Agradecemos aos membros anteriores e atuais do Kim Lab que contribuíram para o desenvolvimento desses protocolos ao longo do tempo. Dados representativos foram possibilitados por P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/Estados Unidos e P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/Estados Unidos. Esta publicação foi possível em parte pelo número de concessão T32 GM135134 do Prêmio Institucional Ruth L. Kirschstein National Research Service.

Os protocolos animais foram aprovados pelo Comitê Universitário de Recursos Animais da Universidade de Rochester. Os camundongos neste estudo foram mantidos no espaço livre de patógenos do biotério da Universidade de Rochester. Camundongos C57BL/6 machos/fêmeas, com idade entre 6 e 12 semanas (15-30 g), foram usados para o presente estudo. O isolamento do tecido do camundongo pode ser realizado em uma bancada com luvas para cobrir as mãos e uma máscara facial para cobrir o nariz e a boca, ou dentro de um gabinete de biossegurança. Toda a cultura celular e preparação da placa devem ser realizadas em uma cabine de biossegurança. Os reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Purificação e ativação de células T CD8 +
<ol><li>Preparação de materiais<ol><li>Para a seleção negativa de células T CD8+ : Preparar um meio de seleção negativa a partir do sobrenadante dos anticorpos GK1.5 e M5/114 das linhas celulares de hibridoma, que produzem anticorpos anti-CD4 e anti-MHCII, respectivamente. Misturar o sobrenadante na proporção de 1:1, filtrá-lo e armazená-lo a 4 °C para utilização futura (>0,5 μg de cada anticorpo/milhão de células totais). Como alternativa, kits comerciais de isolamento de células T CD8+ estão disponíveis.</li>
		<li>Para ativação de células T: Adicione 500 μL de anticorpos CD3 (10 μg/mL) e CD28 (16 μg/mL) em 1x DPBS (sem cálcio e magnésio) a uma placa de 24 poços tratada sem cultura de tecidos (TC) e armazene durante a noite a 4 °C para garantir a ligação da placa. NOTA: Anticorpos e proteínas revestem placas/placas de cultura não tratadas com TC melhor do que as normais tratadas com TC, portanto, placas de cultura não tratadas com TC são usadas para geração de células T.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare uma placa de cultura de 10 cm (ou equivalente) colocando um filtro de células de 70 μm na placa e dispense 2 mL de meio R9 no filtro (meio R9: RPMI 1640x suplementado com 10% de FBS, 1% de antibiótico-antimicótico, 20 mM de tampão HEPES, 1% de aminoácidos não essenciais MEM, 50 μM de β-mercaptoetanol).</li>
	<li>Obtenha um camundongo com histórico genético, sexo, idade e peso apropriados, conforme determinado pelo projeto experimental.</li>
	<li>Eutanásia do camundongo usando CO2 seguido de luxação cervical, ou estratégias apropriadas de eutanásia, conforme definido pelos protocolos locais de cuidados e uso de animais e aprovados pela instituição.</li>
	<li>Coloque o mouse em decúbito dorsal, estique todos os quatro membros perpendicularmente ao corpo e prenda as almofadas dos pés em uma placa de dissecação usando pinos T de dissecação do mouse ou equivalente. Faça uma incisão superficial e central através da camada cutânea no abdômen inferior ventral com uma tesoura de dissecção cirúrgica de camundongo e corte até o queixo (~ 8 cm). Separe a pele do revestimento peritoneal para expor os gânglios linfáticos. Estique a pele perpendicularmente para longe do tronco e prenda-a5.<ol><li>Extirpe suavemente os linfonodos cervicais, axiais, braquiais e inguinais bilateralmente usando uma pinça romba (ou o tipo preferido de um kit de dissecção cirúrgica de camundongo padrão). Transfira para o filtro de células preparado na etapa 1.2.</li>
		<li>Abra o peritônio e remova o baço. Transfira para o filtro de células preparado na etapa 1.2.</li>
