Gostaríamos de agradecer a Ann Grimm e Michael Zimmerman para revisão crítica deste manuscrito e Doug Hamilton para o seu suporte técnico.

1. Processo A ultrafiltração de fluxo tangencial de fibra oca <ol><li> Preparação de tampões e soluções: Solução de eluição (1 L): A 1 L de água de grau reagente adicionar 0,1 g polifosfato de sódio, 0,1 ml de Tween-80 e 0,01 ml Y-30 anti-espuma. </li><li> Prepare filtro de montagem (Figura 1) numa câmara de segurança biológica: <ol><li> Insira Masterflex I / P 73 tubos de laboratório através de uma cabeça de bomba Masterflex I / P Easy-carga conectada a uma unidade de brushless Masterflex I / P de precisão. </li><li> Fixar o tubo a uma 0-60 psi manómetro, glicerina-cheia equipado com um ramo TNP conector em T a montante da cabeça da bomba com um grampo de parafuso, e para um HDPE conector em T a jusante da cabeça da bomba. </li><li> Montar o frasco retido pela montagem de uma Nalgene 53-B tampa de enchimento / ventilação com tubo de laboratório Masterflex L / S 15 e um T-conector e prendendo-o a um Nalgene L 1 garrafa de polipropileno resistente. </li><li> Coloque Masterflex L / S 24 tubos wom um grampo da pinça (braçadeira pitada 2) e conectá-lo a partir da garrafa retentado ao PEAD T-conector. </li><li> Ligue o Masterflex L / S tubagem laboratório 24 do medidor de pressão para o Kasei Asahi Rexeed 25S de alto fluxo dialisador com um grampo de parafuso, e desde o dialisador para a garrafa retentado. Use adaptadores custom-made DIN projetados para acomodar ¼ tubulação ID &quot;para conectar o tubo à ultrafiltro de fibra oca. </li><li> Coloque Masterflex L / S tubo de laboratório 24 com uma braçadeira de aperto (braçadeira pitada 1) e conectá-lo a uma pipeta de plástico de 10 ml com o plug ponta e algodão removido para atuar como a linha de absorção da amostra e, em seguida, conectar o tubo de PEAD T- conector. </li><li> Encaixar uma extremidade do tubo de laboratório Masterflex L/S-36 com uma rampa de braçadeira e ligar a tubagem para a porta efluente localizado perto da extremidade de saída do filtro. Coloque a outra extremidade no recipiente de resíduos. </li></ol></li><li> Adicionar 0,01% (w / v) de polifosfato de sódio para a amostra de água de 10 L e misturar durante 3 min. </li><li> Feche braçadeira pitada 2e remover a tampa da abertura da garrafa retentado. Todos os outros grampos deve ser aberto. </li><li> Definir a direcção da bomba para movimentar o fluido a partir do conector em T para o medidor de pressão (direita para a esquerda Figura seguinte 1). Ajustar a velocidade da bomba a 25% da velocidade máxima e ligar a bomba. </li><li> Quando a garrafa retentado é 2/3 cheio, o grampo de aperto abertas 2 e substituir rapidamente a tampa da abertura para o frasco de retentado. Verifique todas as linhas e acessórios para garantir que não haja vazamentos. </li><li> Lentamente, aumentar a velocidade da bomba para a taxa de filtração desejado (cerca de 1,5 L / min), a verificação de fugas. Usando um cilindro graduado e um medidor de temporizador ou de fluxo, verificar a taxa de filtrado da água que sai a partir da linha de efluente (azul L / S 36 tubagem na Figura 1). As bolhas de ar podem tipicamente formar na extremidade de saída do filtro o que torna difícil alcançar uma pressão estável e taxa de filtração. Isto é corrigido por beliscar a linha de efluentes à mão por um momento. Essa açãogeralmente coaxial a bolha de ar para a porta filtrado e para sair através da linha de efluente. Repita sempre que necessário, tendo em mente que as bolhas de ar de tamanho de ervilha muitas vezes são inevitáveis. </li><li> Monitorizar o processo de filtração. Medir e registar a pressão ea velocidade de filtração, conforme necessário. A pressão nunca deve exceder 20 psi. Recomenda-se que a taxa de filtração não deve exceder 2,0 L / min. É importante que o volume de água na garrafa retentado ser monitorizada para assegurar que nunca se esvazia. É normal para o volume para aumentar ou diminuir ligeiramente. Se o volume de água na garrafa retido cai abaixo de 1/3 cheio, em seguida, remover a tampa da abertura e pitada perto braçadeira 2 na linha de garrafa retentado. Trazer de volta o volume para cerca de 2/3 cheio, abra o grampo e substituir rapidamente a tampa da abertura, garantindo uma perfeita vedação. Se o volume da garrafa retentado cai rapidamente e de forma contínua, em