A eletroporação mRNA fornece uma expressão rápida, eficiente e espacialmente e temporalmente controlada de múltiplas proteínas dentro do sistema modelo aviário. Este método permite uma expressão mais ampla e rápida de proteínas fluorescentes do que a rotulagem alcançada pela eletroporação padrão de DNA. A eletroporação facilita a abertura transitória de poros na membrana plasmática que servem como conduítes para a transferência de cargas genéticas como RNA e DNA para as células de numerosos organismos modelo.
Para os experimentos iniciais, trabalham com embriões com mais de um dia de idade, pois são mais resistentes e resistentes a manipulações externas como a eletroporação. No estágio de desenvolvimento embrionário apropriado, quebre suavemente e despeje o conteúdo do ovo de codorna em uma placa de Petri de 10 centímetros. Use uma pipeta de transferência para remover a maioria do albumen grosso.
Use um tecido de laboratório para limpar suavemente a superfície do jugo para remover o albumeno de espessura restante ao redor do embrião para garantir que o embrião grude firmemente no anel de papel. Coloque papel filtro precut sobre o embrião e use uma tesoura para cortar suavemente ao redor do perímetro do embrião. Use uma pipeta Pasteur para camada PPS sob o embrião usando fluxos suaves para desocupar qualquer jugo grudado no tecido.
Puxe lentamente o anel de papel embrião em um ângulo oblíquo para cima e para fora do jugo. Coloque o papel em uma placa de Petri cheia de PBS para limpeza posterior. Uma vez que a maior parte do jugo tenha sido removido, coloque o lado ventral do embrião em uma placa de Petri de 35 milímetros coberta com uma mistura semisóida de ágar e albumen.
Prepare a câmara de eletroporação conectando o eletrodo preto enchendo-o com PBS e colocando o embrião dentro. Use um microcapilar de vidro para injetar um bolus de 200 nanoliters de mRNA na cavidade entre o epiblasto e a membrana vitelline que cobre a região desejada. E então use o eletrodo vermelho para eletroporar o embrião.
Coloque o embrião eletroporado de volta na mistura ágar-albumen e incubar a 38 graus Celsius até o estágio de desenvolvimento desejado. Para a imagem das proteínas fluorescentes codificadas por eletroporação, observe todos os embriões eletroporados sob um estereoscópio de dissecação fluorescente para selecionar o embrião eletroporado mais saudável e melhor para os experimentos de imagem dinâmica. Continue a incubar os outros embriões eletroplados e embriões não eletroplatados em uma incubadora separada.
Enxágue brevemente o embrião selecionado com PBS para remover quaisquer bolhas que possam ter se formado no lado dorsal do embrião durante a eletroporação. Coloque o embrião limpo diretamente em um prato de imagem contendo uma fina camada de cerca de 150 microliters de albumen-ágar tomando cuidado para não gerar bolhas na superfície dorsal do embrião. Adicione um pequeno pedaço úmido de papel de tecido enrolado ao longo das bordas internas do prato de imagem.
Sele o prato com filme de parafina para minimizar a evaporação durante a imagem e incubação. Mova o prato rapidamente para o estágio pré-ensaquerado de um microscópio confocal e use o canal brightfield para localizar o corante colorido no embrião. Defina o software de imagem para o objetivo desejado, espelho dicroico e espectro de emissões, e ligue um laser apropriado.
Tome cuidado para que as células permaneçam na visão de imagem durante toda a filmagem. Use uma resolução de imagem alta o suficiente e certifique-se de que as condições de imagem não causarão fototoxicidade. Clique em Live no software de imagem e ajuste a potência do laser para uma configuração apropriada para a intensidade da fluorescência, dependendo de cada potência laser do microscópio.
Comece a imaginar o embrião usando 1% de potência laser e um ganho de 800, aumentando a potência do laser lentamente em incrementos de 1% até que pixels saturados sejam vistos. Quando pixels saturados são observados diminuem ligeiramente a potência do laser até que nenhum pixel saturado possa ser visualizado. Imagem o embrião a cada três ou cinco minutos para verificar a migração de células individuais em diferentes pontos de tempo usando cinco pilhas de micrômetros de toda a área eletroplada com algum espaço extra em direção ao fundo da pilha Z no caso do embrião afundar na cama de agarose durante a sessão de imagem.