		<li>Descarte a carcaça do camundongo no recipiente de risco biológico apropriado.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar uma suspensão unicelular dos tecidos linfóides secundários por ruptura mecânica sobre o filtro de células de 70 μm com 2 ml de meio R9 do passo 1.2, rodando repetidamente a ferramenta de ruptura tecidual meia volta no sentido dos ponteiros do relógio e no sentido contrário ao dos ponteiros do relógio. NOTA: A extremidade do êmbolo de uma seringa luer-lock, 3 mL ou 10 mL, funciona bem para esmagar e homogeneizar o tecido. Materiais alternativos podem ser usados a critério do usuário.</li>
	<li>Lave as células, a extremidade da seringa, o filtro e a placa de cultura com 7 mL de meio, garantindo que o filtro permaneça na posição vertical para evitar a transferência de pedaços maiores de tecido ou agregados celulares que possam estar presentes na suspensão de célula única.</li>
	<li>Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Pulverizar as células a 270 x g à temperatura ambiente (20 °C) durante 5 min e decantar o sobrenadante.</li>
	<li>Adicione 500 μL de tampão de lise por 1 min para remover os glóbulos vermelhos. Diluir com 9,5 ml de meio R9 e centrifugar a 270 x g (20 °C) durante 5 min. Decantar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspenda o pellet em 10 ml do meio de seleção negativa previamente preparado contendo anti-MHCII e anti-CD4 (passo 1.1.1). Agite em temperatura ambiente (20 °C) por 30 min.</li>
	<li>Pulverizar as células a 270 x g durante 5 min e decantar o sobrenadante. Lave 3x com 10 mL de meio R9.</li>
	<li>Simultaneamente, em um tubo cônico de 15 mL, lave 200 μL de grânulos de IgG anti-rato de ovelha em 7 mL de meio. Coloque o tubo em um ímã, remova o meio e repita a etapa de lavagem duas vezes. Ressuspenda os grânulos em 7 ml de meio R9.</li>
	<li>Pulverizar as células a 270 x g (20 °C) durante 5 min, transvasar o sobrenadante e, em seguida, ressuspender o sedimento em 7 ml de suspensão de esferas a partir do passo 1.13. Balance em temperatura ambiente (20 °C) por 45 min.</li>
	<li>Enriqueça as células T CD8+ por depleção de esferas magnéticas. Coloque o tubo cônico diretamente no ímã sem tampa por 3 min para remover as células ligadas a anticorpos/esferas. As células CD8+ devem ser retidas. Com o tubo ainda no íman, recolher a suspensão celular utilizando uma pipeta serológica ou equivalente e transferi-la para um novo tubo de 15 ml. Centrifugue a 270 x g (20 °C) por 5 min e lave 3x em médio.</li>
	<li>Lave a placa de ativação pré-revestida (etapa 1.1.2) com 1x DPBS duas vezes sem pipetar diretamente na superfície inferior da placa.</li>
	<li>Opcional: Realize uma separação de linfócitos vivos/mortos para remover as células mortas.<ol><li>Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL. Adicione suavemente 2 mL de meio de separação de linfócitos no fundo da suspensão celular. Centrifugue a 900 x g por 10 min (à temperatura ambiente) em baixa aceleração e desaceleração. NOTA: As células vivas se separarão na interface do meio e do meio de separação (camada branca média). As células mortas serão pellets no fundo do tubo e podem ser descartadas no final.</li>
		<li>Transfira a camada intermediária contendo linfócitos vivos para um novo tubo e centrifugue a 270 x g por 5 min à temperatura ambiente. Decantar o sobrenadante.</li>
	</ol></li>
	<li>Ressuspenda o pellet em 12 mL de meio com 10 U/mL de IL-2 de camundongo recombinante. Colocar 1 mL por alvéolo em uma placa de 24 poços não tratada com TC e transferir para 37 °C durante a noite.</li>
</ol>2. Levantamento das células T CD8+ ativadas
<ol><li>Visualize células usando um microscópio óptico de bancada padrão, usando a objetiva 4x ou 10x. NOTA: As células T ativadas parecerão maiores e redondas ou alongadas em comparação com as células T inativadas e devem ter aglomerados densos de células em todo o poço.</li>
