Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (AI050677, HD-051998, e GM103433), um Malcolm Feist cardiovascular pesquisa comunhão, e um da American Heart Association comunhão predoctoral (10PRE4200007).

1. Preparação de gelatina revestidos Lamelas <ol><li> Colocar o ácido-lavadas lamelas de vidro (15 mm de diâmetro) numa placa de plástico estéril milímetro 100 (ES). Coloque 8-9 lamínulas por placa e verifique se eles não estão tocando um ao outro ou os lados do prato .. </li></ol> Nota: As lamelas, agulhas e pinças devem ser estéreis para eliminar possíveis microorganismos contaminantes, assim como endotoxinas, que irão afectar as funções celulares, incluindo a motilidade. <ol start="2"><li> Pesa-se o pó de gelatina e ressuspender o pó em água desionizada para produzir uma solução de gelatina com uma concentração final de 0,5 g/300 ml. Em seguida, a solução de gelatina deve ser autoclavado. </li><li> Pipetar 2-3 gotas de gelatina (~ 100-150 ml) em cada lamela. </li></ol> Nota: Tenha cuidado para não permitir que a gelatina para tocar o prato ou você não será capaz de remover as lamelas do prato. <ol start="4"&gt; <li> Coza as lamelas revestidas com gelatina no prato de 100 mm em um forno a 90 ° C durante 10 min. </li><li> Retire o excesso de gelatina por pipetagem suave. </li><li> Secam-se as lamelas no prato de 100 mm, na estufa a 70 ° C durante 45 min. </li><li> Depois de seco, retire as lamelas do prato de 100 mm usando um estéril, agulha endotoxina livre e pinças (a agulha é usada para gentilmente cutucar a lamela para torná-lo acessível para a pinça para remover suavemente). </li><li> Coloque individuais de gelatina revestidos lamelas em poços separados de uma placa de 24 poços. </li></ol> 2. Preparação de ouro coloidal revestido Lamelas <ol><li> Pesar uma quantidade apropriada de ácido cloroáurico (tri-hidrato de ácido tetracloroáurico; HAuCl 4 · 3H 2 O), e em seguida ressuspender em água desionizada estéril para preparar uma solução final de 14,5 mM (tóxico). Preparar 1,5 ml da solução por 8-9 lamelas. </li></ol> Aviso: ácido cloroáurico é hbraçada se ingerido, causa queimaduras na pele e lesões oculares graves e pode provocar uma reação alérgica na pele. Tóxico se ingerido. <ol start="2"><li> Pesar uma quantidade adequada de citrato de sódio (trissódico di-2-hidroxipropano-1 ,2,3-tricarboxilato; Na 3 C 6 H 5 O 7) e, em seguida, voltar a suspender o pó em água desionizada para se obter uma solução final de 0,5%. Prepare 1 ml da solução por 8-9 lamelas. </li></ol> Aviso: O citrato de sódio pode causar irritação dos olhos e da pele. Ele também pode causar irritação do trato respiratório e digestivo. <ol start="3"><li> Em uma solução estéril, livre de endotoxinas proveta 1,5 ml de combinar a 14,5 mM estéril HAuCl solução 4 e 13,5 mL de água desionizada estéril; o resultado deve originar uma solução amarelo pálido. Os volumes acima referidos irá permitir por 8-9 lamelas de ouro coloidal a serem feitas. </li><li> Enquanto agitando continuamente, aquecer a solução sobre uma placa quente até que comece a bóleo. </li></ol> Aviso: O aquecimento da solução deve ser realizada no exaustor de fumos, como os vapores podem ser nocivos / tóxicos. Os vapores são destrutivas para o tecido das membranas mucosas e do trato respiratório superior. <ol start="5"><li> Retirar o copo da placa de aquecimento. </li><li> Enquanto se agita, adicionar 0,7 ml da solução a 0,5% de citrato de sódio. O volume acima mencionado irá permitir por 8-9 lamelas de ouro coloidal a serem feitas. </li><li> Continue mexendo esta solução combinada de cerca de 2 min (Nota: A cor da solução irá gradualmente mudar de amarelo fraco, para limpar, a cinza, a púrpura, a púrpura de profundidade, antes de finalmente chegar a um vinho tinto ou, de preferência, ferrugem cor) . Este produto é a sua solução de ouro coloidal. </li><li> Arrefece-se a solução de ouro coloidal numa pipeta de 10 ml para 1-2 min (de modo a manter a camada de gelatina sobre a lamela de fusão, quando a solução de ouro coloidal é adicionada) e em seguida, adicionar 1,0-2,0 ml do colloidal solução de ouro em cada lamela de gelatina revestida previamente colocada em um prato de 24 cavidades (s) (a quantidade da solução