<p class="jove_step"> Manipulação de ovos </p><ol><li> Os ovos podem ser conservados a 13 ° C por até uma semana antes da incubação, sem perda significativa de viabilidade (um refrigerador do vinho pequeno é ideal para esta finalidade). </li><li> Antes da incubação, ovos para permitir que a temperatura ambiente, em seguida, coloque em uma galinha umidificado incubadora definido para 37,8 ° C (100 ° F). </li><li> Nós geralmente electroporate embriões aproximadamente 48 horas depois do início de incubação, quando o embrião atingiu Hamburger e Hamilton estágio 10. </li><li> Tempo de incubação pode variar de acordo com Hamburger desejado e estágio Hamilton. Temperatura é crítica e desvio da temperatura de incubação ideal irá alterar o tempo de incubação e viabilidade do embrião diminuir. </li><li> Durante a incubação, os ovos devem ser mantidos em seus lados para que o embrião vai ser posicionadas corretamente, de eletroporação. O embrião vai flutuar em cima da gema e é útil para marcar a parte superior do ovo com um lápis antes de janelas para que você saiba onde cortar. </li></ol><p class="jove_step"> Preparação </p><ol><li> Quente Leibovitz L-15 media a 37 ° C. Puxe capilares de vidro em agulhas. Eletrodos posição e micromanipulador e conectar eletrodos ao gerador de pulsos. </li></ol><p class="jove_step"> Windowing </p><ol><li> Usando uma seringa com agulha grande furo, furar a casca na extremidade pequena do ovo. </li><li> Apontando a agulha cuidadosamente para baixo para evitar a interrupção da gema, remover cerca de 5 ml de albumina. </li><li> Sele o orifício com um pequeno pedaço de fita. </li><li> Cobrir a parte superior do ovo com outro pedaço de fita adesiva (cerca de 4x4 cm). </li><li> Com uma tesoura curva, e tomando cuidado para não perturbar o embrião, cortar um buraco grande o suficiente para fornecer uma janela na qual trabalho. </li></ol><p class="jove_content"> <em>Opcional:</em> Para visualizar o tubo neural, injectar a solução de tinta com agulha de calibre 26 debaixo do embrião (inserir a agulha sob o embrião de fora do anel de sangue). Tinta da Índia devem ser diluídas 1:5 com Hanks ou comparáveis ​​solução estéril tamponada. </p><p class="jove_step"> Injeção e Eletroporação </p><ol><li> Quebre a ponta capilar para diâmetro desejado usando uma pinça </li><li> Usando a pipeta na boca, coloque o capilar com plasmídeo / Fast corante verde. </li><li> Posição do embrião com a cabeça em direção a você e inserir a agulha no tubo neural em um ângulo raso. </li><li> Injetar a solução de plasmídeo para o lúmen do tubo neural até dye preenche todo o espaço. </li></ol><p class="jove_note"> Nota: Tenha cuidado para não ter maiores ponta, em seguida, diâmetro do tubo neural. Em geral, você será capaz de dizer se o tamanho da ponta ideal tem sido alcançado por quão fácil ou difícil é para puxar líquido no capilar. Se houver resistência extrema, a abertura é provavelmente muito pequena ea ponta deve ser quebrado novamente mais acima. Se houver pouca ou nenhuma resistência, a abertura é muito grande e uma nova agulha deve ser usado. </p><ol><li> Coloque 1-2 gotas de estéril L-15 media sobre o embrião. </li><li> Imediatamente colocar os eletrodos em ambos os lados do embrião, em paralelo com o tubo neural, e pulso 5 vezes em 24/10 volts para 50 mseconds em intervalos de 1 segundo. Você vai ver as bolhas perto dos eletrodos se funcionou corretamente. </li><li> Remova cuidadosamente eletrodos, coloque 5 gotas de L-15 em cima dos embriões e selar o ovo com fita adesiva. Certifique-se que o ovo é bem fechados, como secagem é um dos principais contribuintes para a perda de embrião após eletroporação. </li><li> Coloque os ovos de volta para a incubadora, lado da janela para cima, e incubar até chegarem desejado H &amp; H estágio. </li></ol>