seguida, garantir a tampa do frasco é apertado e retentado a tampa da abertura é segura no lugar, e que a tubing ainda está em contacto com a amostra de água. Se estes problemas não estão a ocorrer, então é provável que a vedação na tampa do frasco retentado é má e deve ser substituído. </li><li> Quando o recipiente da amostra está vazio, o grampo de aperto imediatamente perto 1, reduzir a velocidade da bomba a 20% do seu máximo, remover a tampa da abertura da garrafa retentado e fechar a braçadeira de rampa. </li><li> Ajustar o volume da amostra no frasco de retentado para aproximadamente 200 ml por apertar ou desapertar a braçadeira de rampa. Após o volume é de cerca de 200 ml, apertar a braçadeira de rampa para os passos de eluição (1,11-1,12). </li><li> Adicionar 500 ml de solução de eluição para o recipiente da amostra e lavagem do interior do recipiente. Coloque a 10 ml pipeta ligada à linha de absorção da amostra para o recipiente que contém a solução de eluição. Assegure-se que a braçadeira de rampa é fechada. Pitada aberto apertar 1 e pitada perto Clamp 2 momentaneamente para elaborar a solução de eluição. </li><li> Depois que o de 500 ml de solução de eluição é elaborado, Perto beliscar braçadeira 1 e pinça de aperto aberto 2. Permitir que a solução de eluição para circular durante 5 minutos com uma velocidade da bomba de 20% do seu máximo. </li><li> Ajustar o volume da amostra no frasco de retentado a cerca de 100 ml por apertar ou desapertar a braçadeira de rampa na linha de efluente. Apertar a braçadeira de rampa e permitir que a amostra a circular durante 1 minuto. Evitar a puxar ar para dentro do tubo, assegurando o volume da amostra no frasco de retentado é suficientemente elevada para cobrir a relação L / S 15 tubagem de entrar na garrafa retentado. </li><li> Inverter o sentido da bomba que obriga a amostra no frasco de retentado. Permitir que a bomba para executar em sentido inverso durante 20 segundos, resultando em um total de ~ 225 ml na garrafa retentado. Desligue a bomba. </li><li> Retire o Masterflex I / P 73 tubos da cabeça da bomba e desligue o medidor de pressão. Desligue o Masterflex L / S 24 tubos de sair do ultrafiltro de fibra oca. Segurar o tubo acima da garrafa retentado para forçar qualquer amostra restante noretentado garrafa. </li><li> Desconecte todos os tubos do frasco e coloque a tampa de ventilação com uma tampa não-ventilação. </li><li> Continuar o procedimento IMS / IFA com o retentado ~ 225 ml. </li></ol> 2. Processo de Separação imunomagnética <ol><li> Preparação de tampões e soluções: <ol><li> Permita que os buffers incluídas nas Dynabeads: Cryptosporidium / Giardia kit de combinação para atingir a temperatura ambiente. </li><li> 1X SL-tampão A: Adicione 1 ml de 10X tampão de SL-A 9 ml de água ao grau de reagente. </li></ol></li><li> Transferir a ~ 225 ml de líquido a partir da garrafa retentado para um 250 ml rotulados tubo de centrífuga cónico. Lavar o frasco retentado duas vezes com 10 ml de água reagente, e adicionar as lavagens ao tubo de centrífuga cónico. Centrifugar a suspensão a 1500 xg durante 15 min a 4 ° C sem travagem. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante a partir da interface ar-água a 5 ml acima da pelete embalado para cada 0,5 ml de volume de sedimento (aspirado isto é, para 15 ml acima um volume de sedimento de 1,3 ml, e aspirado para 5 ml de uma pelota de 0,5 ml ou menos). </li><li> Exaustivamente ressuspender o sedimento para o sobrenadante por centrifugação e / ou pipeta de mistura. Transferir cada volume de 5 ml do líquido para o apartamento lados L10 tubo Dynal contendo 1 ml cada de tampão 10X SL-A e 10X SL-tampão B. Lavar o tubo de centrífuga cónico duas vezes com 2,5 ml de água e adicionar o reagente de lavagem ao o tubo de L10, elevando o volume total no ml L10 tubo para 12, incluindo os buffers. </li><li> Adicionar 100 ul cada um dos bem misturados ressuspensos Dynabeads anti-Cryptosporidium e anti-Giardia ao tubo de L10. Girar o tubo L10 a 18 rpm durante 1 hora à temperatura ambiente em um misturador rotor. </li><li> Coloque o lado plano do tubo de L10 contra o magneto MPC-6 e rocha suavemente a mão do tubo de ponta a ponta, 180 °, durante 2 minutos. </li><li> Mantendo o tubo L10 no magneto MPC-6 com o lado magneto-se, decantar o sobrenadante para longe do grânulo / (oo) cisto complexos Bound ao ímã. Remover o tubo