	<li>Para levantar as células ativadas, interrompa as células com uma pipeta de 1 mL, certificando-se de misturar bem nas bordas da placa. Transfira as células para um novo tubo cônico de 15 mL. NOTA: As células ativadas são mais pegajosas e requerem pipetagem mais vigorosa.</li>
	<li>Lave os poços com 1 mL de meio R9 para remover quaisquer células restantes. Repita mais uma vez, se necessário. Centrifugue as células a 270 x g (20 °C) durante 5 min. Descarte o sobrenadante.</li>
	<li>Realize uma separação de linfócitos vivos/mortos para remover as células mortas como nas etapas 1.17-1.18.</li>
	<li>Mantenha as células T por remoção de células vivas/mortas a cada 3-4 dias em meio R9 com IL-2 em uma placa de 6 poços não TC. NOTA: As células T proliferam melhor em poços de pequena dimensão durante a ativação inicial, possivelmente devido ao contato entre células T e células T ou fatores solúveis derivados de células T que ajudam na ativação. A rápida proliferação de células T faz com que o meio de cultura fique amarelo dentro de 24-48 h após a cultura. Neste ponto, levante as células e transfira-as para um poço maior (placa de 6 poços não revestida e não TC) com meio de cultura fresco suficiente para alimentar as células (normalmente 5 mL por poço). Substitua o meio empobrecido por fresco sempre que indicado pela mudança de cor do meio amarelo ou a cada 3-4 dias.</li>
</ol>3. Preparação do prato de vidro
<ol><li>Prepare as câmaras ou placas de migração de células de vidro revestindo com 300 μL / cm2 Proteína A (0,1 mg / mL) durante a noite a 4 ° C, lave duas vezes com 1x DPBS dispensando no prato e decantando antes de passar para a próxima etapa.</li>
	<li>Cubra a câmara ou placa de migração com 300 μL / cm2 quimera ICAM-1 ou VCAM-1 Fc de camundongo recombinante (0,1-2,75 mg / mL) junto com uma quimiocina de camundongo recombinante (0,1-10 μg / mL) por 2-3 h à temperatura ambiente. Outros ligantes de integrina, como fibronectina, colágeno IV de camundongo e E-caderina de camundongo, são revestidos diretamente da câmara a 2,5-10 μg / mL durante a noite a 4 ° C.<ol><li>Lave as câmaras duas vezes com 1x DPBS, dispensando no prato e decantando imediatamente depois antes de adicionar as células. NOTA: As células T podem migrar de forma diferente em diferentes concentrações de ligantes de integrina e quimiocinas, dependendo do status de ativação, diferenciação, sensibilização e priming. O ensaio da migração celular em várias concentrações diferentes é fortemente sugerido.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque as células aderentes em placas revestidas de vidro 24 horas antes do início da imagem se co-cultivar células T com outras células, como células cancerígenas, para medir a morte de células T de células cancerígenas em tempo real.</li>
</ol>4. Preparação de células
<ol><li>Opcional: Corar células T e células aderentes com corante rastreador celular de escolha a 1 μg/mL por 1 x 107 células em 1x DPBS por 15 min a 37 °C, ou de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
	<li>Conte as células usando um hemocitômetro ou equivalente.</li>
	<li>Placa 1 x 105 células T CD8 + (ou quantidade desejada) em meio L-15 de Leibovitz suplementado com 1-5 g / L de glicose em uma câmara a 37 ° C. NOTA: O meio L-15 é formulado para uso sem um sistema de bicarbonato de sódio CO2. É tamponado usando aminoácidos básicos livres, tampões de fosfato e galactose para manter os níveis de pH.</li>
	<li>Opcional: Execute o bloqueio de integração.<ol><li>Pré-incube as células T com um anticorpo bloqueador para uma integrina (1-10 μg / mL, anti-camundongo CD11a (M17 / 4), anti-camundongo CD18 (M18 / 2), anti-camundongo VLA-4 (9C10) por 10 min e deixe rastejar na presença do mesmo anticorpo.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Microscopia de lapso de tempo
<ol><li>Realize microscopia de vídeo.</li>
