Esta pesquisa foi suportada por concessões do NIH / NIAAA (AA11852 e AA007471).

<ol>
	<li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survivable+stereotaxic+surgery+in+rodents.">Survivable stereotaxic surgery in rodents.</a> J. Vis. Exp. (20), e880 (2008).</li><li>Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+response+in+the+nucleus+accumbens+core-shell+border+differs+from+that+in+the+core+and+shell+during+operant+ethanol+self-administration.">The dopamine response in the nucleus accumbens core-shell border differs from that in the core and shell during operant ethanol self-administration.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 33, 1355-1365 (2009).</li><li>Doyon, W. M., York, J. L., Diaz, L. M., Samson, H. H., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+activity+in+the+nucleus+accumbens+during+consummatory+phases+of+oral+ethanol+self-administration.">Dopamine activity in the nucleus accumbens during consummatory phases of oral ethanol self-administration.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 27, 1573-1582 (2003).</li><li>Pettit, H. O., Justice, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+dose+on+cocaine+self-administration+behavior+and+dopamine+levels+in+the+nucleus+accumbens.">Effect of dose on cocaine self-administration behavior and dopamine levels in the nucleus accumbens.</a> Brain Res. 539, 94-102 (1991).</li><li>Paxinos, G., Kus, L., Ashwell, K. W. S., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemoarchitectonic Atlas of The Rat Forebrain. , (1998).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1986).</li><li>Skoog, D. A., Holler, F. J., Nieman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Instrumental Analysis. , (1998).</li><li>Doyon, W. M., Anders, S. K., Ramachandra, V. S., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+operant+self-administration+of+10%+ethanol+plus+10%+sucrose+on+dopamine+and+ethanol+concentrations+in+the+nucleus+accumbens.">Effect of operant self-administration of 10% ethanol plus 10% sucrose on dopamine and ethanol concentrations in the nucleus accumbens.</a> J Neurochem. 93, 1469-1481 (2005).</li><li>Carrillo, J., Gonzales, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+exposure+to+voluntary+ethanol+self-administration+produces+adaptations+in+ethanol+consumption+and+accumbal+dopamine+signaling.">A single exposure to voluntary ethanol self-administration produces adaptations in ethanol consumption and accumbal dopamine signaling.</a> Alcohol. 45, 559-5566 (2011).</li><li>Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Duvauchelle, C. L., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shell+of+the+nucleus+accumbens+has+a+higher+dopamine+response+compared+with+the+core+after+non-contingent+intravenous+ethanol+administration.">The shell of the nucleus accumbens has a higher dopamine response compared with the core after non-contingent intravenous ethanol administration.</a> Neuroscience. 154, 1042-1053 (2008).</li><li>Robinson, D. L., Lara, J. A., Brunner, L. J., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Ethanol+Concentrations+in+the+Extracellular+Fluid+of+the+Rat+Brain.">Quantification of Ethanol Concentrations in the Extracellular Fluid of the Rat Brain.</a> J. Neurochem. 75, 1685-1693 (2000).</li><li>Gonzales, R. A., McNabb, J., Yim, H. J., Ripley, T., Bungay, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Microdialysis+of+Ethanol+in+Rat+Striatum.">Quantitative Microdialysis of Ethanol in Rat Striatum.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 22, 858-867 (1998).</li></ol>

Este artigo foi financiada pela Med Associates, Inc.