L10 do íman e adicionar 0,5 ml de SL-1X tampão A para o tubo. Transferir a suspensão usando duas lavagens adicionais de 0,5 ml de SL-1X tampão A para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml realizada na MPC-S com o íman na posição vertical. </li><li> Agite suavemente o tubo no MPC-S ° ímã 180 para 1 minuto. Com o magneto no lugar, aspirar o sobrenadante com uma pipeta de Pasteur dirigida para a parte inferior do tubo de microcentrífuga. </li><li> Adicionar 1 ml de PBS 1X para o lado frontal do tubo de microcentrifugação, remover o magneto e agitar suavemente o tubo apenas até que as esferas são ressuspensas. Substituir o ímã na posição vertical e agite o tubo de 180 ° por 1 minuto. Aspirar o PBS enxaguar, sem perturbar o sedimento do grânulo, usando uma pipeta de Pasteur para remover detritos como tanto quanto possível. </li><li> Remover o íman e adicionar 50 uL de água reagente para o lado de trás do tubo de microcentrífuga. Vórtice do tubo em plena velocidade durante 50 segundos,em seguida, o tubo de incubar a 80 ° C durante 10 minutos, seguido por um vórtice de 30 segundos. Substituir o íman na MPC-S na posição inclinada, ligando os grânulos para o íman e deixando os cistos (OO) no líquido. Aplicar a suspensão cisto (oo) para um slide SingleSpot bem. </li><li> Repetir o passo 2,10, aplicando o líquido para o mesmo poço contendo a primeira dissociação. Corrediça lugar em um 37 ° C lâmina quente durante 1 hora para secar a suspensão ao poço da lâmina. </li></ol> 3. Coloração e Exame <ol><li> Preparação de tampões e soluções: Solução de trabalho DAPI: Adicionar 25 ul de solução-mãe DAPI (2 mg / ml em metanol) a 25 ml de PBS 1X. Estoque da loja e soluções de trabalho entre 1 ° C e 10 ° C no escuro. </li><li> Aplicar 50 uL de metanol ao poço da lâmina e deixar secar à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 50 ul da solução de DAPI de trabalho para o diapositivo poço e incubar durante 2 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Usar uma Kimwipe a pavio o DAPI do poço. Aplicar 50 uL de EasyStain. Incubar a 35 ° C durante 30 minutos. </li><li> Wick a mancha do poço com uma Kimwipe, e então lentamente adicionar 300 uL de tampão frio de fixação EasyStain, permitindo que ela flua ao longo da borda bem. Incubar durante 2 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Use um Kimwipe a pavio o tampão do poço e aplicar 10 ul de EasyStain Meio de Montagem. </li><li> Cuidadosamente aplicar uma lamela, removendo as bolhas que ocorrem. Selar a lamínula com unhas polonês claro. </li><li> Digitalizar todo o slide usando o filtro FITC, com ampliação de 200X total, para ovóides ou esféricas maçã verde-fluorescentes objetos que se assemelham a um oocisto ou cisto. Examine todos os objetos com o filtro DAPI a ampliação total 1000X e depois com DIC, também a ampliação total 1000X. Anote o tamanho utilizando um micrômetro ocular calibrada e características morfológicas. </li><li> Resultados de documentos. </li></ol> Nota: informações adicionaismação sobre o procedimento original pode ser encontrada em Dezembro de 2005 versão do método EPA 1623 12. O procedimento de ultrafiltração de fluxo tangencial de fibra oca de descrita é usado no lugar da secção de EPA 12,0 Método 1623. A dissociação calor modifica Seção 13.3.3 do método EPA 1623. O procedimento também descreve uma PBS adicional enxaguar durante o processo de IMS, que pode ser inserido em Dezembro de 2005 versão do Método 1623 após a secção 13.3.2.16. A lista completa de consumíveis, reagentes e equipamentos utilizados para o método EPA 1623 incluindo essas modificações está listado na lista de equipamentos. 4. Os resultados representativos Oocistos de Cryptosporidium e cistos de Giardia recuperados através dos processos de filtração e separação imunomagnética são detectados por análise microscópica. No 200X total, cada organismo exibindo um padrão de coloração típica, o tamanho ea forma como mostrado na Figura 2 </strong&gt; deverá continuar a ser observada por meio imersão em óleo e ampliação total 1000X. Isto irá permitir a medição e identificação de características que definem quer típicos ou características atípicas que excluiria a identificação positiva. Cryptosporidium é um ovóide a objecto esférico 4 a 6 m de diâmetro, que apresenta uma brilhante verde-maçã fluorescência FITC com arestas vivas destacadas (Figura 3A ). Com