O trabalho descrito foi apoiado pelo Centro de Cornell sobre o microambiente e metástases através do número Prêmio U54CA143876 do National Cancer Institute. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Câncer ou o National Institutes of Health. Este trabalho foi ainda financiado em parte por um National Science Foundation Graduate Research Fellowship (ADH).

O protocolo seguinte é para a produção de um dispositivo de microtubo único. 1. Preparação da solução de Nanotubos de haloisita <ol><li> Sonicado (10-13 W (rms)) 250 uL solução nanotubo haloisite (6,6% em peso em água) 30 seg. Solução legal com água fria e repita uma vez sonicação. Esfriar novamente. </li><li> Desenhar solução sonicada para uma seringa, anexar um filtro de seringa de 0,45 uM, e solução de filtro para dentro do tubo de microcentrífuga limpo. Solução a vórtice ocasionalmente para manter a homogeneidade. </li></ol> 2. Revestimento de superfície Microtube interno com nanotubos de haloisita <ol><li> Obter 50 cm longa seção de Micro-Renathane microtubing (300 mM de diâmetro interior, 35,3 uL de volume interno). Corte uma extremidade do microtubo de uma diagonal e inserir um pedaço pequeno adaptador IDEX. Inserir a agulha de uma seringa 3/10 cc 29G na outra extremidade do microtubo. </li><li> Para limpar o microtubo, colocar a extremidade aberta do microtubo (a extremidadecom o adaptador) em etanol 70% e draw ~ 50 uL de etanol para a seringa para encher microtubo. </li><li> Lave o etanol a partir do microtubo desenhando um volume generoso de água destilada para a seringa. </li><li> Retire a seringa do microtubo, esvaziar a seringa e volte para o microtubo. </li><li> Prepara-se uma solução de 0,02% w / v de poli-L lisina em água. Desenhar 50 uL para o microtubo e permitir a sentar-se durante 5 min à temperatura ambiente (RT). </li><li> Desenhar 100 uL solução nanotubo e filtrada para o microtubo e deixa-se incubar durante 3 min a RT. </li><li> Desenhe 100 uL de água através do microtubo para lavar a solução de nanotubos. Permitir microtubo revestido para sentar, cheio de água, durante a noite à RT. </li></ol> 3. Preparação de microtubos para isolamento de células <ol><li> Prepara-se uma solução de 10 mg / g de proteína mL em fosfato de Dulbecco 1X salino tamponado (PBS, pH 7,0 - 7,2). Desenhe 50 uL PBS através microtubo e desenhe 50 mL dea solução de proteína G-e deixa-se incubar durante 1,5 h à RT. </li><li> Prepara-se uma solução contendo 5 ug / mL E-selectina-IgG e 50 anticorpo mcg / ml (anti-EpCAM para a maioria das amostras de cancro, anti-PSMA para amostras de cancro da próstata) em PBS. Desenhar 50 uL da E-selectina e solução de anticorpo para o microtubo e deixa-se incubar durante 2 horas à RT. </li><li> Adesão celular não específica é bloqueado com proteína de leite de 5%. Prepara-se uma solução de 5% (w / v) de proteína de leite em PBS. Desenhar 50 uL solução de proteína do leite no microtubo e deixa-se incubar durante 1 hora à RT. </li><li> Desenhe 50 uL de PBS em tubo e deixar à temperatura ambiente até amostras de sangue ou de buffy coat está pronto para processamento. </li><li> 10 min antes de utilizar o microtubo para o isolamento, desenhar 50 uL de PBS que foi saturada com Ca 2 + (&quot;PBS +&quot;) para activar as moléculas de selectina. </li></ol> 4. Preparação de amostras para o isolamento de células <ol><li> Desenhe ou obter 10 mL de sangue de paciente em heparinizadotubo. </li><li> Colocam-se 10 mL de Ficoll-Paque solução de isolamento de linfócitos em 50 mL tubo de centrífuga. Suavemente camada de sangue 10 mL todo em cima de Ficoll de modo a não misturar o sangue e Ficoll. </li><li> Centrifugar a 2000x g durante 15 min a 4 ° C com desaceleração mínima. </li><li> Retire a camada de revestimento buffy e coloque em novo tubo. </li><li> Buffy coat lavagem com PBS (centrifugue a 230x g durante 10 min, descartar o sobrenadante). </li><li> Suavemente