Para observar a velocidade com que as células estão se movendo, verifique os primeiros pontos de tempo do primeiro filme. Se as células estiverem se movendo rapidamente, considere expandir o zoom da área de imagem ou imagem de uma região diferente. Quando toda a região eletroplada do embrião foi imagen, imagem em região não seletiva do mesmo embrião para determinar os níveis de autofluorescência.
Para determinar quanto tempo o mRNA transfectado pode ser traduzido em proteínas fluorescentes depois de confirmar a eletroporação do gene de interesse no microscópio estéreo, coloque o embrião em um estágio pré-aquecido do microscópio confocal invertido e use o laser de 405 nanômetros com uma potência laser de 70%, 100 iterações e uma velocidade de varredura de quatro para fotobleach a maior parte da fluorescência celular do gene eletroplatado em uma variedade de pontos de tempo. Continue a incubar os embriões no palco a 36 graus Celsius após o branqueamento da foto, tomando cuidado para prestar atenção às células ativamente divisórias dentro da região fotobleachada que normalmente são vistas apenas em embriões saudáveis e, assim, indicam que a eletroporação não prejudicou as células embrionárias. Adquira imagens de pilha Z pós-alvejante da região eletroplada por um período de tempo desejado em intervalos de tempo regulares de três a cinco minutos.
Para garantir que as condições de imagem não afetem deletério a sobrevivência do embrião incubar simultaneamente embriões eletroplaqueados que não são fotobleachados para servir como controle para a imagem. Para quantificar os resultados de fotobleachamento para a decadência mRNA pós-eletroporação use ImageJ para medir a intensidade da fluorescência de um círculo de 7,5 micrômetros no centro da área eletroplacada de cada célula para rastrear a fluorescência celular durante cada intervalo de três a cinco minutos. Quando todas as células dentro da região fotobleached que não estão passando por mitose e foram completamente fotobleachadas foram medidas, plote a intensidade da fluorescência ao longo do tempo pós-alvejante em cada um dos pontos de tempo em que o embrião foi fotobleachado.
Embora a eletroporação de DNA leve a uma fluorescência mais brilhante em algumas células eletroplacais, a eficiência da eletroporação de DNA é visivelmente menor em comparação com as proteínas fluorescentes amplamente expressas codificadas pelo mRNA. Ao comparar o DNA e a co-eletroporação mRNA dentro do mesmo embrião, o DNA que expressa eficiência proteica fluorescente também é significativa e consistentemente menos eficiente do que o do mRNA expressando proteína fluorescente. A quantificação de todos os embriões eletroplatados apenas com mRNA, DNA ou uma combinação dos dois, revela que o mRNA transfecta cerca de 75% das células em uma determinada região, enquanto o DNA só transfecta cerca de 25% das células.
O mRNA transfectado deve levar a uma produção de proteína mais rápida em comparação com o DNA transfectado, uma vez que o mRNA pode ser imediatamente reconhecido por máquinas de tradução citosóica. Embora a co-eletroporação de DNAs múltiplos tenha sido anteriormente demonstrada como relativamente ineficiente, a co-eletroporação de quatro mRNAs neste experimento resultou em uma eficiência de transfecção de 87% de todos os quatro mRNAs dentro de todas as regiões eletropladas. Embora o fotobleaching inicialmente reduza a intensidade da fluorescência nas células fotobleachadas em cerca de 95% algumas células permanecem que recuperam sua capacidade de dividir e expressar proteínas fluorescentes logo após a eletroporação.
No entanto, essa habilidade diminui ao longo de cinco horas após a eletroporação. Tome seu tempo otimizando as melhores condições de imagem e continue mexendo mesmo depois de começar o filme estar pronto para fazer quaisquer ajustes, se necessário.