de ouro coloidal, que adiciona as lamelas revestidas com gelatina depende de quão bem as partículas de ouro precipitou na solução - ver comentários abaixo). </li></ol> Observação: Uma vez que pode haver variações na eficácia da precipitação de partículas de ouro, é aconselhável primeiro adicionar 0,5-1 ml da solução de ouro coloidal para as lamelas revestidas com gelatina e, em seguida, colocar o prato de 24 cavidades na incubadora durante 0,5 hr . Após este período de incubação, as lamelas devem ser verificadas sob o microscópio de luz para a densidade apropriada de partículas de ouro sobre as lamelas. Ver Figura 1 para a 20x de imagens de microscopia exemplos de muito baixa e uma concentração demasiado elevada de partículas de ouro. Ver Figura 2 para imagens de microscopia de 40x a concentração ideal de partículas de ouro (pelo menos para o uso com os monócitos). O optdensidade Imal das nanopartículas de ouro sobre a lâmina deve ser determinado experimentalmente para cada tipo de células utilizado, tal como as características das diferentes células vai ditar a sua força de movimento sobre as lamelas. Se a concentração de partículas de ouro é insuficiente, adicionar um ml 0,5-1 adicionais da solução de ouro coloidal para as lamelas revestidas com gelatina. Dependendo do tamanho da célula, a concentração apropriada de partículas de ouro pode variar e, portanto, em última análise depende do tamanho da célula examinadas para a motilidade. Por exemplo, com monócitos humanos que são de tamanho pequeno de células (~ 10-20 uM 28), uma maior concentração de partículas de ouro foi requerido na nossa análise. A distribuição apropriada de nanopartículas de ouro fornece o pesquisador, com a capacidade para facilmente e eficientemente distinguir as bordas de faixas celulares. A concentração de partículas de ouro que é demasiado elevado dificulta a capacidade das células para se mover e, por conseguinte, para medir com precisãosua motilidade, enquanto que uma concentração de partículas de ouro que é demasiado baixo para os limites de capacidade delinear uma faixa precisa de motilidade. Nota importante: se a síntese de nanopartículas de ouro é problemática, nanopartículas de ouro sintetizados estão comercialmente disponíveis em tamanhos de 5 nm a 400 nm. Além disso, a microesferas fluorescentes também têm sido utilizadas em estudos da motilidade celular 29. No entanto, o uso destas microesferas exige um microscópio fluorescente para a análise de migração celular. <ol start="9"><li> Coloque o prato de 24 cavidades com o ouro coloidal-cobertas lamelas em uma incubadora a 37 ° C e incuba-se a partir de 1 hora até durante a noite. </li><li> Após a incubação, lavar / remover o ouro não ligado por imersão das lamelas (3x) em solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS, pH 7,4). </li><li> Colocar estes coloidais de ouro revestidas com lamelas numa placa de 12 poços limpos (es) contendo PBS. </li><li> Armazenar estas lamelas a 4 ° C até estar pronto parausar (parafilme a placa antes de colocar no frigorífico). </li></ol> Nota Importante: Sempre manter as coloidais revestidas de ouro lamínulas em algum tipo de líquido / mídia como as partículas de ouro pode descamar as lamelas de se secar. As lamelas de ouro coloidal deve ser usado dentro de 2-3 meses a partir da data em que foram feitas. Controlo de Qualidade: Em um ensaio de motilidade phagokinetic única faixa, é crítica a utilização lamelas que são caracterizadas por uma concentração semelhante de partículas de ouro. Este ponto simples permitirá que as diferenças quantitativas na motilidade celular entre as amostras a ser unicamente devido a natureza do tratamento e não as propriedades físicas dos coloidais de ouro revestidas com lamelas. Nós favorecer a utilização de lamelas apenas feitos ao mesmo tempo em experiências individuais, embora tenhamos mostrado que, enquanto a densidade das nanopartículas de ouro são iguais, a utilização de lamelasa partir de diferentes preparações é apropriado. 