DAPI UV, um oocisto irá apresentar uma das seguintes categorias: característica típica de coloração azul claro interna com um aro de verde e não núcleos distinta (DAPI negativo), a coloração azul intenso interno, ou até quatro distinta, os núcleos céu azul-(DAPI positivos - Figura 3B). Características atípicas incluem desvios na estrutura, cor ou fluorescência DAPI (por exemplo, muitos núcleos corados, vermelho fluorescente estruturas internas). Se o objeto fluorescente tiver cumprido os critérios para FITC típico e coloração DAPI, ela é examinada através de con interferência diferencialcontraste (DIC). O objecto é examinada para atípicos externas ou internas características morfológicas, tais como ornamentação da parede celular, ou um ou dois núcleos grandes de enchimento da célula. Se as estruturas atípicos não são observados, o objecto é gravado na contagem total de IFA e classificados como uma estrutura amorfa ou vazia com um a quatro esporozoítos presentes (Figura 3C). Da mesma forma, Giardia, como os objetos são examinados com relação ao FITC e coloração DAPI, bem como características DIC, como axonemes, órgãos mediana, e núcleos de cistos de Giardia são redondos a ovóides objetos brilhantes verde-maçã, 8 -. De 18 mM de comprimento por 5 - 15 mm de largura, com arestas vivas destacadas (Figura 3D). Com DAPI UV, o cisto Giardia exibirão DAPI-negativa de coloração, ou DAPI-positivos características (Figura 3E). O objecto fluorescente é examinado por DIC para as características típicas e atípicas da mesma maneira como descrito para Cryptosporidium.Se características atípicas não são observados, o objecto é gravado na contagem total de IFA e classificados como estrutura contendo vazio amorfo, ou com um ou mais tipo de estruturas internas presentes (Figura 3F). Qualquer organismo que se observa características atípicas não deve ser contado como um cisto (oo). A análise microscópica das amostras ambientais pode ser um desafio como existem organismos que podem auto-fluorescem ou reagem de forma cruzada com o conjugado com FITC anti-Cryptosporidium e / ou anti-anticorpos Giardia 1. Recomenda-se que um analista estar familiarizado com os micróbios aquáticos e dezenas de revisão de lâminas para ganhar experiência identificação Cryptosporidium e Giardia. Pelo menos três (oo) cistos no slide positivo coloração de controle deve ser caracterizado antes de cada sessão no microscópio. Amostras de controle de qualidade pode ser enriquecida com (oo) cistos para determinar o rec por centoOvery para cada protozoário utilizando o cálculo: (Oo) Porcentagem de Recuperação cisto = ((Conde Amostra QC - Contagem da Amostra Unspiked) / Spike) x 100. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig1.jpg" /> Figura 1. Representação gráfica da tangencial sistema de ultrafiltração de fluxo de fibra oca de. O tubo é código de cores para auxiliar é a montagem do sistema. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig2.jpg" /> Oocistos Figura 2. Representante imagem da fluorescência de cistos (oo) Cryptosporidium e Giardia. Cryptosporidium e cistos de Giardia foram corados com FITC anti-Cryptosporidium / Giardia anticorpos. Setas, Giardia cistos; pontas de flechas, oocistos de Cryptosporidium. Um total de quatro oocistos de Cryptosporidium e seis cistos de Giardia foram encontrados no plano do foco. Amostras observed sob 200X. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig3.jpg" /> Figura 3. Representante imagens microscópicas de oocistos de Cryptosporidium e cistos Giaridia utilizados para a caracterização oocistos de Cryptosporidium (A - C).. Brilhante verde-maçã fluorescência FITC de objectos esféricos 4 a 6 m de diâmetro com arestas vivas destacadas (A) contendo até quatro distinta, os núcleos DAPI céu-azul (B) e de uma a quatro esporozoítos (s) por oocistos (C). cistos de Giardia (D - F). Brilhante verde-maçã FITC de fluorescência de volta para objectos ovóides 8 - 18 uM de comprimento por 5 - 15 mM de largura, com arestas vivas destacadas (D), contendo até quatro núcleos DAPI céu azul-(E) e com um ou mais de estrutura interna discernível tais como núcleos (N), o corpo de mediana (M) e ou axonemes (A) (F). As setas brancas, brilhantes Fluorescência verde maçã oocistos de Cryptosporidium e cistos de coloração Giardia walls; setas brancas, DAPI núcleos positivos. As amostras observadas sob aumento de 1000x.