	<li>Para células T, adquira imagens de campo claro e fluorescentes a cada 10-60 s por 10-60 min ou configurações de aquisição desejadas. NOTA: A migração de células T é sensível à temperatura e a temperatura ideal para a migração de células T de camundongos é de 37 °C. O sistema de controle de temperatura que este protocolo usa consiste em um deck de microscópio fechado e isolado com um sistema de aquecimento acoplado. A câmara de imagem fica no deck de imagem. O perímetro desta câmara possui um poço preenchido com água destilada que permite calor e umidade consistentes durante a geração de imagens. O micropoço está posicionado no centro da câmara de imagem.</li>
</ol>6. Análise assistida por software da migração de células T
<ol><li>Use o software Volocity para avaliar a migração de células T.<ol><li>Abra Volocity e crie uma nova sequência de imagens.</li>
		<li>Selecione e mova todos os filmes de microscopia de vídeo com lapso de tempo para a área azul em Volocity.</li>
		<li>Ajuste o brilho e o contraste usando a ferramenta de aprimoramento de contraste para as configurações desejadas pelo pesquisador.</li>
		<li>Verifique os tamanhos das imagens: 0,325 μm para 20x, 0,65 μm para 10x.</li>
		<li>Sequência: defina pontos de tempo (ex: 81 imagens se tirar uma imagem a cada 15 s por 20 min, 4 por min).</li>
		<li>Desmarque todos os pontos de tempo na guia de medição.</li>
		<li>Encontre objetos usando intensidade - deslize a barra para que fique à direita do pico.</li>
		<li>Excluir objetos por tamanho: todas as células com diâmetro menor que 10 μm e maior que 100 μm para excluir detritos celulares ou partículas não celulares. Exclua as células T que estão migrando por menos de 20% do tempo de gravação (que pode variar dependendo da definição de cada investigador).</li>
		<li>Ignorar objetos estáticos (caixa de seleção).</li>
		<li>Unir automaticamente trechos quebrados (caixa de seleção).</li>
		<li>Defina o caminho mais curto para não mais que 20 μm.</li>
		<li>A trilha de uma migração celular é a linha que conecta a localização da mesma célula ao longo do tempo. Certifique-se de que o algoritmo de rastreamento esteja rastreando detectando onde objetos individuais são detectados por segmentação em cada quadro e os objetos são correspondidos entre quadros.</li>
		<li>Salve um novo protocolo escolhendo Medidas > Salvar protocolo > Nomear novo protocolo.</li>
		<li>Clique em medir todos os pontos de tempo na guia de medição.</li>
		<li>Classifique as faixas por período de tempo, de alto a baixo.</li>
		<li>Registre os números de identificação da trilha para todas as células com boas trilhas, conforme definido pelo investigador. Após o rastreamento automático de células, a avaliação manual de cada trilha de célula é necessária para excluir trilhas falsamente identificadas ou quebradas. Exclua células com faixas ruins.</li>
		<li>Exporte o arquivo como texto separado por vírgulas e transfira os dados para o software de análise desejado. NOTA: Parâmetros básicos: Velocidade (μm/min), deslocamento (movimento líquido, μm), comprimento da trilha (comprimento total do caminho, μm) e índice sinuoso (MI; deslocamento líquido/comprimento da trilha. MI = 1 indica uma pista linear completamente reta).</li>
	</ol></li>
	<li>Execute o rastreamento manual usando a imagem J.<ol><li>Abra os plug-ins e selecione rastreamento e rastreamento manual. Defina os parâmetros - intervalos de tempo, calibração x/y (tamanho do pixel) e calibração z (no modo de rastreamento manual). Inicie o rastreamento de células individuais clicando em adicionar faixa, selecionando uma célula no primeiro ponto de tempo e continuando-o em todos os pontos de tempo. Em seguida, clique em Finalizar faixa. Repita para todas as células de interesse. NOTA: Trackmate, outra ferramenta para rastreamento de células, é um software de rastreamento automático disponível através do plug-in ImageJ.</li>
	</ol></li>
</ol>