3. Análise de Motilidade Celular <ol><li> Colocar os coloidais de ouro revestidas com lamelas em meio apropriados celulares para as células de interesse. </li><li> Transferir as células tratadas apropriadamente para as coloidais de ouro revestidas com lamelas colocadas numa placa de 24 poços (es) </li></ol> Nota: O número de células transferidas para o único poço tem de ser determinado para cada tipo de célula estudada. Idealmente, as células têm de ser distribuídos igualmente sobre a lamela de ouro coloidal revestido, que por sua vez vai permitir a análise estatística de faixas apenas criados por uma única célula. Se as células são plaqueadas a uma concentração demasiado elevada, torna-se altamente provável que as faixas sobrepostas de várias células pode ser vista. Faixas sobrepostas não podem ser quantificados com precisão e, por conseguinte, não podem ser tidos em conta nas análises finais do movimento das células testadas. Sobreposição faixas como resultado deo envolvimento de células múltiplas são geralmente facilmente observado, como fundidos ou cruzado faixas (no campo da análise), na qual duas ou mais células podem ser observados na área contígua mesma apagada. <ol start="3"><li> Incubar a 37 ° CO C / 5% 2, durante 24 horas (ou durante qualquer momento adequado, por exemplo, nós analisamos a motilidade dos monócitos entre 6 hr e 24 hr células pós-tratamento e endoteliais a 12 hr pós-tratamento). O período de tempo óptimo para determinar e medir a motilidade celular irá variar com o tipo de célula estudada e, assim, deve ser determinado experimentalmente para cada tipo de célula (um bom ponto de partida, no entanto, é 6-12 tratamento pós-hr). </li></ol> Nota: Se experimentais coloidais de ouro revestidas com lamelas têm de ser armazenados e / ou analisados ​​em um momento posterior, as células e nanopartículas de ouro devem ser fixados sobre as lamelas. Para realizar esta etapa de fixação; Passo seguinte 3.3, a primeira lavagem lamínulas cuidadosamente duas vezes com 1xPBS (imersão de lamelas é preferível, como uma remoção de nanopartículas de ouro a partir de lamelas devem ser evitados), em seguida, utilizar um método de fixação padrão de células, tal como a incubação com paraformaldeído à temperatura ambiente de 3%. Após uma incubação de 15 min, a 3% de paraformaldeído deve ser retirado e lavado cuidadosamente as lamelas 3 vezes com PBS 1x. As lamelas fixas podem ser armazenados num frigorífico. <ol start="4"><li> Usando um microscópio de luz, capturar imagens das faixas criados por uma única célula em movimento (Nota: A ampliação usado para tirar fotografias de pistas celulares irão certamente variar dependendo do tipo de célula em estudo). Exemplos de pistas celulares criadas por células não-móveis e móveis sobre coloidais de ouro revestidas com lamelas são mostrados na Figura 2. </li></ol> Nota: As nanopartículas de ouro do tamanho usado no ensaio phagokinetic faixa motilidade foi encontrado para ser totalmente não tóxico para as células 30. Se necessário, A viabilidade das células analisadas pode ser avaliada por coloração com azul de tripano ou examinados para outros marcadores de viabilidade celular. Um teria que ter em conta a necessidade de um tipo de fixação, de fixação, etc, se este passo tem de ser realizada. <ol start="5"><li> Usando o software livremente disponível, tal como o software ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) ou NIH Image ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/nih-image/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/</a> ), desenvolvidos no National Institutes of Health, ou ImageTool ( <a href="http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html" target="_blank">http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html</a> ) desenvolvido na Universidade do Texas Health Science Center em San Antonio, a área média (em unidades arbitrárias) de ouro coloidal apuradas pela 10-20 ou mais células (por exemplo) é determinado para cada braço experimental a partir das imagens captadas. As estatísticas podem então ser realizadas em tele colecionou resultados. Por exemplo, os resultados podem ser representados como média ± o erro padrão das médias (SEM) com teste t de Student realizados, e um valor de P de &lt;0,05 utilizadas como a medida de significância estatística entre as amostras. Figuras 3 e 4 passos mostram na análise da área de ouro coloidal apuradas pela célula. </li></ol>