Aplicações e limitações Auto-administração de drogas é usado em roedores para dependência de drogas modelo. Muitas drogas de abuso que são modelados deste modo podem ser administradas por via intravenosa, em que o fármaco é distribuído directamente para o compartimento central. Isso permite um acompanhamento de perto da dose durante uma sessão de auto-administração. Uma vez que o etanol é geralmente auto-administrado oralmente, é muito mais difícil de controlar os níveis da droga devido a diferenças individuais na absorção e metabolismo. Utilizando microdiálise para amostra da região do cérebro de interesse, não só são capazes de monitorar o padrão de etanol atingindo a região, mas também são capazes de monitorar simultaneamente alterações de neurotransmissores na mesma região ao longo do tempo durante cada fase de auto-administração. Alterações neuroquímicas e respostas induzidas pela droga no cérebro está associada com abuso e dependência de drogas, assim, a capacidade para medir simultaneamenteneuroquímica certeza e concentrações de drogas durante específicas de auto-administração fases fornece uma ferramenta muito poderosa e única. Uma questão a ter em mente para correlacionar as concentrações de dialisato de analitos com comportamento são as características físicas do encanamento microdiálise. Especificamente, o tempo necessário para o fluido a ser transferido a partir do lúmen da sonda de microdiálise para o tubo de recolha é crítica, e tempos mais curtos são melhores. Em nosso laboratório, nós construir as sondas de modo que o tempo é de cerca de 90 segundos. Usando estas condições, verificou-se que há um aumento da dopamina accumbal no início do consumo de etanol, que diminui ao longo dos períodos de bebida e de pós-bebe com o aumento da concentração de etanol de dialisato. 2,3,8,9 Estas experiências , quando combinado com os dados de estudos farmacológicos, permitiram-nos para analisar os efeitos farmacológicos estritamente de etanol e de auto-administração associados sinais ambientais em changes em concentrações de neurotransmissores. Deve notar-se que esta aplicação particular de combinados comportamental microdiálise técnicas é adequada para os interesses de pesquisa do nosso laboratório. Ele foi concebido para avaliar o padrão temporal de etanol atingir o cérebro, em comparação com o padrão de alterações de neurotransmissores, na mesma região, de modo que podemos relacionar estas medidas síncronos de auto-administração comportamentos. As concentrações de etanol derivados de dialisado não foram corrigidos para a recuperação in vivo da sonda, e são apenas uma fracção da concentração de tecido cerebral de etanol. Se microdiálise quantitativa de etanol é necessário, a fracção de extracção de etanol, que se difunde a partir do espaço extracelular para dentro da sonda deve ser determinado experimentalmente. Veja publicações anteriores de nosso laboratório de métodos e uma discussão mais aprofundada. 10,11,12 Embora este protocolo ilustra o uso de gás de chromatography juntamente com microextração em fase sólida de etanol a partir do espaço livre de amostras de microdiálise, outros métodos para a análise do teor de etanol na amostra de microdiálise poderia ser utilizado. Contudo, métodos alternativos podem sofrer de algumas desvantagens. Por exemplo, menos sensíveis métodos analíticos podem exigir um maior volume de amostra que requer tempos de amostragem superior a 5-7 minutos ilustrado aqui. O tipo de sistema discutido aqui utiliza uma microextração em fase sólida que se concentra o etanol na fase de vapor no tubo de amostragem selado, permitindo a absorção para a fibra colocada no espaço superior do frasco. Isto melhora o limite de detecção em comparação com a amostragem headspace directa, que normalmente permite 50-100 microlitros do vapor a ser injectado. Outra grande vantagem do método é que o espaço superior da amostra injectada para análise é extremamente limpa e livre de sais. A injecção directa da amostra de microdiálise líquido também pode ser utilizado com maior SensITivity, mas isso vai exigir mais instrumento o tempo devido à manutenção regular necessária para limpar os sais injetados. Resolução de problemas e outras notas <ol><li> Antes de sua experiência começa, dar-se muito tempo para verificar que seus microdiálise set-ups estão funcionando corretamente e na solução de problemas quaisquer problemas. Sugerimos que você tem um extra set-up, perfundidos com ACSF, pronto para mudar-se com uma avaria set-up para poupar tempo, como a maioria das sessões operantes tendem a ocorrer em um momento específico a cada dia. </li><li> Certifique-se de que as sondas de microdiálise são inseridos ao longo de um período de cerca de 5 min para minimizar o dano de tecido produzido por corte do tecido, como a sonda penetra no cérebro. </li><li> Ao transferir o rato para a câmara operante é útil ter uma segunda pessoa auxiliar de modo a que a linha de transferência (parte da microdiálise set-up) não se tornando emaranhada, e de modo a que o programa possa ser operante o initiated a tempo. </li><li> Certifique-se de que dá ao autosampler abundância banho de água de tempo para atingir a temperatura adequada. Nosso sistema geralmente requer duas horas para chegar a 50 ° C. Além disso, garantir que as amostras são completamente vaporizado antes de analisar as amostras. Nós normalmente confirmar visualmente que isso tenha ocorrido antes de iniciar a análise da amostra. </li><li> Padrão de boas práticas de química analítica deve ser seguido. Estes incluem, mas não estão limitados a, a validação dos indivíduos, o equipamento e procedimentos. Em breve, nós empregamos as seguintes diretrizes: usuários individuais devem demonstrar a capacidade de gerar reproduzíveis valores de altura de pico para as concentrações padrão e lineares curvas padrão (R2 ≥ 0,99) de vários dias. Para verificar o sistema GC-FID está funcionando corretamente, as normas devem ser sempre ser analisados ​​antes de qualquer amostra de dialisato são injetados. A curva padrão gerada deve ter um R2 ≥ 0,99. </li><li> A maior parte do equipamento que usafoi adquirido através de Varian, Inc., que foi adquirida pela Agilent Technologies em 2010. Neste momento, Instrumentos Bruker científicos obtidos laboratório Varian cromatografia gasosa negócio instrumentos. Para futuras compras, consultar ou empresa. </li><li> O presente protocolo mostra o comportamento operante com ratos, mas o espectador deve estar ciente de que mais perturbações de comportamento é provável de ocorrer com o modelo mais pequeno rato. Outra questão a ter em conta é que a colocação de uma sonda de microdiálise em outras regiões do cérebro do que o córtex pré-frontal medial ou núcleo accumbens pode perturbar o comportamento operante em um grau maior do que o mostrado aqui. É importante examinar de perto inúmeros parâmetros comportamentais para determinar se os danos causados ​​pela colocação da sonda produz alterações graves de comportamento. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Etanol 95% </td><td> AAPER Álcool e Chemical Co., Shelbyville, KY </td><td> E190, 111000190 </td></tr><tr><td> Ultra-Pura Sacarose </td><td> MP Biomedicals, LLC, Solon, OH </td><td> 821721 </td></tr><tr><td> Ultra Alta Pureza Hélio </td><td> Ar Gás </td><td> HE UHP300 </td></tr><tr><td> Ar </td><td> Ar Gás </td><td> AIZ300 </td></tr><tr><td> Hidrogênio </td><td> Ar Gás </td><td> AIZ300 </td></tr><tr><td> GC 2 ml frascos </td><td> Agilent </td><td> # 8010-0015 </td></tr><tr><td> Tampas dos frascos GC com PTFE / silicone septos </td><td> Agilent </td><td> # 8010-0084 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Reagentes específicos

microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography

Operantes de auto-administração de métodos são usados ​​para estudar os efeitos comportamentais e farmacológicos de muitas drogas de abuso, incluindo etanol. No entanto, o etanol é tipicamente auto-administrados por via oral, por via intravenosa, em vez de como muitas outras drogas de abuso. A farmacocinética dos fármacos administrados por via oral são mais complexas do que as drogas por via intravenosa. Devido a compreensão da relação entre os efeitos farmacológicos e comportamentais de etanol requer um conhecimento da evolução no tempo de etanol chegar ao cérebro, durante e depois de beber, usamos microdiálise in vivo e cromatografia gasosa com detector de ionização de chama para monitorar as concentrações de etanol no cérebro de dialisado ao longo do tempo. Combinados microdiálise-comportamentais experiências envolvem a utilização de várias técnicas. Neste artigo, a cirurgia estereotáxica, a formação e comportamento de microdiálise, que pode ser adaptado para testar uma multiplicidade de auto-administração e neurochemical centrada hipóteses, estão incluídos apenas para ilustrar como eles se relacionam com as fases subseqüentes de coleta e análise de amostras de etanol dialisado. Dialisado análise da concentração de etanol através de cromatografia em fase gasosa com detecção de ionização de chama, o qual é específico para os estudos de etanol, é descrita em detalhe. Os dados produzidos por estes métodos revelam o padrão de etanol chegar ao cérebro, durante o processo de auto-administração e, quando combinadas com a análise das amostras neuroquímica dialisato mesmas, permite tirar conclusões acerca dos efeitos farmacológicos e comportamentais de etanol.

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Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography

Um método para determinar o curso de tempo da concentração de etanol no cérebro de ratos durante etanol operante a auto-administração é descrita. Cromatografia em fase gasosa com detecção por ionização de chama é utilizado para quantificar o etanol nas amostras de dialisato, porque não tem a sensibilidade necessária para os pequenos volumes que são gerados.

Microdiálise de etanol durante a operante determinação auto-administração de etanol e etanol por cromatografia gasosa

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol.  ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.4K visualizações.  The University of Texas at Austin. Um método para determinar o curso de tempo da concentração de etanol no cérebro de ratos durante etanol operante a auto-administração é descrita. Cromatografia em fase gasosa com detecção por ionização de chama é utilizado para quantificar o etanol nas amostras de dialisato, porque não tem a sensibilidade necessária para os pequenos volumes que são gerados.