Elucidando a cinética das células T: métodos para análise de migração em tempo real

<ol>
	<li>Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+in+health+and+disease.">T cells in health and disease.</a> Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235 (2023).</li><li>Fowell, D. J., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatio-temporal+control+of+effector+T+cell+migration.">The spatio-temporal control of effector T cell migration.</a> Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).</li><li>Tabdanov, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+t+cells+to+enhance+3d+migration+through+structurally+and+mechanically+complex+tumor+microenvironments.">Engineering t cells to enhance 3d migration through structurally and mechanically complex tumor microenvironments.</a> Nat Commun. 12 (1), 2815 (2021).</li><li>Kameritsch, P., Renkawitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+leukocyte+migration+strategies.">Principles of leukocyte migration strategies.</a> Trends Cell Biol. 30 (10), 818-832 (2020).</li><li>Flaherty, S., Reynolds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+naive+CD4++T+cell+isolation+and+in+vitro+differentiation+into+t+cell+subsets.">Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets.</a> J Vis Exp. (98), e52739 (2015).</li><li>Sailer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pd-1(hi)+CAR-T+cells+provide+superior+protection+against+solid+tumors.">Pd-1(hi) CAR-T cells provide superior protection against solid tumors.</a> Front Immunol. 14, 1187850 (2023).</li><li>Lim, K., Hyun, Y. M., Lambert-Emo, K., Topham, D. J., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+integrin+mac-1+in+vivo.">Visualization of integrin mac-1 in vivo.</a> J Immunol Methods. 426, 120-127 (2015).</li><li>Lim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+trails+guide+influenza-specific+CD8++T+cells+in+the+airways.">Neutrophil trails guide influenza-specific CD8+ T cells in the airways.</a> Science. 349, 4352 (2015).</li><li>Lim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+neutrophil+efferocytosis+shapes+T+cell+immunity+to+influenza+infection.">In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection.</a> Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).</li><li>Reilly, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T(rm)+integrins+CD103+and+CD49a+differentially+support+adherence+and+motility+after+resolution+of+influenza+virus+infection.">T(rm) integrins CD103 and CD49a differentially support adherence and motility after resolution of influenza virus infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (22), 12306-12314 (2020).</li><li>Amitrano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+CD8(+)+T+cell+metabolism+and+effector+functions.">Optical control of CD8(+) T cell metabolism and effector functions.</a> Front Immunol. 12, 666231 (2021).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+chemokine+receptor+signal+and+t-cell+migration.">Optogenetic control of chemokine receptor signal and t-cell migration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), 6371-6376 (2014).</li><li>Capece, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+intracellular+pool+of+IFA-1+is+critical+for+asymmetric+CD8(+)+T+cell+activation+and+differentiation.">A novel intracellular pool of IFA-1 is critical for asymmetric CD8(+) T cell activation and differentiation.</a> J Cell Biol. 216 (11), 3817-3829 (2017).</li><li>Hirai, T., Whitley, S. K., Kaplan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+and+function+of+memory+CD8(+)+T+cells+in+skin.">Migration and function of memory CD8(+) T cells in skin.</a> J Invest Dermatol. 140 (4), 748-755 (2020).</li><li>Mouchacca, P., Schmitt-Verhulst, A. M., Boyer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cytolytic+T+cell+differentiation+and+granule+exocytosis+with+T+cells+from+mice+expressing+active+fluorescent+granzyme+B.">Visualization of cytolytic T cell differentiation and granule exocytosis with T cells from mice expressing active fluorescent granzyme B.</a> PLoS One. 8 (6), e67239 (2013).</li><li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neutrophil+chemotaxis.">Analysis of neutrophil chemotaxis.</a> Methods Mol Biol. 370, 23-36 (2007).</li><li>Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intracellular+signaling+hierarchy+determines+direction+of+migration+in+opposing+chemotactic+gradients.">An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients.</a> J Cell Biol. 159 (1), 91-102 (2002).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> J Cell Biol. 75 (2), 606-616 (1977).</li><li>Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+access+microfluidic+device+for+the+study+of+cell+migration+during+chemotaxis.">Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis.</a> Integr Biol (Camb). 2 (11-12), 648-658 (2010).</li><li>Sai, J., Walker, G., Wikswo, J., Richmond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IL+sequence+in+the+LLKIL+motif+in+CXCR2+is+required+for+full+ligand-induced+activation+of+Erk,+Akt,+and+chemotaxis+in+HL60+cells.">The IL sequence in the LLKIL motif in CXCR2 is required for full ligand-induced activation of Erk, Akt, and chemotaxis in HL60 cells.</a> J Biol Chem. 281 (47), 35931-35941 (2006).</li><li>Choi, Y., Sunkara, V., Lee, Y., Cho, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhausted+mature+dendritic+cells+exhibit+a+slower+and+less+persistent+random+motility+but+retain+chemotaxis+against+ccl19.">Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19.</a> Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).</li><li>Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+crawling+in+capillaries:+A+novel+immune+response+to+staphylococcus+aureus.">Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004379 (2014).</li><li>Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+migration+within+a+three-dimensional+collagen+matrix.">Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix.</a> J Vis Exp. (92), e51963 (2014).</li><li>Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+migration+does+not+follow+a+random+walk.">Three-dimensional cell migration does not follow a random walk.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).</li><li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Overstreet, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-induced+interstitial+migration+of+effector+CD4(+)+T+cells+is+dependent+on+integrin+&#945;v.">Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin &#945;v.</a> Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).</li></ol>