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	<li>Armstrong, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+cell+motility+during+embryogenesis.">The control of cell motility during embryogenesis.</a> Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop+and+go+traffic+to+tune+T+cell+responses.">Stop and go traffic to tune T cell responses.</a> Immunity. 21, 305-314 (2004).</li><li>Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tissue+repair:+from+wound+healing+to+fibrosis.">Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 5-17 (1997).</li><li>Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+proteins+in+migration+and+invasion.">Polarity proteins in migration and invasion.</a> Oncogene. 27, 6970-6980 (2008).</li><li>Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion:+integrating+cytoskeletal+dynamics+and+cellular+tension.">Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).</li><li>Mitchison, T. J., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+cell+motility+and+cell+locomotion.">Actin-based cell motility and cell locomotion.</a> Cell. 84, 371-379 (1996).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments.">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112, 453-465 (2003).</li><li>Bretscher, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+membrane+flow+and+the+cytoskeleton+to+cooperate+in+moving+cells.">Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells.</a> Cell. 87, 601-606 (1996).</li><li>Albrecht-Buehler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagokinetic+tracks+of+3T3+cells.">The phagokinetic tracks of 3T3 cells.</a> Cell. 11, 395-404 (1977).</li><li>Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cytomegalovirus+induces+monocyte+differentiation+and+migration+as+a+strategy+for+dissemination+and+persistence.">Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence.</a> J. Virol. 78, 4444-4453 (2004).</li><li>Palmisano, R., Itoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Metalloproteinase+Protocols.">Matrix Metalloproteinase Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 622, 379-392 (2010).</li><li>Ohta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOXD3-Overexpression+Increases+Integrin+Alpha+V+Beta+3+Expression+and+Deprives+E-Cadherin+while+It+Enhances+Cell+Motility+in+A549+Cells.">HOXD3-Overexpression Increases Integrin Alpha V Beta 3 Expression and Deprives E-Cadherin while It Enhances Cell Motility in A549 Cells.</a> Clinical and Experimental Metastasis. 7-8, 381-390 (2006).</li><li>Kawa, S., Kimura, S., Hakomori, S., Igarashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+chemotactic+motility+and+trans-endothelial+migration+of+human+neutrophils+by+sphingosine+1-phosphate.">Inhibition of chemotactic motility and trans-endothelial migration of human neutrophils by sphingosine 1-phosphate.</a> FEBS Lett. 420, 196-200 (1997).</li><li>Kawamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+and+WAVE2+acting+downstream+of+phosphatidylinositol+3-kinase+are+required+for+myogenic+cell+migration+induced+by+hepatocyte+growth+factor.">N-WASP and WAVE2 acting downstream of phosphatidylinositol 3-kinase are required for myogenic cell migration induced by hepatocyte growth factor.</a> J. Biol. Chem. 279, 54862-54871 (2004).</li><li>Ando, Y., Jensen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+and+insulin-like+growth+factor+I+enhance+keratinocyte+migration.">Epidermal growth factor and insulin-like growth factor I enhance keratinocyte migration.</a> J. Invest. Dermatol. 100, 633-639 (1993).</li><li>Todt, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+tumor+necrosis+factor-alpha+on+human+trophoblast+cell+adhesion+and+motility.">Effects of tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility.</a> Am. J. Reprod. Immunol. 36, 65-71 (1996).