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Os Estados Unidos Agência de Proteção Ambiental através de seu Escritório de Pesquisa e Desenvolvimento, em colaboração com o Escritório das águas subterrâneas e do Centro de Água Potável de Suporte Técnico da financiou a pesquisa aqui descrita. Todo o trabalho foi apoiado no local da EPA dos EUA, Cincinnati, Ohio. Embora as informações descritas neste artigo tenha sido financiado integralmente ou em parte, pela Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos sob contrato (Contrato EP-C-06-031) para Shaw Ambiental e Infra-estrutura, Inc, que não refletem necessariamente a posição do Agência e nenhum endosso oficial deve ser inferida. Tem sido submetido a análise Agência e aprovado para publicação.

Ultrafiltração de fluxo tangencial de fibra oca de é uma técnica alternativa e eficaz para a concentração inicial de oocistos de Cryptosporidium e de cistos de Giardia de água. De fibra oca de ultrafiltração é menos dispendioso do que os filtros tradicionais. Uma vez que tem a capacidade de concentrar oocistos de Cryptosporidium e de cistos de Giardia a partir de uma variedade de matrizes de água diferentes, é uma alternativa útil para as técnicas de filtração de corrente utilizados para o método EPA 1623. Tal como acontece com a maioria dos métodos de filtração outros, de fibra oca de ultrafiltração é propenso a incrustação com amostras extremamente turvos. Pressão de água de alta que resultaria da incrustação de filtro;, por conseguinte, é recomendado para monitorizar a pressão durante a execução de filtração. Além oocistos de Cryptosporidium e de cistos de Giardia, de fibra oca de ultrafiltração foi mostrado para ser capaz de se concentrar bactérias e vírus 1-3,5,8. De fibra oca de ultrafiltração outlined neste método pode ser utilizado para concentrar organismos múltiplos numa única amostra. É digno de nota que a obtenção de um volume final entre 200 e 250 ml é o passo crítico final no processo de concentração, de forma que os passos de centrifugação extra, que pode resultar em (oo) perda do cisto, são evitados (passo 2.2). No entanto, permitindo que o volume da garrafa para deixar cair demasiado baixo pode ter efeitos nefastos sobre as recuperações desde que não haverá volume de líquido suficiente para obrigar todos os oocistos ou cistos dentro da garrafa retentado. Portanto, recomenda-se a manter um volume final entre 200 e 250 ml. O calor de dissociação é uma alternativa ao passo de dissociação de ácido no Método 1623. Esta etapa alternativa tem sido mostrado para melhorar a recuperação de oocistos de Cryptosporidium e reduzir a variação do método, quando isolado a partir de qualquer rio ou água reagente 9. Uma comparação lado-a-lado de ácido e os métodos de calor de dissociação demonstrado que o uso de calor para dissociaçãote os organismos a partir das esferas imunomagnéticas produzido mais elevadas recuperações médios para ambos Cryptosporidium e Giardia. Além disso, a precisão de recuperações de Cryptosporidium e Giardia foi melhor nas amostras processadas com calor dissociação em comparação com o ácido 9 dissociação. A incorporação de HFUF como o passo de concentração permite mais flexibilidade, proporcionando a capacidade de concentrar vários organismos. Além disso, é uma alternativa menos dispendiosa aos actuais Método 1623 opções de filtragem.

