nos dados ofMRI com outro evento-RELAted desenhos ou modelos mistos. Subsequentemente, modelagem causal dinâmica (DCM) pode ser utilizada para analisar interacções entre regiões cerebrais identificados através ofMRI. DCM é uma técnica estatística Bayesian desenvolvido para análise da conectividade funcional de respostas do sistema para entradas experimentais durante fMRI 34. preocupações técnicas adicionais para ofMRI são discutidos aqui. Os implantes podem ser danificados ou cair, levando à remoção do animal afectado do estudo. cirurgias de re-implantação não são recomendados devido à incerteza adicional de segmentação o mesmo ROI como na cirurgia de implante original e devido a questões de bem-estar animal. Por causa da quantidade significativa de tempo e recursos investir em cada sujeito animal, a apreciação da resistência do material é uma preocupação significativa na escolha de um cimento dentário adequado para utilização em estudos ofMRI. A cirurgia de implantação é um fator crítico para maximizar a longevidade do IMPLANt e sujeito animal. Por exemplo, assegurando que o crânio é seca antes de se aplicar o cimento dental e colocando uma quantidade adequada de cimento em torno do implante virola cerâmica pode garantir a estabilidade ao longo da linha do tempo potencial do animal meses de duração, durante o estudo. Além disso, modelos alternativos de gaiola pode ser explorado e discutido com a facilidade de cuidado animal local para evitar gaiolas com tops de arame, segurando a comida e água, que muitas vezes se projetam para dentro da jaula e oferecer oportunidades para que o animal danificar o implante. Importantemente, o cimento dental deve ser escolhido cuidadosamente para reduzir os artefactos que afectam imagiologia e cimentos alternativos pode ser testada por aplicação sobre um fantasma e imagens em um scanner antes do uso em experimentos com animais. Tentativa e erro com vários cimentos dentários mostrou que o cimento utilizado neste protocolo dá relativamente poucos artefactos. Outro desafio técnico na realização ofMRI é a precisão da colocação de fibra óptica no ROI pretendido, dada a extremely pequenas distâncias que podem existir entre os núcleos no cérebro 35. Depois de concluir as cirurgias de implantação, scans anatômicas ponderadas em T2 pode ser usada para determinar a colocação correta sobrepondo em um atlas do cérebro. A habilidade do cirurgião e da prática realizar estas cirurgias pode melhorar as taxas de colocação corretos. A especificidade e expressão da opsina na ROI pretendido pode ser verificado na conclusão do estudo de perfusão do animal e que fixa o cérebro, usando imuno-histoquímica ou a fluorescência endógena de um repórter em proteínas marcado para a opsina para visualização. Estas proteínas repórter pode ser também co-localizada com outras proteínas para assegurar que o opsina é expresso nos tipos de células neurais 1,8,15,25 desejados. Como mencionado anteriormente, os artefactos podem surgir quando se realiza ofMRI devido ao aquecimento do tecido a partir da entrega de luz 22. O aquecimento dos tecidos provoca a modificação de tempos de relaxação, resultando em sinal BOLD falsa. Para assegurar que a corrente alternadavação resultante da estimulação luz durante ofMRI não é devido a este artefacto, controlos opsina-negativa deve ser realizada em solução salina que injectada animais ou animais injectados com vectores de controlo fluoróforo (tal como o AAV-CaMKIIa-EYFP) sofrem ofMRI. Além disso, apenas fibras bem construídos implantes com uma boa eficiência óptica de transmissão de luz deve ser usado para remover a necessidade de utilização de altas potências de laser. estudos ofMRI foram realizados em que a falsa activação devido ao aquecimento dos tecidos não foi um problema 1,6-8,10,11. No que respeita à escolha do vector para introduzir os genes necessários optogenetic em neurónios para a expressão, os AAV não são