</li><li>McAuslan, B. R., Reilly, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+phagokinesis+in+response+to+specific+metal+ions.">Endothelial cell phagokinesis in response to specific metal ions.</a> Exp. Cell. Res. 130, 147-157 (1980).</li><li>Smith, M. S., Bentz, G. L., Smith, P. M., Bivins, E. R., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCMV+activates+PI(3)K+in+monocytes+and+promotes+monocyte+motility+and+transendothelial+migration+in+a+PI(3)K-dependent+manner.">HCMV activates PI(3)K in monocytes and promotes monocyte motility and transendothelial migration in a PI(3)K-dependent manner.</a> J. Leukoc. Biol. 76 (3), 65-76 (2004).</li><li>Smith, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+phosphatidylinositol+3-kinase+and+NF-kappaB+in+human+cytomegalovirus-mediated+monocyte+diapedesis+and+adhesion:+strategy+for+viral+persistence.">Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB in human cytomegalovirus-mediated monocyte diapedesis and adhesion: strategy for viral persistence.</a> J. Virol. 81, 7683-7694 (2007).</li><li>Bentz, G. L., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CMV+infection+of+endothelial+cells+induces+an+angiogenic+response+through+viral+binding+to+EGF+receptor+and+beta1+and+beta3+integrins.">Human CMV infection of endothelial cells induces an angiogenic response through viral binding to EGF receptor and beta1 and beta3 integrins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5531-5536 (2008).</li><li>Chan, G., Nogalski, M. T., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+EGFR+on+monocytes+is+required+for+human+cytomegalovirus+entry+and+mediates+cellular+motility.">Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22369-22374 (2009).</li><li>Nogalski, M. T., Chan, G., Stevenson, E. V., Gray, S., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCMV-Regulated+Paxillin+in+Monocytes+Links+Cellular+Pathogenic+Motility+to+the+Process+of+Viral+Entry.">HCMV-Regulated Paxillin in Monocytes Links Cellular Pathogenic Motility to the Process of Viral Entry.</a> J. Virol. 85, 1360-1369 (2011).</li><li>Turkevich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+nucleation+and+growth+processes+in+the+synthesis+of+colloidal+gold.">A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold.</a> Discuss. Faraday. Soc. 11, 55-75 (1951).</li><li>Frens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+and+sol+stability+in+mental+colloids.">Particle size and sol stability in mental colloids.</a> Colloid &#38; Polymer Science. 250, 736-741 (1972).</li><li>Frens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+nucleation+for+the+regulation+of+the+particle+size+in+monodisperse+gold+suspensions.">Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions.</a> Phys. Sci. 241, 20-22 (1973).</li><li>Zetter, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+capillary+endothelial+cell+migration.">Assay of capillary endothelial cell migration.</a> Methods Enzymol. 147, 135-144 (1987).</li><li>Scott, W. N., McCool, K., Nelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+the+production+of+gold+colloid+monolayers+for+use+in+the+phagokinetic+track+assay+for+cell+motility.">Improved method for the production of gold colloid monolayers for use in the phagokinetic track assay for cell motility.</a> Anal. Biochem. 287, 343-344 (2000).</li><li>Wang, S. Y., Mak, K. L., Chen, L. Y., Chou, M. P., Ho, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+blood+monocyte:+two+subpopulations+with+different+sizes,+phenotypes+and+functions.">Heterogeneity of human blood monocyte: two subpopulations with different sizes, phenotypes and functions.</a> Immunology. 77, 298-303 (1992).</li><li>Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+behavior+screen:+identification,+sorting,+and+enrichment+of+cells+based+on+motility.">A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility.</a> BMC Cell Biol. 6, 14 (2005).