<ol>
	<li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&apos;Shocking&apos;+developments+in+chick+embryology:+electroporation+and+in+ovo+gene+expression.">&apos;Shocking&apos; developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> <em style='font-style: italic'>Nat Cell Biol</em>. <b>1</b>, 203-207 (1999).</li></ol>

<p class="jove_content">The authors have nothing to disclose.</p>

<p> Este protocolo fornece um guia passo a passo para eletroporação do tubo neural de embriões de galinha HH10. Além de mostrar a técnica, as diretrizes para o armazenamento e manuseio de ovos também é fornecido. Esta técnica tem uma ampla gama de aplicações para análise genética e do custo baixo e facilidade de experimentos torna viável para muitos laboratórios. </p>

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Chicken egg incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>humidified, set to 37.80&deg;C (100F).  </td>
</tr>
<tr>
<td>Pulse generator </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetronics </td>
<td>BTX T820 </td>
<td>Square wave generator or comparable</td>
</tr>
<tr>
<td>Electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart</td>
</tr>
<tr>
<td>Connecter cables</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting scope </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>with large working distance</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass capillaries </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>and capillary puller or commercial glass needles</td>
</tr>
<tr>
<td>Leibovitz&#x2019;s L-15 media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>chicken eggs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>fertilized</td>
</tr>
<tr>
<td>Curved scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Large bore needle </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>16-18G</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouth pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>India ink </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin syringe/syringe </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasmid DNA </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&#x2265; 1&#181;g/&#181;l in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
					</div>
		

in ovo electroporations of hh stage 10 chicken embryos

<p class="jove_content">Grande tamanho e desenvolvimento externo do embrião de galinha há muito tempo tornou uma ferramenta valiosa no estudo da biologia do desenvolvimento. Com o advento da técnicas da biologia molecular, a garota tornou-se um sistema útil para se estudar a regulação do gene e função. Por electroporating construções de DNA ou RNA no embrião de galinha em desenvolvimento, os genes podem ser expressos ou derrubado a fim de analisar in vivo a função do gene. Da mesma forma, constrói repórter pode ser usado para o mapeamento de destino ou para analisar elementos gene putativo de regulamentação. Comparação com experiências similares em mouse, eletroporação pintinho tem a vantagem de ser rápido, fácil e barato. Este vídeo demonstra como fazer primeiro uma janela na casca de ovo para manipular o embrião. Em seguida, o embrião é visualizado com uma solução diluída de nanquim injetado abaixo do embrião. Uma agulha de vidro e pipetas são utilizadas para injetar DNA e corante verde rápido dentro do tubo neural em desenvolvimento, em seguida, são colocados eletrodos de platina paralelo ao embrião e curta pulsos elétricos são administrados com um gerador de pulsos. Finalmente, o ovo é selada com fita adesiva e colocados de volta para uma incubadora para o desenvolvimento. Além disso, o vídeo mostra a estocagem e manuseio apropriado e discute as possíveis causas do embrião eletroporação seguintes perda.</p>

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In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

<p class="jove_content">Pinto no ovo eletroporação é uma técnica que permite a manipulação genética do embrião aviária. Aplicações mais comuns desta técnica incluem a análise funcional de genes e elementos enhancer putativa. Este vídeo demonstra eletroporação do tubo neural em HH 10 embriões de galinha. Técnica de injeção e manuseio adequado de ovo são discutidos.</p>

Em Electroporations Ovo de Estágio HH 10 embriões de galinha

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

18.2K visualizações.  University of Chicago. Pinto no ovo eletroporação é uma técnica que permite a manipulação genética do embrião aviária. Aplicações mais comuns desta técnica incluem a análise funcional de genes e elementos enhancer putativa. Este vídeo demonstra eletroporação do tubo neural em HH 10 embriões de galinha. Técnica de injeção e manuseio adequado de ovo são discutidos.