conhecidos por provocar doenças nos seres humanos e são, por conseguinte, uma opção conveniente, tendo em conta o nível de segurança biológica inferior necessário para usar estes agentes (BSL-1). Além disso, um grande número de núcleos vetor realizar AAV embalados com vários genes optogenética em estoque e com vários sorotipos. O serotipo de AAV deve ser escolhido based no alvo população de células destinadas a assegurar os níveis de expressão óptimos 36,37. Os lentivírus podem também ser usados, mas requerem um maior nível de segurança biológica. O período de tempo necessário para a expressão dos genes suficientes optogenetic é variável, dependendo do modelo animal específico utilizado, no AAV particular utilizada e no paradigma experimental específica. Neste protocolo, ratos Sprague Dawley às 11 semanas de idade são usados ​​e estudos optogenetic começar quatro a seis semanas após a injecção do vírus. Os ratinhos transgénicos podem também ser utilizados em estudos optogenetic. É necessária a realização de experiências-piloto para determinar a quantidade específica de tempo necessário para a expressão suficiente dos opsins. paradigmas estimulação pode variar dependendo da opsina específico utilizado. Neste protocolo, AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP é usado eo paradigma de estimulação é 20 seg on / off 40 seg. Se usando um SSFO, o paradigma da estimulação irá variar porque o SSFO requer apenas um breve pulso de luz seja ACvado e depois de um breve pulso de luz em outro comprimento de onda a ser finalizado. Uma preocupação crítica adicional ao executar ofMRI está a impedir o vazamento de luz a partir da interface implante ponteira com o cabo de fibra óptica durante a estimulação optogenética para evitar um sinal cerebral de confusão proveniente de estimulação visual, mesmo quando o animal é anestesiado. Cones de fita isolante preta pode ser utilizada para bloquear a luz a partir das virolas e para cobrir os olhos do animal. Importante, valores fisiológicos, incluindo expiratório CO 2 e temperatura corporal do sujeito deve ser adequadamente mantida durante toda a duração da imagiologia. CO Expiratório 2 deve ser mantido entre 3-4% e a temperatura do corpo a 37 ° C. Além disso, as sequências shimming a reduzir tanto quanto possível falta de homogeneidade do campo magnético antes de se iniciar ofMRI verifica determina em grande parte a qualidade dos dados em negrito resultantes. O controlo destes factoresé crítico na produção de dados ofMRI fiáveis. Neste protocolo, DPSS lasers são usados ​​como fonte de luz para a estimulação optogenética. Porque a luz laser é coerente, mais energia suficiente pode ser facilmente fornecido através da fibra óptica. fontes de luz LED acoplado a fibra óptica estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais, mas têm a desvantagem de poder diminuído de transmissão de luz. A fonte de luz laser exige alinhamento para cada cabo especial de correção de fibra óptica, mas com a prática, o alinhamento pode ser realizado dentro de segundos a minutos. As aplicações futuras de ofMRI incluem o uso de opsins de próxima geração, tais como opsins vermelho-deslocou-se para permitir a estimulação não-invasiva durante o exame. Além disso, o implante de ressonância magnética compatível com EEG ou eléctrodos de registo semelhantes, juntamente com o implante de fibra óptica poderia permitir a aquisição de dados de alta resolução temporal, para além dos dados de alta resolução espacial de ressonância magnética. ofMRI com Electrophysiolgravação ogical poderia fornecer ampla informação sobre a conectividade funcional do cérebro. Em resumo, o poder de ofMRI para acompanhar todo o cérebro em resposta à estimulação de populações de células específicas definidas pela identidade genética ou anatómica faz ofMRI uma ferramenta essencial para utilizar no estudo de doenças neurológicas e dos conectonomia do cérebro saudável.