ressuspender as células com 1 mL de tampão de lise de RBC e incubar durante 10 min a RT para lisar os eritrócitos. </li><li> Adicionar 10 ml de PBS, misturar suavemente, e centrifugue a 230x g durante 10 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento suavemente em 3 a 4 ml de PBS +. </li></ol> 5. Isolamento das células <ol><li> Anexar uma extremidade do microtubo funcionalizado a uma seringa de 5 ml usando adaptadores IDEX. </li><li> Inserir a seringa para uma bomba de seringa. </li><li> Submergir a extremidade aberta do microtubo funcionalizado para dentro da célula suspension. </li><li> Processar a suspensão de células através do microtubo de 1 a 4 mL / h. </li><li> Transferir a extremidade aberta do microtubo a um tubo contendo PBS + e desenhar 300 + PBS uL em seringa a 0,016 ml / min para remover as células não ligado e fracamente ligados do microtubo. </li><li> Coloque a extremidade aberta do microtubo para um tubo limpo. Desconecte a seringa do microtubo e anexar uma seringa pré-cheia com Accutase. Suavemente perfundir Accutase suficiente para o microtubo para preencher (~ uL 50) e permitir que a incubar à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Anexar um seringa pré-carregada com 1 mL de meio de crescimento (79% de RPMI, FBS 20%, 1% de penicilina estreptomicina) e perfundir em microtubo, recolha de efluente em cultura de tecidos bem tratados placa. </li><li> Células de cultura a 37 ° C e 5% de CO2 sob condições humidificado. </li></ol> 6. Os resultados representativos O objectivo desta técnica consiste em isolar as células cancerosas viáveis ​​a partir do sangue de pacientes com cancro. Existem vários métodos para identificar as células cancerosas em cultura; uma verificação necessária de sucesso dispositivo. Nós escolhemos para corar as células em cultura com anticorpos contra porções epiteliais, tais como EpCAM (molécula de adesão celular epitelial) ou PSMA (próstata antigénio de membrana específica), além de DAPI para identificar núcleos de células intactas (Fig. 2 e 3). O número de células cancerosas capturado usando esta técnica é necessariamente uma função do número de CTC na amostra de partida, e variabilidade paciente pode ser elevado. No processamento de amostras colhidas de pacientes diagnosticados com câncer em estágio IV, que rotineiramente capturar entre 100 e 500 células cancerosas por tubo de sangue, com pureza&gt; 50%. Imediatamente após o isolamento, um maior número de leucócitos contaminantes podem estar presentes. No entanto, estes números será esgotada de incubação a seguir no meio de cultura para até 5 dias. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig1.jpg" /> <strong&gt; Figura 1. esquemático de microtubo funcionalizado para CTC isolamento, mostrando-selectina mediada circulante seguido por mediada por anticorpo de adesão estática. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig2.jpg" /> Figura 2. Dados representativos de isolamento CTC a partir de amostras de sangue colhido de uma paciente com câncer de mama e um paciente com câncer de pulmão. O número de células viáveis ​​positivamente identificados como CTC com base na coloração de EpCAM é representada pelas barras sólidas e pertencem à ordenadas da esquerda e da percentagem de células que foram identificados como CTC em comparação com o número total de células capturadas é representada pelas barras abertas e medido na ordenada a direita. Os resultados são depois de cinco dias em cultura. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig3.jpg" /> Figura 3. Micrografias representativos de dadores separadas (A e B) de CTC em cultura de 5 dias subsequentes para isolatiem a partir de uma amostra de sangue do cancro do paciente. As células foram coradas com fluorescência para EpCAM com AlexaFluor 488 (verde) e 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para visualizar o núcleo (azul).