<table border="1"><tbody><tr><td> Equipamentos / Reagente </td><td> Vendedor </td><td> Catalogo </td></tr><tr><td> Asahi Kasei Rexeed 25 S / R molhadas de fibra oca ultrafiltros </td><td> Disque Medical </td><td> REXEED25S / R </td></tr><tr><td> I / P 73 (Masterflex R-3603), ou equivalente </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06408-73 </td></tr><tr><td> L / S 24 (Masterflex Platinum cured), ou equivalente </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-24 </td></tr><tr><td> L / S 15 (Masterflex Platinum cured), ou equivalente </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-15 </td></tr><tr><td> L / S 36 (Masterflex Platinum cured), ou equivalente </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-36 </td></tr><tr><td> I / P Unidade Brushless Precision </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77410-10 </td></tr><tr><td> I / P Cabeça da bomba de carga fácil </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77601-10 </td></tr><tr><td> T preto PEAD, 1/4 &quot;x 3/8&quot; x 3/8 &quot; </td><td> EUA Plásticos </td><td> 62064 </td></tr><tr><td> Masterflex T-conector L / S 15-25 </td><td> Cole Parmer </td><td> EG-30.613-12 </td></tr><tr><td> Nalgene pesado pp garrafa L 1 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06257-10 </td></tr><tr><td> 10 pipetas ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-11C </td></tr><tr><td> Nalgene enchimento / descarga de tampa para 1/4 tubos &quot;, 53B </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06258-10 </td></tr><tr><td> Manômetro </td><td> Cole Parmer </td><td> Um-680-46-10 </td></tr><tr><td> Acoplamento Direto, NPT (F), 1/4 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06469-18 </td></tr><tr><td> NPT tee ramo, natural pp </td><td> Cole Parmer </td><td> A-30610-75 </td></tr><tr><td> Grampos do Pinch, 1/2 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06833-00 </td></tr><tr><td> CuStom ajuste DIN adaptadores </td><td> Moldado Produtos Corp </td><td> MPC-855NS.250 </td></tr><tr><td> Posição Anel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-670B </td></tr><tr><td> Suporte grampos Anel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-769-6Q </td></tr><tr><td> Keck rampa grampo, 14mm </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06835-10 </td></tr><tr><td> Polifosfato de sódio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 305553 </td></tr><tr><td> Tiossulfato de sódio penta-hidratado </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 72050 </td></tr><tr><td> Antifoam Y-30 emulsão </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A5758 </td></tr><tr><td> Tween-80 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> 10 L cubitainer polietileno de alta densidade colapsável </td><td> VWR </td><td> IR314-0025 </td></tr><tr><td> Centrifugar garrafeira </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-663-103 </td></tr><tr><td> Cónico de 250 ml de tubos de centrifugação </td><td> Corning </td><td> 430776 </td></tr><tr><td> Funil descartável </td><td> Cole Parmer </td><td> U-6122-10 </td></tr><tr><td> Esguicho </td><td> Cole Parmer </td><td> U-06252-40 </td></tr><tr><td> Centrifugar </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-15R </td></tr><tr><td> Rotor de caçamba móvel </td><td> Beckman Coulter </td><td> ARIES SX4750 </td></tr><tr><td> Centrifugar adaptadores de caçamba para 250 tubos cônicos ml </td><td> Beckman Coulter </td><td> 349849 </td></tr><tr><td> 200 mL de grosso calibre ponteiras </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-707-134 </td></tr><tr><td> VacuShield Filtro </td><td> Gelman </td><td> 629-4402 </td></tr><tr><td> 5 pipetas ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-11D </td></tr><tr><td> Dynabeads: Cryptosporidium / Giardia combinação kit </td><td> EuDEXX </td><td> 73002 </td></tr><tr><td> Cónico de 50 ml de tubos de centrifugação </td><td> Falcão </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Dynal L10 planas tubos lados </td><td> IDEXX </td><td> 74003 </td></tr><tr><td> Cronômetro </td><td> VWR </td><td> 23609-202 </td></tr><tr><td> Dynal ímã MPC-6 </td><td> IDEXX </td><td> 12002D </td></tr><tr><td> 1 pipetas ml </td><td> VWR </td><td> 53283-700 </td></tr><tr><td> 1,5 ml tubos de microcentrífuga de baixa aderência </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-320 </td></tr><tr><td> 1000 Pipetar e dicas de barreira correspondentes </td><td> Gilson </td><td> P1000/DF1000ST </td></tr><tr><td> 100 Pipetar e dicas de barreira correspondentes </td><td> Gilson </td><td> P100/DF100ST </td></tr><tr><td> 9 polegadas pipetas Pasteur </td><td> VWR </td><td> 14672-412 </td></tr><tr><td> Dynal ímã MPC-S </td><td> IDEXX</td><td> 12020D </td></tr><tr><td> Vórtice </td><td> VWR </td><td> 14216-188 </td></tr><tr><td> Dynabeads misturador rotador </td><td> IDEXX </td><td> 94701 </td></tr><tr><td> Bloco de calor </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718-2 </td></tr><tr><td> Armaduras Beads Lab </td><td> Lab Armadura </td><td> 42370-750 </td></tr><tr><td> Termômetro digital </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15-077-60 </td></tr><tr><td> De tampão fosfato pH-1X salina 7,4 (PBS 1X) </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td></tr><tr><td> Único lâminas spot </td><td> IDEXX </td><td> 30201 </td></tr><tr><td> Tampa de vidro </td><td> Corning </td><td> 287018 </td></tr><tr><td> EasyStain kit direto </td><td> BTF </td><td> - </td></tr><tr><td> 10 Pipetar e dicas de barreira correspondentes </td><td> Gilson </td><td> P10 &amp; DF10ST </td></tr><tr><td> 4 &#39;, 6&#39;-Diamidino-2-fenil-indol, dicloridrato (DAPI) </td><td> Sigma </td><td> D9542 </td></tr><tr><td> Limpar unha polonês </td><td> Fisher Scientific </td><td> S30697 </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> L6815 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34155 </td></tr><tr><td> Incubadora </td><td> Boekel Científico </td><td> 133000 </td></tr><tr><td> deslizar mais quente </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-474-521 </td></tr><tr><td> Óleo de imersão, tipo A ND = 1,515 </td><td> Nikon </td><td> MXA20234 </td></tr><tr><td> Nikon 90i microscópio com capacidade de DIC </td><td> Nikon </td><td> MBA 77000 </td></tr><tr><td> Plano APO objetivo óleo 100X </td><td> Nikon </td><td> MRD01901 </td></tr><tr><td> Planeje Achro 20X </td><td> Nikon </td><td> MRL00202 </td></tr><tr><td> FITC filtro </td><td> Nikon </td><td> 96302 </td></tr><tr><td> DAPI filtro </td><td> Nikon </td><td> 96301 </td></tr><tr><td> X-citar iluminador de fluorescência </td><td> Nikon </td><td> 87540 </td></tr><tr><td> Papel da lente </td><td> Nikon </td><td> 76997 </td></tr><tr><td> Saco descartável Biohazard </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01-829D </td></tr><tr><td> Biohazard recipiente para objectos cortantes </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-827-117 </td></tr><tr><td> Peróxido de hidrogénio a 3% </td><td> VWR </td><td> BDH3540-2 </td></tr><tr><td> Alvejante </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1952030 </td></tr><tr><td> Wypall </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34790 </td></tr></tbody></table>