Optogenetic ressonância magnética (ofMRI) é um nova técnica que combina a resolução espacial de alta-campo IRMf com a precisão de estimulação optogenetic 1-11,38, permitindo mapeamento de tipo específico de células de circuitos neuronais funcionais e suas dinâmica em todo o território cérebro. Optogenetics permite a tipos específicos de células a ser orientada para a estimulação pela introdução de canais de condutância trans-membrana, chamada opsinas sensíveis à luz. Elementos específicos de circuitos neurais são geneticamente modificadas para expressar esses canais, permitindo a modulação milissegundo-calendário de atividade no cérebro intacto 1-15. fMRI fornece um método não-invasivo de determinação da resposta dinâmica mundial do cérebro à estimulação optogenética dos circuitos neurais específicos através da medição do sinal de sangue oxigênio-dependente de nível (BOLD) 16-18, que fornece uma medida indireta da atividade neuronal. A combinação destas duas técnicas, denominado optogenetic ressonância magnética (ofMRI), é vantajosa em relação a outros métodos de gravação durante a actividade cerebral, tais como a estimulação electrofisiologia, pois pode proporcionar uma vista de todo o cérebro em relativamente elevada resolução espacial. Isto permite a detecção da actividade neuronal em resposta a estimulação dirigida a grandes distâncias do local da estimulação, sem a necessidade para implantação de eléctrodos de registo invasivos 1-11. ofMRI é vantajoso sobre o método mais tradicional de realizar a estimulação elétrica durante fMRI, que pode recrutar diferentes tipos de células perto do eléctrodo e, portanto, confundir a influência causal de cada população 19. Além disso, os eléctrodos utilizados para a estimulação eléctrica e da corrente gerada podem produzir artefactos durante a RM 20. Com efeito, ofMRI permite a observação da influência sobre a actividade cerebral global a partir do modulati específicana de uma ampla variedade de tipos de células, através da utilização de técnicas avançadas de segmentação genética, tais como o sistema Cre-Lox em animais transgénicos ou a utilização de promotores. controlo óptico combinatória com monitorização de todo o cérebro é possível com ofMRI através da utilização de ambos NpHR para inibir e ChR2 para excitar tipos de células específicos. O kit de ferramentas optogenetic disponíveis para uso em ofMRI também está melhorando rapidamente ao longo do tempo com a introdução de opsins com o aumento da sensibilidade à luz ou cinética melhoradas, de opsins função etapa estabilizadas (SSFOs) ou de opsins vermelho-deslocado que pode anular a exigência de fibra implantado ópticas, permitindo a estimulação não-invasiva durante o exame 21. Estas possibilidades não estão disponíveis com estimulação elétrica. No entanto, os artefactos sinal resultante de um aquecimento do tecido devido a um fornecimento de luz no cérebro têm sido relatados 22, onde foi mostrado modificação induzida pela temperatura de tempos de relaxação para produzir pseufazer a ativação. Pesquisadores do espectáculo ofMRI deve, portanto, estar ciente desta confundem potencial. Com a configuração e controlo adequado, a questão pode ser abordada. Além disso, relativamente baixa resolução temporal de medir a resposta hemodinâmica em fMRI pode ser um fator limitante para certas aplicações desta técnica. Este protocolo descreve em primeiro lugar a construção dos implantes de fibra óptica que permitem uma entrega de comprimentos de onda específicos da luz profundamente no cérebro in vivo. O protocolo em seguida, descreve a entrega do vector viral que codifica para uma região opsina precisa cérebro utilizando cirurgia estereotáxica. Em seguida, o protocolo descreve o processo de ressonância magnética funcional do cérebro inteiro durante a estimulação de luz simultânea. Finalmente, o protocolo descreve a análise dos dados adquiridos dados de base. De nota, a optogenética descrito aqui requerem um implante crônica para a entrega de luz. No entanto, os implantes de fibra óptica são estáveis ​​e bio-compatível, permitindo varrimento longitudinal e investigação de circuito neural ao longo de um período de meses 23,24. Em resumo, a estimulação precisa e capacidade de monitorização de todo o cérebro de ofMRI são factores cruciais para tornar ofMRI uma ferramenta poderosa para o estudo dos conectonomia do cérebro. Além disso, pode proporcionar um novo discernimento sobre os mecanismos das doenças neurológicas 25 quando acoplado com diferentes modelos animais. Com efeito, ofMRI foi usado para elucidar a actividade de sub-regiões do hipocampo de rede distintas associadas a convulsões 8. Portanto, laboratórios interessados ​​em responder a perguntas de neurociência de nível de sistemas vai encontrar esta técnica de importância.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1117">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;">7 Tesla scanner</td>
			<td style="width:195px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:205px;">Discovery MR901 System</td>
			<td style="width:325px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sprague Dawley rats</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Crl:SD</td>
			<td>11 weeks old</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fiber cleaver</td>
			<td>Fujikura</td>
			<td>CT-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">multimode optical fiber</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>AFS105/125Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fiber stripper&#160;&#160;</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>T08S13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ceramic split sleeve</td>
			<td>Precision Fiber Products</td>
			<td>SM-CS1140S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">epoxy glue</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>G14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cotton-tipped applicators</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td align="right">50975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">multimode ceramic zirconia ferrules</td>
			<td>Precision Fiber Products</td>
			<td>MM-FER2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;">FC/PC multimode connector</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>30128C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fiber optic polishing disk</td>
			<td>Precision Fiber Products</td>
			<td>M1-80754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">aluminum oxide lapping sheet, 0.3 &#181;m</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>LFG03P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">aluminum oxide lapping sheet, 1 &#181;m</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>LFG1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">aluminum oxide lapping sheet, 3 &#181;m</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>LFG3P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">binocular biological microscope 40X-1000X</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>B100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">laser safety glasses</td>
			<td>Kentek</td>
			<td>KXL-62W01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;">473 nm DPSS laser</td>
			<td>Laserglow</td>
			<td>LRS-0473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">594 nm DPSS laser</td>
			<td>Laserglow</td>
			<td>LRS-0594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Allen hex wrench set</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2.0 mm (5/64&#34;) for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">power meter, Si Sensor, 400-1100 nm</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>PM121D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane (Isothesia)</td>
			<td>Henry Schein&#160;</td>
			<td align="right">50033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">isoflurane vaporizer with induction chamber</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td align="right">901806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoFil 100uL syringe</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NANOFIL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">function generator</td>
			<td>A.M.P.I.&#160;</td>
			<td>Master-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">small animal stereotax</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 940&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Model 683 small animal ventilator&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td align="right">550000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type 340 capnograph&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td align="right">733809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dental drill (rotary micromotor kit)</td>
			<td>Foredom Electric Co.</td>
			<td style="width:205px;">K.1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ophthalmic ointment (Artificial Tears)</td>
			<td>Rugby</td>
			<td>00536-6550-91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">instrument sterilizer</td>
			<td>CellPoint Scientific</td>
			<td>Germinator 500</td>
			<td>glass bead sterilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">antibiotic powder</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>NEO-PREDEF</td>
			<td>neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">buprenorphine painkiller</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC:0409-2012</td>
			<td>schedule III controlled substance , 0.3 mg/mL stock</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic functional mri