<ol>
	<li>Allard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases.">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).</li><li>Hughes, A. D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobiotechnology+for+the+capture+and+manipulation+of+circulating+tumor+cells.">Nanobiotechnology for the capture and manipulation of circulating tumor cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. , (2011).</li><li>Hughes, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtube+Device+for+Selectin-Mediated+Capture+of+Viable+Circulating+Tumor+Cells+from+Blood.">Microtube Device for Selectin-Mediated Capture of Viable Circulating Tumor Cells from Blood.</a> Clinical Chemistry. 58, 846-853 (2012).</li><li>Hughes, A. D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+naturally+occurring+halloysite+nanotubes+for+enhanced+capture+of+flowing+cells.">Use of naturally occurring halloysite nanotubes for enhanced capture of flowing cells.</a> Langmuir. 26, 12155-12164 (2010).</li><li>Al-Mehdi, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+origin+of+metastasis+from+the+proliferation+of+endothelium-attached+tumor+cells:+a+new+model+for+metastasis.">Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis.</a> Nat. Med. 6, 100-102 (2000).</li><li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+Building+a+framework.">Cancer metastasis: Building a framework.</a> Cell. 127, 679-695 (2006).</li><li>Lee, D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+Printing+of+P-Selectin+Increases+the+Rate+of+Neutrophil+Recruitment+Under+Shear+Flow.">Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow.</a> Biotechnology Progress. 24, 1052-1059 (2008).</li><li>Gout, S., Tremblay, P. L., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectins+and+selectin+ligands+in+extravasation+of+cancer+cells+and+organ+selectivity+of+metastasis.">Selectins and selectin ligands in extravasation of cancer cells and organ selectivity of metastasis.</a> Clin. Exp. Metastasis. 25, 335-344 (2008).</li><li>Geng, Y., Marshall, J., King, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomechanics+of+the+Metastatic+Cascade:+Tumor+Cell-Endothelial+Cell+Interactions+in+the+Circulation.">Glycomechanics of the Metastatic Cascade: Tumor Cell-Endothelial Cell Interactions in the Circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. , 1-16 .</li><li>Stott, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a+microvortex-generating+herringbone-chip.">Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18392-18397 (2010).</li></ol>