</li><li>Pan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+cytotoxicity+of+gold+nanoparticles.">Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles.</a> Small. 3, 1941-1949 (2007).</li><li>Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound-healing+assay.">Wound-healing assay.</a> Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Brooks, D. M., Brooks, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Invasion+Assay+Using+Matrigel(R).">In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R).</a> Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).</li><li>Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+DAPK+inhibits+cell+motility+by+blocking+the+integrin-mediated+polarity+pathway.">The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway.</a> J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).</li><li>Benazeraf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+random+cell+motility+gradient+downstream+of+FGF+controls+elongation+of+an+amniote+embryo.">A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo.</a> Nature. 466, 248-252 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O ensaio de motilidade phagokinetic faixa apresentada neste artigo é um método simples e altamente eficaz para a análise quantitativa da migração celular. Porque vários tipos de células pode ser analisada 9-17, este método tem o potencial de uso amplo em várias disciplinas. A utilização de lamelas de ouro coloidal revestido de vidro permite a medição de uma área de faixa, compensado por uma célula em movimento. O ensaio pode medir o efeito de diferentes estímulos (por exemplo, factore...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Lamelas de vidro (15 mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-545-83 </td><td></td></tr><tr><td> Gelatina Bloom 300 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-1890 </td><td></td></tr><tr><td> Trihydrate Ácido tetracloroáurico </td><td> Fisher Chemical </td><td> G54-1 </td><td> 14,5 mM (uma solução de trabalho final) </td></tr><tr><td> Citrato de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP327-500 </td><td> 0,5% (solução de trabalho final) </td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Fisher Scientific </td><td> O4042 </td><td> 3% (de uma solução de trabalho final) </td></tr><tr><td> 100 placas de cultura de tecidos milímetros </td><td> Sarstedt </td><td> 83,1802 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de 12 poços </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-29 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de 24 poços </td><td> Fisher Scientific </td><td> 07-200-84 </td><td></td></tr><tr><td> Forno Techne Hybridiser HB-1D </td><td> LabPlanet </td><td> 2040500 </td><td> O forno de laboratório padrão será suficiente </td></tr><tr><td> 10 ml Pipetas sorológicas </td><td> Sarstedt </td><td> 86.1254.001 </td><td></td></tr><tr><td> Pipeta-Aid Filler / Dispenser </td><td> Drummond </td><td> 13-681-15 </td><td></td></tr><tr><td> P200 Single-Channel manual pipeta </td><td> Rainin </td><td> PR-200 </td><td></td></tr><tr><td> 200 ml de barreira Dicas </td><td> CLP </td><td> BT200 </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ software </td><td> <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">htt</a>p :/ / rsb.info.nih.gov / ij / </td><td></td><td> Licença: Domínio Público </td></tr><tr><td> Nikon Eclipse TE300 com um CoolSNAPfx Fotometria monocromático 12-bit câmera CCD </td><td> Nikon </td><td></td><td> Descontinuado; A especificação mais comparável tem Nikon Eclipse Ti, mas uma extremidade inferior Nikon 80i será apropriado também. Outras marcas também fornecer microscópios comparáveis. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Nota: Os reagentes e equipamentos listados abaixo foram utilizados por nós em nossos vários estudos. Outras fontes, de fornecedores, reagentes e equipamentos que podem ser usados, contanto que elas têm especificações semelhantes. </td></tr></tbody></table>