Os autores declaram que toda a pesquisa e preparação do manuscrito foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Compreender o impacto biológico dos sinais convergentes in vivo é desafiador e não é fácil de interpretar. Os protocolos aqui apresentados fornecem um método razoável para entender a migração de células T em condições altamente definidas e biologicamente relevantes. Essas condições podem ser especificadas com base no critério do investigador, e os protocolos podem ser modificados para atender às necessidades de várias populações de células T, status de ativação e fenótipo celular. Além di...

As células T são os principais efetores da resposta imune adaptativa e específica do antígeno. Em nível populacional, as células T são heterogêneas, compostas por subconjuntos celulares com funções especializadas distintas. É importante ressaltar que as células T CD8+ são os principais efetores citolíticos do sistema imunológico, que eliminam diretamente as células infectadas ou disfuncionais1.
As células T CD8+ maduras residem no tecido e circulam pelo sangue e linfáticos em busca de antígenos. Durante a infecção, as células T são apresentadas a antígenos no sangue ou tecido e drenam rapidamente para o baço ou linfonodo de drenagem mais próximo para iniciar uma resposta imune produtiva. Em ambos os casos, as células T são ativadas, sofrem expansão clonal e deixam o sistema linfático para entrar no sangue, se ainda não estiverem lá. Durante esse processo, a sinalização intracelular confere a regulação negativa dos receptores linfáticos e a regulação positiva de vários receptores de integrina e quimiocina essenciais para a migração específica do tecido2. Em última análise, a migração direcionada de células T para locais de infecção é impulsionada por sinais ambientais convergentes que incluem sinalização de integrina e quimiocina.
As quimiocinas podem ser amplamente categorizadas em duas classes principais: (1) sinais homeostáticos, que são essenciais para diferenciação, sobrevivência e função basal, e (2) sinais inflamatórios, como CXCL9, CXCL10 e CCL3, que são necessários para a quimiotaxia. Geralmente, as quimiocinas criam um gradiente de sinal que impulsiona a migração direcional, conhecida como quimiotaxia, além de ativar a expressão da integrina1. A quimiotaxia é finamente regulada e altamente sensível, com células T capazes de responder a pequenas mudanças no gradiente que podem levá-las a uma direção ou local específico.
Além desses fatores relacionados às células T, a migração também é afetada pela composição e densidade da matriz extracelular (MEC). A ECM é composta por uma densa rede de proteínas, incluindo colágeno e proteoglicanos, que fornecem a estrutura para receptores de integrina adesiva nas células T. As integrinas são uma família diversificada de proteínas transmembranares, cada uma com domínios de ligação altamente especializados e efeitos de sinalização a jusante. A expressão dinâmica dos receptores de integrina na superfície de uma célula T permite uma rápida adaptação aos seus ambientes em mudança3. É importante ressaltar que as integrinas conectam as redes de ACTINA do citoesqueleto intracelular e do citoesqueleto intracelular que trabalham juntas para gerar a força propulsora necessária para o movimento das células T.
Em resumo, os padrões de migração variam de acordo com o fenótipo da célula imune ou sinais ambientais. Esses processos biológicos complexos são rigidamente regulados pela expressão de citocinas, quimiocinas e integrinas na superfície da célula T, nas células circundantes e no tecido infectado local. In vivo, esses mecanismos migratórios podem ser complexos e podem resultar de vários sinais aditivos4. Devido a essa complexidade, pode ser impossível estabelecer uma relação causal entre variáveis aparentemente interligadas. Para superar isso, existem várias abordagens in vitro para estudar aspectos específicos da migração de células T, como resposta a sinais específicos de quimiocinas e a interação entre integrinas de células T e proteínas de ligação à MEC. Este protocolo aborda métodos para isolar e ativar células T CD8+ murinas, com ensaios de migração in vitro no espaço bidimensional e ferramentas de análise computacional para análise da migração de células T especificadas. Esses métodos são vantajosos para o usuário porque não requerem materiais ou dispositivos sofisticados, como acontece com alguns outros ensaios de migração celular descritos na literatura. Os dados de migração celular gerados com esses métodos podem fornecer evidências de respostas imunes de maneira simplista que permite uma investigação mais aprofundada e informada in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339650</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>without calcium and without magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate non-TC treated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3736</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>352350</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6KR centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Violet</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34571</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Sorvall ST 16R</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen (IV)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354233</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>04200417C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Sheep anti-Rat IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag 15 Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12301D</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy sep mouse T cell isolation kit</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>19851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>F2442-500ML</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>10838039001</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td>http://fiji.sc/</td>
			<td>weblink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cubes</td>
			<td>Nikon or Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GK1.5</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HQ CCD camera</td>
			<td>CoolSNAP</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/h</td>
			<td>weblink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ automatic tracking plug in</td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.net/TrackMate</td>
			<td>weblink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ manual tracking plug in</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</td>
			<td>weblink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15</td>
			<td>Various</td>
			<td>See Materials</td>
			<td>Medium Recipe: Leibovitz&#8217;s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liebovitz&#39;s L-15 medium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lok disposable syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-459</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphocyte separation medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-072-CI</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M5/114</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope heating system</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>okolab.com</td>
			<td>Custom designs available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell EZ slide</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C86024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mojosort mouse CD8+ Na&#239;ve T cell isolation kit</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse E-cadherin</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>8875-EC-050</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse surgical dissection kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-820-096</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-TC 24wp</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R9</td>
			<td>Various</td>
			<td>See Materials</td>
			<td>Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 &#956;M &#946;-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>796-IC-050</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>575410</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T pins</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S99385</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE2000-U microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Various recombinant mouse chemokine</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VCAM-1 Fc chimera</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>643-VM-050</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time in vitro migration assay for primary murine cd8+ t cells