a modified epa method 1623 that uses tangential flow hollow-fiber ultrafiltration and heat dissociation steps to detect waterborne cryptosporidium and giardia spp.

Espécies de Cryptosporidium e Giardia são duas das mais prevalentes protozoários que causam surtos de doenças diarreicas transmitidas pela água em todo o mundo. Para melhor caracterizar a prevalência desses patógenos, o método EPA 1623 foi desenvolvido e utilizado para monitorar os níveis destes organismos na água potável dos EUA fornece 12. O método tem três partes principais: a primeira é a concentração da amostra em que pelo menos 10 L de água da superfície em bruto é filtrado. Os organismos e detritos preso são então eluída a partir do filtro e centrifugado para concentrar ainda mais a amostra. A segunda parte do método utiliza um procedimento de separação imunomagnética onde a amostra de água concentrado é aplicado a esferas imunomagnéticas que se ligam especificamente para os oocistos de Cryptosporidium e de cistos de Giardia permitindo a remoção específica dos parasitas do detritos concentrada. Estes cistos (OO) são, então, separada das esferas magnéticas por uma dissociação de ácido procediDure. A parte final do método é a coloração de imunofluorescência e enumeração onde (oo) cistos são aplicados a um slide manchado, e enumerados por microscopia. Método 1623 tem quatro sistemas de amostragem listadas concentração para capturar oocistos de Cryptosporidium e cistos de Giardia na água: filtros Envirochek (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), filtros Envirochek HV (Pall Corporation), Filta-Max filtros (IDEXX, Westbrook, MA), ou centrifugação de fluxo contínuo (Haemonetics, Braintree, MA). No entanto, Cryptosporidium e Giardia recuperações (oo) cistos têm variado muito, dependendo da matriz de fontes de água e filtros usados ​​1,14. Um novo fluxo tangencial de fibra oca de ultrafiltração sistema (HFUF) foi recentemente mostrado ser mais eficaz e mais fiável à recuperação de oocistos de Cryptosporidium e cistos de Giardia da água a partir de matrizes diferentes, além disso, é menos caro do que a opção cápsula outro filtroS e pode concentrar-se agentes patogénicos múltiplos simultaneamente 1-3,5-8,10,11. Além disso, estudos anteriores por Hill e colaboradores demonstraram que a HFUF significativamente melhorada recuperações dos oocistos de Cryptosporidium quando comparado directamente com os filtros Envirochek HV 4. Modificações adicionais aos métodos atuais também têm sido relatadas para melhorar o desempenho do método. Substituindo o procedimento de dissociação de ácido com o calor de dissociação foi mostrado ser mais eficaz na separação Cryptosporidium a partir das esferas magnéticas, em alguns 9,13 matrizes. Este protocolo descreve um método modificado 1623 que utiliza o novo sistema de filtração HFUF com o passo de dissociação de calor. A utilização de HFUF com este método modificado é uma alternativa menos caro para actuais método EPA 1623 opções de filtração e proporciona uma maior flexibilidade, permitindo que a concentração de vários organismos.

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A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Este protocolo descreve o uso de um tangencial de fibra oca de sistema de ultrafiltração de fluxo concentração da amostra e uma dissociação de calor como passos alternativos para a detecção de waterborne<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; E<em&gt; Giardia</em&gt; Espécie, utilizando o método EPA 1623.

Uma variante do método EPA 1623 que usa fluxo tangencial ultrafiltração de fibra oca e Passos de calor de dissociação para detectar Waterborne<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; E<em&gt; Giardia spp.</em

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

20.3K visualizações.  Office of Research and Development, US Environmental Protection Agency. Este protocolo descreve o uso de um tangencial de fibra oca de sistema de ultrafiltração de fluxo concentração da amostra e uma dissociação de calor como passos alternativos para a detecção de waterborne Cryptosporidium E Giardia Espécie, utilizando o método EPA 1623.

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Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Sete Passos para Stellate Células

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Imunologia e Infecção

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

Um Protocolo de Chelex simples para extração de DNA de<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important plant parasitic nematodes. The microscopic second-stage juvenile (J2), molted once in the egg, is the infective stage. The J2s hatch from the eggs, move freely in the soil within a film of water, and locate root tips of suitable plant species. After penetrating the plant root, they migrate towards the vascular cylinder where they establish a feeding site and initiate feeding using their stylets. The multicellular feeding site is comprised of several enlarged multinuclear cells called 'giant cells' which are formed from cells that underwent karyokinesis (repeated mitosis) without cytokinesis. Neighboring pericycle cells divide and enlarge in size giving rise to a typical gall or root knot, the characteristic symptom of root-knot nematode infection. Once feeding is initiated, J2s become sedentary and undergo three additional molts to become adults. The adult female lays 150-250 eggs in a gelatinous matrix on or below the surface of the root. From the eggs new infective J2s hatch and start a new cycle. The root-knot nematode life cycle is completed in 4-6 weeks at 26-28&deg;C.
Here we present the traditional protocol to infect plants, grown in pots, with root-knot nematodes and two methods for high-throughput assays. The first high-throughput method is used for plants with small seeds such as tomato while the second is for plants with large seeds such as cowpea and common bean. Large seeds support extended seedling growth with minimal nutrient supplement. The first high throughput assay utilizes seedlings grown in sand in trays while in the second assay plants are grown in pouches in the absence of soil. The seedling growth pouch is made of a 15.5 x 12.5cm paper wick, folded at the top to form a 2-cm-deep trough in which the seed or seedling is placed. The paper wick is contained inside a transparent plastic pouch. These growth pouches allow direct observation of nematode infection symptoms, galling of roots and egg mass production, under the surface of a transparent pouch. Both methods allow the use of the screened plants, after phenotyping, for crossing or seed production. An additional advantage of the use of growth pouches is the small space requirement because pouches are stored in plastic hanging folders arranged in racks.