a quantitative evaluation of cell migration by the phagokinetic track motility assay

Motilidade celular é um processo biológico importante para ambos os organismos unicelulares e multicelulares. É essencial para o movimento de organismos unicelulares para uma fonte de nutrientes ou de distância a partir de condições inadequadas, bem como em organismos multicelulares para o desenvolvimento do tecido, a vigilância imunitária e cicatrização de feridas, apenas para mencionar alguns papéis 1,2,3. Desregulação deste processo pode conduzir a graves doenças neurológicas, cardiovasculares e imunológicas, assim como a formação de tumores e exacerbada espalhar 4,5. Molecularmente, actina de polimerização e reciclagem do receptor têm sido mostrados para desempenhar um papel importante na criação de extensões celulares (lamellipodia), que orientam o movimento para a frente da célula 6,7,8. No entanto, muitas questões biológicas sobre a migração de células permanecem sem resposta. O papel central para a motilidade celular na saúde humana e doenças sublinha a importância de compreender o mec específicahanisms envolvidos neste processo e torna os métodos precisos para avaliar a motilidade celular particularmente importante. Microscópios são geralmente usados ​​para visualizar o movimento das células. No entanto, as células se movem muito lentamente, fazendo a medição quantitativa da migração de células de um processo que consome recursos exigindo câmeras caras e software para criar quantitativos tempo decorrido filmes de células móveis. Portanto, a capacidade para realizar uma medição quantitativa da migração de células que é de custo eficaz, não-trabalhoso, e que utiliza equipamento de laboratório comum é uma grande necessidade de muitos investigadores. O ensaio de motilidade phagokinetic faixa utiliza a capacidade de uma célula que se deslocam para limpar as partículas de ouro a partir do seu caminho para a criação de uma faixa mensurável sobre uma lamela de vidro revestido a ouro coloidal 9,10. Com o uso de software disponível livremente, várias faixas podem ser avaliados para cada tratamento para realizar requisitos estatísticos. O ensaio pode ser utilizado para avaliarmotilidade de muitos tipos de células, tais como células cancerosas, 11,12, fibroblastos, neutrófilos 9 13, células do músculo esquelético, queratinócitos 14 15, 16 trofoblastos, células endoteliais e monócitos, 17 10,18-22. O protocolo envolve a criação de lâminas revestidas com nanopartículas de ouro (Au °) que são gerados por uma redução de ácido cloroáurico (Au 3 +) por citrato de sódio. Este método foi desenvolvido por Turkevich et al. Em 1951 23 e, em seguida, melhorado na década de 1970 por Frens et al. 24,25. Como um resultado deste passo de redução química, as partículas de ouro (10-20 nm de diâmetro) precipitar a partir da mistura de reacção e pode ser aplicado a lamelas de vidro, os quais são, então, pronto para utilização em análises de migração celular 9,26,27. Em geral, o ensaio de motilidade phagokinetic pista é uma medida rápida, fácil e quantitativo da motilidade celular. Além disso, elepode ser utilizado como um ensaio de elevado débito simples, para ser utilizado com os tipos de células que não são passíveis de tempo caduco de imagem, assim como outras utilizações, dependendo das necessidades do investigador. Em conjunto, a capacidade de medir quantitativamente a motilidade celular de vários tipos de células, sem a necessidade de caros microscópios e software, bem como o uso de equipamento de laboratório comuns e produtos químicos, fazer o ensaio de motilidade phagokinetic faixa uma escolha sólida para cientistas com interesse na compreensão celular motilidade.