MRK é consultor científico de CellTraffix, Inc. (Rochester, NY).

É frequentemente o caso em que os primeiros passos na descoberta de novas terapêuticas do cancro utilizam linhas de células cancerosas, que se assemelham questionável para as células cancerosas primárias ainda continuar a ser utilizado, devido à sua facilidade de utilização no laboratório. A investigação sobre o desenvolvimento de novas terapias contra o câncer poderia ser acelerada se as células cancerosas humanas primárias foram utilizados no início da pesquisa romance. CTC são o tipo mais facilmente acessível de célula cancerosa, devido à sua presença no sangue e da facilidade de uma colheita de sangue padrão. Além disso, células tumorais circulantes representam um passo necessário no processo de metástase 5,6, pelo que a sua relevância para a doença e utilidade para o direcionamento de novas drogas é clara. Isolamento de CTC a partir de sangue in vitro é complicada pelas suas baixas concentrações: da ordem de um por milhão leucócitos ou a uma por bilhão eritrócitos 7. A maioria dos métodos actuais para a detecção de CTC no sangue, incluindo a célula única técnica aprovado pela FDA<html> Pesquisa (Veridex), danos ou destruir as células no processo de detecção, impedindo o uso além de enumeração. O método descrito acima não comprometer a viabilidade celular e, assim, abre a porta para a investigação clínica sobre o cancro futuro. Como a recuperação de células intactas é o objetivo desta técnica, é imperativo que as células ser manuseados com cuidado, especialmente durante as etapas de separação de sangue. Há um certo número de parâmetros ajustáveis ​​no presente sistema que possa ser alterada para atingir rendimento melhorado, dependendo das características críticas, tais como o tipo de cancro. Nos passos acima descritos, que tinha escolhido para usar EpCAM como um anticorpo CTC-específico para todos os tipos de cancro, excepto quando o processamento de amostras de cancro da próstata, em que anti-PSMA foi usado. Outras substituições de cancro com anticorpos monoclonais específicos pode certamente ser usado para melhorar o desempenho para pacientes individuais. Além disso, as concentrações de selectina e anticorpo pode ser alterada para melhorar a captação 8. &quot;&gt; Uma característica essencial do dispositivo é a incorporação de E-selectina moléculas sobre a superfície. E-selectina é normalmente expressa na superfície luminal das células endoteliais e de função para recrutar rápidas leucócitos que se deslocam para locais de inflamação. Leucócitos Flowing ligar transitoriamente para moléculas de selectina, resultando em um ritmo mais lento, comportamento circulante que facilita a ligação mais lento e mais forte da célula para o endotélio, por integrinas. evidência experimental convincente existe que faz o caso que CTC pode extravasamento por um mecanismo semelhante 9,10. A inclusão de selectina também permite que o dispositivo a ser operado a maiores taxas de fluxo, as taxas de que, caso contrário evitar que as células de se ligarem a anticorpos 11. Assim nosso dispositivo fisiologicamente imita uma vénula para capturar biomimetically fluindo CTC sem causar dano celular. O desempenho do dispositivo melhorado pode ser atribuída à adição do revestimento nanotubo haloisite para a superfície luminaldo dispositivo. Estudos anteriores demonstraram que existem três principais componentes do revestimento nanotubo que permite a funcionalidade melhorada. Em primeiro lugar, o revestimento de nanotubos proporciona uma área de superfície aumentada, permitindo maior deposição de proteína sobre a superfície 4. Em segundo lugar, na realização de microscopia de força atómica no revestimento nanotubo determinámos que nanotubos individuais sobressair da superfície para o fluxo. Isto permite que as moléculas de selectina a ser apresentada tanto como um micron acima da superfície de modo que as células podem ser capturados e recrutados para a superfície anterior no seu percurso através do tubo 4. Finalmente, o revestimento nanotubo haloisite é capaz de prevenir a adesão de leucócitos e espalhamento à superfície, permitindo a um número reduzido de leucócitos capturados juntamente com o CTC e, assim, uma maior purezas subsequentes CTC 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> 300 tubos ID hum </td><td> Braintree Científico </td><td> MRE025 </td></tr><tr><td> Aumentar a tubagem para ligação a uma seringa </td><td> IDEX Saúde &amp; Ciência </td><td> 1507L </td></tr><tr><td> Seringa de 5 ml para a bomba </td><td> BD </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> Pequeno conector para tubos de grande </td><td> IDEX Saúde &amp; Ciência </td><td> P-770 </td></tr><tr><td> Um tubo conector grande para seringa </td><td> IDEX Saúde &amp; Ciência </td><td> F-120 e P-659 </td></tr><tr><td> Seringa para microtubo (seringa de insulina 3/10cc U-100 29G 1/2 &#39;) </td><td> BD </td><td> 309301 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> MP Biomedicals LLC </td><td> 1000449 </td></tr><tr><td> Ficol-Paque Plus </td><td> GE Curathcare Bio-Sciences AB </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RBC Lysis Buffer (Buffer de EL, 1000ml) </td><td> Qiagen </td><td> 1014614 </td></tr><tr><td> Proteína G, 5 mg </td><td> Calbiochem (calbiochem.com) </td><td> 539303 </td></tr><tr><td> Anticorpo EpCAM/TROP-1 Humanos </td><td> R &amp; D Systems </td><td> MAB960 </td></tr><tr><td> PSMA Antibody (GCP-04) </td><td> Abcam </td><td> ab66911 </td></tr><tr><td> Placas de 96 poços (Microtest 96) </td><td> BD Falcon </td><td> 35-3072 </td></tr><tr><td> Blotting Grau Bloqueador de leite sem gordura a seco, 300g </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 216005508 </td></tr><tr><td> Nanotubos de haloisita </td><td> NaturalNano </td><td> NN-HNT200 </td></tr><tr><td> Carbonato de cálcio, 5g </td><td> Aldrich Química </td><td> 481807 </td></tr><tr><td> rhE-Selectin/Fc ug, Chimera 100 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 724-ES </td></tr><tr><td> Meio RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 22400-089 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-095 </td></tr><tr><td> Poli-L-lisina a 0,1% w / v em água </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8920-100ML </td></tr><tr><td> Sonic Dismembrator </td><td> Fisher Scientific </td><td> Modelo 100 </td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> Bioquímicos Atlanta </td><td> S11056H </td></tr><tr><td> Estreptomicina penicilina </td><td> Sigma Vida Siiences </td><td> P0781 </td></tr></tbody></table>