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Two distinct methods to screen plants with root-knot nematodes are described. The described approaches include high-throughput screens with nematodes in a nondestructive manner facilitating the use of these plants in breeding programs.

Alta e Baixa Screens rendimento com galhas-Nematóides Meloidogyne spp.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination1,2, cellular identification and gene expression3,4, monitoring viral multiplication in infected cells5, and bacterial community analysis and enumeration6.
Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (Tm) of these analogs for natural nucleic acids7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA12 and viral RNA in mammalian cells5.
Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes13. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

A novel high-throughput method is described that enables the detection and relative quantitation of small RNA and mRNA expression from single bacterial cells using locked nucleic acid probes and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization.

Fluxo de ácido nucléico bloqueado Citometria de fluorescência In situ Hibridação (LNA fluxo FISH): um método para detecção de RNA bacteriano Pequenas

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Glass Wool Filters for Concentrating Waterborne Viruses and Agricultural Zoonotic Pathogens

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration. Concentration methods tend to be specific for a particular pathogen group, for example US Environmental Protection Agency Method 1623 for Giardia and Cryptosporidium1, which means multiple methods are required if the sampling program is targeting more than one pathogen group. Another drawback of current methods is the equipment can be complicated and expensive, for example the VIRADEL method with the 1MDS cartridge filter for concentrating viruses2. In this article we describe how to construct glass wool filters for concentrating waterborne pathogens. After filter elution, the concentrate is amenable to a second concentration step, such as centrifugation, followed by pathogen detection and enumeration by cultural or molecular methods. The filters have several advantages. Construction is easy and the filters can be built to any size for meeting specific sampling requirements. The filter parts are inexpensive, making it possible to collect a large number of samples without severely impacting a project budget. Large sample volumes (100s to 1,000s L) can be concentrated depending on the rate of clogging from sample turbidity. The filters are highly portable and with minimal equipment, such as a pump and flow meter, they can be implemented in the field for sampling finished drinking water, surface water, groundwater, and agricultural runoff. Lastly, glass wool filtration is effective for concentrating a variety of pathogen types so only one method is necessary. Here we report on filter effectiveness in concentrating waterborne human enterovirus, Salmonella enterica, Cryptosporidium parvum, and avian influenza virus.

Glass wool filters have been used to concentrate waterborne viruses by a number of research groups around the world. Here we show a simple approach for constructing glass wool filters and demonstrate the filters are also effective in concentrating waterborne viral, bacterial and protozoan pathogens.

Vidro Filtros de lã para a concentração de vírus e transmitidas pela água Agrícolas patógenos zoonóticos

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration.  Concentration methods tend to be specific for a ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

Um método simples e eficiente para detectar ativação do fator nuclear em neutrófilos humanos por citometria de fluxo

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Baseada em imagem Técnica de Citometria de Fluxo para avaliar as mudanças na função de granulócitos<em&gt; In Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Um protocolo simples e rápido para não enzimática Separar frescos Tecidos Humanos para a Análise de infiltrar Linfócitos

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, which are expressed as minimum inhibitory concentrations (MICs) are used in research for antimicrobial development and monitoring of resistance development and in the clinical setting for antimicrobial therapy guidance. Dalbavancin is a semi-synthetic lipoglycopeptide antimicrobial agent that was approved in May 2014 by the Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of acute bacterial skin and skin structure infections caused by Gram-positive organisms. The advantage of dalbavancin over current anti-staphylococcal therapies is its long half-life, which allows for once-weekly dosing. Dalbavancin has activity against Staphylococcus aureus (including both methicillin-susceptible S. aureus [MSSA] and methicillin-resistant S. aureus [MRSA]), coagulase-negative staphylococci, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus group, &#946;-hemolytic streptococci and vancomycin susceptible enterococci. Similar to other recent lipoglycopeptide agents, optimization of CLSI and ISO broth susceptibility test methods includes the use of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a solvent when preparing stock solutions and polysorbate 80 (P80) to alleviate adherence of the agent to plastic. Prior to the clinical studies and during the initial development of dalbavancin, susceptibility studies were not performed with the use of P-80 and MIC results tended to be 2-4 fold higher and similarly higher MIC results were obtained with the agar dilution susceptibility method. Dalbavancin was first included in CLSI broth microdilution methodology tables in 2005 and amended in 2006 to clarify use of DMSO and P-80. The broth microdilution (BMD) procedure shown here is specific to dalbavancin and is in accordance with the CLSI and ISO methods, with step-by-step detail and focus on the critical steps added for clarity.

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Um método de microdiluição em caldo de referência para Dalbavancin<em&gt; In Vitro</em&gt; Teste à Susceptibilidade de bactérias que crescem aeròbia

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

A Fluxo Simples Citometria método para medir glicose Captação e expressão de transportadores de glicose para monócitos subpopulações em sangue total

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...