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain's global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.

<html> A Figura 1 e a Figura 2 mostram os dados representativos resultantes de 20 Hz (15 mseg de largura de impulso, 473 nm, 30% de ciclo de trabalho) optogenetic estimulação do córtex motor. Um paradigma de estimulação de 30 segundos de linha de base seguido por 20 seg on / 40 seg off para foi usada seis min. Estudos anteriores mostraram que este paradigma produz sinal NEGRITO robusta a partir de 1,8 optogenetic estimulação. A Figura 1 mostra os voxels activados detectados tanto no próprio local da estimulação (córtex motor) e no tálamo, como um resultado das conexões sinápticas de longo alcance entre essas regiões. a Figura 2 mostra que a informação temporal pode ser adquirida a partir de HRFs, como a resposta do tálamo é retardada (declive inicial inferior) comparada com a resposta após estimulação do córtex motor optogenetic. p_upload / 53346 / 53346fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Mapa A ativação do sinal BOLD induzida por optogenética Estimulação da CaMKIIa-expressando células em Motor Cortex. Valores coerência dos voxels ativos, identificados como aqueles significativamente sincronizados a estímulos repetidos, são mostradas sobrepostas em uma fatia anatômico coronal ponderada em T2. Os dados recolhidos ao longo de um período de seis min, 30 seg período (inicial da linha de base de 30 segundos e seis de estimulação ciclos de 20 seg on / 40 seg off com 473 nm de luz, 20 Hz, 15 ms de largura de pulso) são condensados ​​em um mapa de ativação. Fatias sequenciais são 0,5 mm de distância ea localização do implante de fibra óptica é indicada pelo triângulo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53346/53346fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53346/53346fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura Função 2. hemodinâmica Response. (Esquerda) A modulação por cento do sinal relativo BOLD à linha de base é mostrado para voxels ativos no córtex motor e tálamo durante a estimulação optogenética do córtex motor (seis ciclos de estimulação de 20 segundos sobre / 40 seg off com 473 nm de luz, 20 Hz, 15 ms de largura de pulso). Sombreadas barras de erro cinza indicam erro padrão em voxels activados dentro de ROI. (Direito) respostas por média de tempo são dadas pelas funções de resposta hemodinâmica (HRF). O tálamo HRF mostra uma resposta em relação adiada para o córtex motor estimulada. barras azuis indicam períodos de 473 nm fotoestimulação. Sombreadas barras de erro cinza indicam erro padrão em seis ciclos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53346/53346fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Optogenetic Functional MRI

This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.

Ressonância magnética funcional optogenética

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K visualizações.  Stanford University. This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.