rapid isolation of viable circulating tumor cells from patient blood samples

Células tumorais circulantes (CTC) são células que divulgam a partir de um tumor primário em todo o sistema circulatório e que em última instância pode formar tumores secundários em locais distantes. CTC contagem pode ser utilizado para seguir a progressão da doença com base na correlação entre a concentração de CTC no sangue e gravidade da doença 1. Como uma ferramenta de tratamento, CTC poderia ser estudado em laboratório para desenvolver terapias personalizadas. Para este fim, o isolamento CTC deve causar nenhum dano celular, e contaminação por outros tipos de células, em particular de leucócitos, devem ser evitados tanto quanto possível 2. Muitas das técnicas atuais, incluindo o dispositivo aprovado pela FDA único para a enumeração CTC, CTC destruir como parte do processo de isolamento (para mais informações, consulte Ref. 2). Um dispositivo micro para capturar CTC viável é descrito, constituído por uma superfície funcionalizada com E-selectina glicoproteína além de anticorpos contra marcadores epiteliais 3. Para melhorar desempenho do dispositivonho um revestimento de nanopartículas foi aplicado consistindo de nanotubos haloisite, um aluminossilicato de nanopartículas colhidas a partir de argila 4. As moléculas de E-selectina fornecer um meio para captar rápido CTC movendo que são bombeados através do dispositivo, dando uma vantagem sobre alternativos dispositivos microfluídicos em que vezes mais processamento são necessárias para fornecer células alvo com o tempo suficiente para interagir com uma superfície. Os anticorpos para alvos epiteliais fornecer CTC-especificidade para o dispositivo, bem como proporcionar um parâmetro prontamente ajustável para sintonizar o isolamento. Finalmente, o revestimento nanotubo haloisite permite o isolamento significativamente melhorada em comparação com outras técnicas, ajudando a captura de forma rápida células que se deslocam, proporcionando maior área de superfície para adsorção de proteínas, e repelindo leucócitos contaminantes 3,4. Este dispositivo é produzido por uma técnica simples usando de prateleira de materiais, e tem sido utilizado com sucesso para capturar as células cancerosas do sangue de metastáticopacientes com câncer. Células capturadas são mantidos durante até 15 dias em cultura após isolamento, e estas amostras consistem tipicamente de&gt; 50% viáveis ​​células cancerosas primárias a partir de cada paciente. Este dispositivo tem sido utilizado para capturar CTC viável tanto sangue diluído todo e amostras do buffy coat. Por fim, apresentamos uma técnica com a funcionalidade em uma clínica para desenvolver terapias contra o câncer personalizados.

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Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Células tumorais circulantes são isolados a partir do sangue de pacientes com cancro sem causar danos celulares. Isolamento de células tumorais é realizada usando uma superfície bimolecular da E-selectina para além de anticorpos contra marcadores epiteliais. Um revestimento de nanotubo especificamente promove a adesão de células cancerosas, resultando em purezas de captura elevadas.

Isolamento rápido de células tumorais viáveis ​​circulantes de amostras de sangue de doentes

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

26.5K visualizações.  Cornell University. Células tumorais circulantes são isolados a partir do sangue de pacientes com cancro sem causar danos celulares. Isolamento de células tumorais é realizada usando uma superfície bimolecular da E-selectina para além de anticorpos contra marcadores epiteliais. Um revestimento de nanotubo especificamente promove a adesão de células cancerosas, resultando em purezas de captura elevadas.

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Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed secondary tumors1,2,3. CTCs are indicators of metastatic disease and their detection in blood samples may be used to diagnose cancer and monitor a patient&prime;s response to therapy. Since CTCs are rare, comprising about one tumor cell among billions of normal blood cells in advanced cancer patients, their detection and enumeration is a difficult task. We exploit the presence of pigment in most melanoma cells to generate photoacoustic, or laser induced ultrasonic waves in a custom flow cytometer for detection of circulating melanoma cells (CMCs)4,5. This process entails separating a whole blood sample using centrifugation and obtaining the white blood cell layer. If present in whole blood, CMCs will separate with the white blood cells due to similar density. These cells are resuspended in phosphate buffered saline (PBS) and introduced into the flowmeter. Rather than a continuous flow of the blood cell suspension, we induced two phase flow in order to capture these cells for further study. In two phase flow, two immiscible liquids in a microfluidic system meet at a junction and form alternating slugs of liquid6,7. PBS suspended white blood cells and air form microliter slugs that are sequentially irradiated with laser light. The addition of a surfactant to the liquid phase allows uniform slug formation and the user can create different sized slugs by altering the flow rates of the two phases. Slugs of air and slugs of PBS with white blood cells contain no light absorbers and hence, do not produce photoacoustic waves. However, slugs of white blood cells that contain even single CMCs absorb laser light and produce high frequency acoustic waves. These slugs that generate photoacoustic waves are sequestered and collected for cytochemical staining for verification of CMCs.