A resposta imune adaptativa depende da capacidade de uma célula T de migrar através do sangue, linfa e tecido em resposta a patógenos e corpos estranhos. A migração de células T é um processo complexo que requer a coordenação de muitas entradas de sinal do ambiente e das células imunes locais, incluindo quimiocinas, receptores de quimiocinas e moléculas de adesão. Além disso, a motilidade das células T é influenciada por pistas ambientais dinâmicas circundantes, que podem alterar o estado de ativação, a paisagem transcricional, a expressão da molécula de adesão e muito mais. In vivo, a complexidade desses fatores aparentemente entrelaçados torna difícil distinguir sinais individuais que contribuem para a migração de células T. Este protocolo fornece uma série de métodos, desde o isolamento de células T até a análise auxiliada por computador para avaliar a migração de células T em tempo real sob condições ambientais altamente específicas. Essas condições podem ajudar a elucidar os mecanismos que regulam a migração, melhorando nossa compreensão da cinética das células T e fornecendo fortes evidências mecanicistas que são difíceis de obter por meio de experimentos com animais. Uma compreensão mais profunda das interações moleculares que afetam a migração celular é importante para desenvolver uma terapêutica aprimorada.

T cells are the major effectors of the adaptive, antigen-specific immune response. On a population level, T cells are heterogeneous, comprised of cellular subsets with distinct specialized functions. Importantly, CD8+ T cells are the main cytolytic effectors of the immune system, which directly eliminate infected or dysfunctional cells1.
Mature CD8+ T cells reside in tissue and circulate through blood and lymphatics in search of antigens. During infection, T cells are presented with antigens in blood or tissue and quickly drain to the spleen or nearest draining lymph node to begin a productive immune response. In either case, T cells become activated, undergo clonal expansion, and leave the lymphatic system to enter the blood, if not already there. During this process, intracellular signaling confers the downregulation of lymphatic homing receptors and the upregulation of numerous integrin and chemokine receptors essential for tissue-specific migration2. Ultimately, the directed migration of T cells to sites of infection is driven by converging environmental signals that include integrin and chemokine signaling.
Chemokines can be broadly categorized into two main classes: (1) homeostatic signals, which are essential for differentiation, survival, and basal function, and (2) inflammatory signals, such as CXCL9, CXCL10, and CCL3, which are required for chemotaxis. Generally, chemokines create a signal gradient that drives directional migration, known as chemotaxis, in addition to activating integrin expression1. Chemotaxis is finely regulated and highly sensitive, with T cells capable of responding to tiny changes in gradient that can lead them toward a specific direction or location.
In addition to these T cell-related factors, migration is also affected by the extracellular matrix (ECM) composition and density. The ECM is made up of a dense network of proteins, including collagen and proteoglycans, which provide the scaffold for adhesive integrin receptors on T cells. Integrins are a diverse family of transmembrane proteins, each with highly specialized binding domains and downstream signaling effects. Dynamic expression of integrin receptors on the surface of a T cell enables quick adaptation to their changing environments3. Importantly, integrins connect the ECM and intracellular cytoskeletal actin networks that work together to generate the propelling force required for T cell movement.
In summary, migration patterns vary based on the immune cell phenotype or environmental signals. These complex biological processes are tightly regulated by the expression of cytokines, chemokines, and integrins on the surface of the T cell, surrounding cells, and the local, infected tissue. In vivo, these migratory mechanisms can be&#160;complex and may result from several additive signals4. Due to this complexity, it can be impossible to establish a causal relationship between seemingly interlocked variables. To overcome this, there are several in vitro approaches to study specific aspects of T cell migration such as response to specific chemokine signals and the interaction between T cell integrins and ECM binding proteins. This protocol addresses methods to isolate and activate murine CD8+ T cells, with in vitro migration assays in two-dimensional space and computational analysis tools for analyzing specified T cell migration. These methods are advantageous to the user because they do not require sophisticated materials or devices, as with some other cell migration assays described in the literature. Cell migration data generated with these methods can&#160;provide evidence of immune responses in a simplistic manner that enables further, informed investigation in vivo.