Vídeo: Optogenetic Functional MRI

Measuring the Subjective Value of Risky and Ambiguous Options using Experimental Economics and Functional MRI Methods

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition termed "risky". In other cases when probabilities cannot be estimated, this is a condition described as "ambiguous". While most people are averse to both risk and ambiguity1,2, the degree of those aversions vary substantially across individuals, such that the subjective value of the same risky or ambiguous option can be very different for different individuals. We combine functional MRI (fMRI) with an experimental economics-based method3 to assess the neural representation of the subjective values of risky and ambiguous options4. This technique can be now used to study these neural representations in different populations, such as different age groups and different patient populations.
In our experiment, subjects make consequential choices between two alternatives while their neural activation is tracked using fMRI. On each trial subjects choose between lotteries that vary in their monetary amount and in either the probability of winning that amount or the ambiguity level associated with winning. Our parametric design allows us to use each individual's choice behavior to estimate their attitudes towards risk and ambiguity, and thus to estimate the subjective values that each option held for them. Another important feature of the design is that the outcome of the chosen lottery is not revealed during the experiment, so that no learning can take place, and thus the ambiguous options remain ambiguous and risk attitudes are stable. Instead, at the end of the scanning session one or few trials are randomly selected and played for real money. Since subjects do not know beforehand which trials will be selected, they must treat each and every trial as if it and it alone was the one trial on which they will be paid. This design ensures that we can estimate the true subjective value of each option to each subject. We then look for areas in the brain whose activation is correlated with the subjective value of risky options and for areas whose activation is correlated with the subjective value of ambiguous options.

Using functional MRI and behavioral methods to determine the neural representation of the subjective value of risky and ambiguous options in the human brain.

Medir o valor subjetivo de Opções de risco e ambígua usando Economia Experimental e funcional métodos de ressonância magnética

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition ...

Neurociência

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenética estimulação do comportamento de fuga em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

A estimulação optogenética do nervo auditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

De alta resolução de ressonância magnética estrutural do Subcórtex Humano<I&gt; In Vivo</I&gt; E Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenética Dissection de Circuitos medo no cérebro Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetic de arrastamento de Theta Hippocampal oscilações em comportar-se ratos

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Automated Segmentation of Cortical Grey Matter from T1-Weighted MRI Images

Within neuroimaging research, a number of recent studies have discussed the impact of between-study differences in volumetric findings that are thought to result from the use of different segmentation tools to generate brain volumes. Here, processing pipelines for seven automated tools that can be used to segment grey matter within the brain are presented. The protocol provides an initial step for researchers aiming to find the most accurate method for generating grey matter volumes from T1-weighted MRI scans. Steps to undertake detailed visual quality control are also included in the manuscript. This protocol covers a range of potential segmentation tools and encourages users to compare the performance of these tools within a subset of their data before selecting one to apply to a full cohort. Furthermore, the protocol may be further generalized to the segmentation of other brain regions.

This protocol describes the process of applying seven different automated segmentation tools to structural T1-weighted MRI scans to delineate grey matter regions that can be used for the quantification of grey matter volume.

Segmentação automática de matéria cinzenta Cortical de imagens de T1-Weighted MRI

Within neuroimaging research, a number of recent studies have discussed the impact of between-study differences in volumetric findings that are thought to ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical methods for manipulating and monitoring the activity of neurons in vivo. These types of experiments rely on two main components: 1) implantable devices that provide optical access to the brain, and 2) light-sensitive proteins that change neuronal excitability or provide a readout of neuronal activity. There are a number of ways to express light-sensitive proteins, but stereotaxic injection of viral vectors is currently the most flexible approach because expression can be controlled with genetic, anatomical, and temporal precision. Despite the great utility of viral vectors, delivering the virus to the site of optical implants poses numerous challenges. Stereotaxic virus injections are demanding surgeries that increase surgical time, increase the cost of studies, and pose a risk to the animal's health. The surrounding tissue can be physically damaged by the injection syringe, and by immunogenic inflammation caused by the abrupt delivery of a bolus of high-titer virus. Aligning injections with optical implants is especially difficult when targeting small regions deep in the brain. To overcome these challenges, we describe a method for coating multiple types of optical implants with films composed of silk fibroin and Adeno-associated viral (AAV) vectors. Fibroin, a polymer derived from the cocoon of Bombyx mori, can encapsulate and protect biomolecules and can be processed into forms ranging from soluble films to ceramics. When implanted into the brain, silk/AAV coatings release virus at the interface between optical elements and the surrounding brain, driving expression precisely where it is needed. This method is easily implemented and promises to greatly facilitate in vivo studies of neural circuit function.

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

Here, we present a method for delivering viral expression vectors into the brain using silk fibroin films. This method allows targeted delivery of expression vectors using silk/AAV coated optical fibers, tapered optical fibers, and cranial windows.

Na Vivo Alvo expressão de proteínas de Optogenetic usando seda/AAV filmes

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...