We have developed a flow cytometer using laser induced ultrasound to detect circulating melanoma cells as an early indicator of metastatic disease.

Detecção e isolamento de células de melanoma circulantes usando Fluxometria Fotoacústica

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Bioengenharia

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

Isolamento de celulares lipídicas Gotas: Duas técnicas de purificação Começando a partir de células de levedura e placentas humanas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

Isolamento de células do cólon tumor primário Humanos a partir de tecidos cirúrgicos e cultivando-as Diretamente macias elásticas Substratos para Traction Citometria

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

Isolamento de células-tronco mesenquimais do periósteo Alveolar humano e efeitos da vitamina D na atividade osteogênica do periósteo-derivado de células

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

Ácido hialurônico baseado hidrogel para 3-Dimensional cultura de células de Glioblastoma derivado de paciente

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Patient-Specific Polyvinyl Alcohol Phantom Fabrication with Ultrasound and X-Ray Contrast for Brain Tumor Surgery Planning

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create anatomically accurate head phantoms with realistic brain imaging properties because standard fabrication methods are not optimized to replicate any patient-specific anatomical detail and 3D printing materials are not optimized for imaging properties. In order to test and validate a novel navigation system for use during brain tumor surgery, an anatomically accurate phantom with realistic imaging and mechanical properties was required. Therefore, a phantom was developed using real patient data as input and 3D printing of molds to fabricate a patient-specific head phantom comprising the skull, brain and tumor with both ultrasound and X-ray contrast. The phantom also had mechanical properties that allowed the phantom tissue to be manipulated in a similar manner to how human brain tissue is handled during surgery. The phantom was successfully tested during a surgical simulation in a virtual operating room.
The phantom fabrication method uses commercially available materials and is easy to reproduce. The 3D printing files can be readily shared, and the technique can be adapted to encompass many different types of tumor.

This protocol describes the fabrication of a patient specific skull, brain and tumor phantom. It uses 3D printing to create molds, and polyvinyl alcohol (PVA-c) is used as the tissue mimicking material.

Fabricação fantasma do álcool polivinyl específico do paciente com ultrassom e contraste de raios-X para planejamento de cirurgia de tumor cerebral

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

Tecido conjuntivo de engenharia humana derivada do fibroblasto para aplicações de triagem

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, inflammation, and homeostasis. The endothelium also plays an important role in pathophysiologies such as atherosclerosis, hypertension, and diabetes. Endothelial cells form the inner lining of blood and lymphatic vessels and display heterogeneity in structure and function. Various groups have evaluated the functionality of endothelial cells derived from human peripheral blood with a focus on endothelial progenitor cells derived from hematopoietic stem cells or mature blood outgrowth endothelial cells (or endothelial colony-forming cells). These cells provide an autologous resource for therapeutics and disease modeling. Xenogeneic cells may provide an alternative source of therapeutics due to their availability and homogeneity achieved by using genetically similar animals raised in similar conditions. Hence, a robust protocol for the isolation and expansion of highly proliferative blood outgrowth endothelial cells from porcine peripheral blood has been presented. These cells can be used for numerous applications such as cardiovascular tissue engineering, cell therapy, disease modeling, drug screening, studying endothelial cell biology, and in vitro co-cultures to investigate inflammatory and coagulation responses in xenotransplantation.

Isolamento rápido de células tumorais viáveis ​​circulantes de amostras de sangue de doentes

Isolamento rápido de células tumorais viáveis circulantes de amostras de sangue de doentes