É mostrado um exemplo de imagens tomadas com um microscópio de luz, mostrando a área eliminada por via de uma única célula (a partir de monócitos nossas experiências é mostrado na Figura 2). As células não-móveis criar característica oval, pequeno ou em forma de círculo em torno de si tractos indicando um baixo nível basal de movimento para estas células não estimuladas (figuras 2A e 2B). Em contraste, as células altamente motile [no nosso sistema, o citomegalovírus hu...

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A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

O ensaio de pista phagokinetic motilidade é um método utilizado para avaliar o movimento das células. Especificamente, o ensaio mede quimiocinese (motilidade celular aleatória) ao longo do tempo de uma forma quantitativa. O ensaio tira vantagem da capacidade das células para criar uma faixa mensurável do seu movimento em coloidais de ouro revestidas com lamelas.

Uma avaliação quantitativa da migração celular pelo ensaio Phagokinetic faixa Motilidade

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.8K visualizações.  Louisiana State University Health Sciences Center. O ensaio de pista phagokinetic motilidade é um método utilizado para avaliar o movimento das células. Especificamente, o ensaio mede quimiocinese (motilidade celular aleatória) ao longo do tempo de uma forma quantitativa. O ensaio tira vantagem da capacidade das células para criar uma faixa mensurável do seu movimento em coloidais de ouro revestidas com lamelas.

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Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true quantitative analysis of cellular inflammation. Flow cytometry is a quick alternative method to quantify immune cells in the injured brain or spinal cord tissue. Historically, flow cytometry has been used to quantify immune cells collected from blood or dissociated spleen or thymus, and only a few studies have attempted to quantify immune cells in the injured spinal cord by flow cytometry using fresh dissociated cord tissue. However, the dissociated spinal cord tissue is concentrated with myelin debris that can be mistaken for cells and reduce cell count reliability obtained by the flow cytometer. We have advanced a cell preparation method using the OptiPrep gradient system to effectively separate lipid/myelin debris from cells, providing sensitive and reliable quantifications of cellular inflammation in the injured spinal cord by flow cytometry. As described in our recent study (Beck &amp; Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47), the OptiPrep cell preparation had increased sensitivity to detect cellular inflammation in the injured spinal cord, with counts of specific cell types correlating with injury severity. Critically, novel usage of this method provided the first characterization of acute and chronic cellular inflammation after SCI to include a complete time course for polymorphonuclear leukocytes (PMNs, neutrophils), macrophages/microglia, and T-cells over a period ranging from 2 hours to 180 days post-injury (dpi), identifying a surprising novel second phase of cellular inflammation. Thorough characterization of cellular inflammation using this method may provide a better understanding of neuroinflammation in the injured CNS, and reveal an important multiphasic component of neuroinflammation that may be critical for the design and implementation of rational therapeutic treatment strategies, including both cell-based and pharmacological interventions for SCI.

Quantification of cellular inflammation in the injured/pathological CNS by flow cytometry is complicated by lipid/myelin debris that can have similar size and granulation to cells, decreasing sensitivity/accuracy. We have advanced a cell preparation method to remove myelin debris and improve cell detection by flow cytometry in the injured spinal cord.

Avaliação quantitativa das células imunes no tecido medula lesionada por Citometria de Fluxo: um novo uso para um método de purificação celular

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Imunologia e Infecção

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Análise quantitativa de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas Virais e neuraminidases usando anticorpos Universal em Ensaios Blot simples slot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Detecção de vírus infecciosos de Campo mosquitos coletados por Vero Ensaio Cultura de Células

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

Monitoramento da Migração de Células dendríticas usando<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Ressonância Magnética

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

In vitro Ensaio de cocultura para avaliar migração trans epitelial de neutrófilo induzida por patógenos

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

Avaliação quantitativa de neutrófilos humanos migração através de um Cultivadas bexiga Epitélio

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Avaliação conformacional do HIV-1 trimérico glicoproteínas do envelope Usando um ELISA Ensaio Celular

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

De alto rendimento quantitativo em tempo real de RT-PCR Ensaio para Determinar Perfis de Expressão do tipo I e III do interferão subtipos

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Qualitativos e quantitativos Os ensaios para a detecção e caracterização de antimicrobianos Proteína

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...