Autor em destaque: Compreendendo os mecanismos da doença por meio da análise em tempo real da migração de células T

Ensaio de migração in vitro em tempo real para células T CD8+ murinas primárias

The goal of our research is to understand T cell migration patterns in highly defined environmental conditions to enable informed in vitro experimentation and decipher molecular interactions impacting migration. Live imaging, such as intravital multiphoton microscopy, is used for in vivo understanding of immune cell kinetics. But microfluidic devices are a common in vitro tool that offer precise control over the microenvironment that cannot be afforded in a live specimen.Our protocol allows us to analyze intricate signaling pathways and provides better understanding for targeted in vitro experiments to further address the biological roles of individual signals in a cell type specific manner. Our method is simple, reproducible and easy to access in research labs that have a brightfield microscope featuring an attached digital camera. Therefore, our approach ensures a reliable set of methods to study dynamic cell migration events.Our lab will focus on investigating the migration of immune cells, including T cells and neutrophils in a variety of disease settings, such as tumors and infection, thereby comprehending the mechanisms that are important to regulate immune cell migration. This will help in developing the therapeutic methods to help treat and prevent disease.

A confirmação da ativação das células T pode ser obtida por citometria de fluxo, buscando aumento da expressão de CD69 e CD44, que são marcadores canônicos de ativação em células T murinas6. Além disso, a pureza da população de células T pode ser determinada por citometria de fluxo para células T CD3+ CD8+ . Este método produz >90% de população de células T CD8+ .
A migração de células T pode ser avaliada com progr...

Este protocolo fornece um método de isolamento primário de células T murinas e microscopia de lapso de tempo da migração de células T sob condições ambientais específicas com análise quantitativa.

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign ...

O objetivo de nossa pesquisa é entender os padrões de migração de células T em condições ambientais altamente definidas para permitir a experimentação in vitro informada e decifrar as interações moleculares que afetam a migração. Imagens ao vivo, como microscopia multifotônica intravital, são usadas para compreensão in vivo da cinética das células imunes. Mas os dispositivos microfluídicos são uma ferramenta comum in vitro que oferece controle preciso sobre o microambiente que não pode ser oferecido em um espécime vivo.Nosso protocolo nos permite analisar vias de sinalização intrincadas e fornece uma melhor compreensão para experimentos in vitro direcionados para abordar ainda mais os papéis biológicos de sinais individuais de uma maneira específica do tipo de célula. Nosso método é simples, reprodutível e de fácil acesso em laboratórios de pesquisa que possuem um microscópio de campo claro com uma câmera digital acoplada. Portanto, nossa abordagem garante um conjunto confiável de métodos para estudar eventos dinâmicos de migração celular.Nosso laboratório se concentrará em investigar a migração de células imunes, incluindo células T e neutrófilos em uma variedade de cenários de doenças, como tumores e infecções, compreendendo assim os mecanismos que são importantes para regular a migração de células imunes. Isso ajudará no desenvolvimento de métodos terapêuticos para ajudar a tratar e prevenir doenças.

real-time-in-vitro-migration-assay-for-primary-murine-cd8-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells

730 visualizações.  University of Rochester. O objetivo de nossa pesquisa é entender os padrões de migração de células T em condições ambientais altamente definidas para permitir a experimentação in vitro informada e decifrar as interações moleculares que afetam a migração. Imagens ao vivo, como microscopia multifotônica intravital, são usadas para compreensão in vivo da cinética das células imunes. Mas os dispositivos microfluídicos são uma ferramenta comum in vitro que oferece controle preciso sobre o microambiente...

Vídeo: Autor em destaque: Compreendendo os mecanismos da doença por meio da análise em tempo real da migração de células T

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign bodies. T cell migration is a complex process that requires the coordination of many signal inputs from the environment and local immune cells, including chemokines, chemokine receptors, and adhesion molecules. Furthermore, T cell motility is influenced by dynamic surrounding environmental cues, which can alter activation state, transcriptional landscape, adhesion molecule expression, and more. In vivo, the complexity of these seemingly intertwined factors makes it difficult to distinguish individual signals that contribute to T cell migration. This protocol provides a string of methods from T cell isolation to computer-aided analysis to assess T cell migration in real-time&#160;under highly specific environmental conditions.&#160;These conditions&#160;may help&#160;elucidate mechanisms that regulate migration, improving our&#160;understanding of T cell kinetics and providing&#160;strong mechanistic evidence that is difficult&#160;to attain through animal experiments. A deeper understanding of the&#160;molecular interactions that impact cell&#160;migration is important to develop improved therapeutics.

This protocol providesa method of primary murine T cell isolation and time-lapse microscopy of T cell migration under specific environmental conditions with quantitative analysis.