O protocolo fornece células endoteliais de crescimento sanguíneo altamente proliferativo que podem ser usadas para várias investigações de engenharia de tecidos, terapia celular e modelagem de doenças. Esta técnica produz consistentemente muitas células a partir de uma única coleta de sangue. Para que essa técnica seja bem-sucedida, é crucial colocar rapidamente as células no meio de cultura e no ambiente da incubadora o mais rápido possível.
Primeiro, diluir a solução de heparina para 100 unidades por mililitro em soro fisiológico estéril. Adicione três a quatro mililitros de solução de heparina a cada um dos dois tubos cônicos de 50 mililitros e duas seringas de 60 mililitros. Em seguida, retire 1.000 unidades por mililitro de solução de heparina não diluída em um tubo de extensão.
Conecte uma agulha de calibre 19 a uma extremidade do tubo de extensão preenchido com heparina e uma seringa de 60 mililitros contendo heparina à outra extremidade do tubo de extensão. Em seguida, limpe a área da virilha femoral de um porco anestesiado com uma solução de esfoliação de Betadine. Puncione a veia ou artéria femoral com uma agulha de calibre 19 e, de um a dois mililitros por segundo, retire lentamente 50 mililitros de sangue para a seringa.
Deixando a agulha no lugar, torça imediatamente o tubo de extensão e desconecte a seringa de 60 mililitros. Transfira lentamente o sangue para um tubo cônico de 50 mililitros contendo heparina. Tampe bem o tubo cônico, inverta suavemente o tubo algumas vezes para misturar e coloque-o no gelo.
Conecte a seringa de 60 mililitros contendo heparina restante ao tubo de extensão. Destorça o tubo de extensão e retire lentamente mais 50 mililitros de sangue para a seringa. Retire imediatamente a agulha da artéria ou veia e retire lentamente o sangue restante do tubo de extensão para a seringa.
Desconecte a seringa de 60 mililitros do tubo de extensão e transfira lentamente o sangue para o tubo cônico de 50 mililitros contendo heparina restante. Tampe bem o tubo cônico de 50 mililitros, inverta suavemente algumas vezes para misturar e coloque no gelo. Aplicar hemostasia de pressão na região da virilha femoral do porco.
Diluir o sangue um a um com PBS em quatro tubos cônicos de 50 mililitros. Adicione 25 mililitros de solução de gradiente de densidade pronta para uso à temperatura ambiente a oito tubos cônicos de 50 mililitros. Pipetar lentamente 25 mililitros de solução salina sanguínea dentro de cada tubo cônico de 50 mililitros contendo solução de gradiente de densidade, segurando o tubo em um ângulo acentuado com a ponta da pipeta.
Centrifugar os tubos por 30 minutos a 560 g e temperatura ambiente. Recolher cuidadosamente o buffy coat, que é a camada turva de células mononucleares acima da solução de gradiente de densidade e abaixo do plasma transparente, de cada tubo com uma pipeta fina e distribuí-lo uniformemente em dois novos tubos cônicos de 50 mililitros. Eliminar a solução de gradiente de densidade que contém tubos.
Para revestir uma placa de seis poços com fibronectina, faça uma solução estoque de fibronectina plasmática humana, diluindo-a a um miligrama por mililitro em água estéril. Faça 3,6 mililitros de uma solução funcional de fibronectina diluindo 600 microlitros de solução estoque de fibronectina em três mililitros de PBS. Transfira 600 microlitros da solução de trabalho de fibronectina para cada poço de uma placa de seis poços e agite suavemente até revestir uniformemente.
E aspirar suavemente a solução para fora de cada poço. Para lavar as células mononucleares enquanto espera a fibronectina revestir, completar os tubos com até 45 mililitros de PBS, centrifugar por cinco minutos a 560 X g e quatro graus Celsius com baixa quebra. Aspirar o sobrenadante de ambos os tubos.
Ressuspenda cada pellet de célula em 25 mililitros de PBS. Ressuspenda cada pellet de célula em cinco mililitros de PBS e adicione 15 mililitros de solução de cloreto de amônio a 0,8% a cada tubo. Lave as células como antes, adicionando PBS.
Aspirar o sobrenadante de ambos os tubos. Ressuspenda cada pellet de célula em 25 mililitros de PBS. Ressuspender cada pastilha celular em seis mililitros de meio de cultura EGM-2 suplementado com SFB a 10% e solução antibiótico-antimicótica 1X.
Transfira suavemente dois mililitros da suspensão celular para cada poço da placa de seis poços revestida com fibronectina e agite suavemente até revestir uniformemente. 24 horas após a semeadura das células, adicione suavemente um mililitro de meio de cultura fresco a cada poço. No dia seguinte, aspirar suavemente 1,5 mililitros de meio de cultura de cada poço e substituí-lo por 1,5 mililitros de meio de cultura fresco.
Nos próximos cinco dias, troque suavemente o meio de cultura com dois mililitros de meio de cultura fresco por poço. Visualize regularmente as culturas celulares sob microscopia de luz objetiva 4X de baixa potência. A morfologia das células cultivadas foi observada desde o início do cultivo até a observação de colônias BOEC.
Uma população menor de células aderentes começou a se fixar às placas de cultura e crescer, enquanto as células não aderentes foram removidas com mudanças no meio de cultura. As colônias apareceram pela primeira vez no sexto dia como uma coleção de células endoteliais que proliferavam radialmente para fora de um ponto central. À medida que a cultura progrediu, as colônias celulares tornaram-se mais densas e exibiram uma morfologia de paralelepípedos semelhante às células endoteliais maduras.
Microscopia bidimensional de contraste de fase foi utilizada para obter imagens da formação de tubos em meio sem soro e meio de crescimento completo. As células em ambas as condições de meios sofreram diferenciação morfológica e rapidamente se organizaram em extensas redes de estruturas capilares semelhantes a tubos. As BOECs foram ainda caracterizadas pela expressão do marcador de células endoteliais maduras CD31 ou da molécula de adesão de células endoteliais plaquetárias um.
BOECs mostraram expressão uniforme de CD31. Além disso, a análise por citometria de fluxo de BOECs com anticorpo CD14 AF 700 em comparação com o controle positivo confirmou a ausência de CPEs, uma vez que a célula corou negativamente para o marcador de monócitos CD14 em comparação com o grupo controle positivo de CMSPs. Coloração CD14 positiva mostrada em azul e células não coradas mostradas em vermelho.
Durante a coleta de sangue, é essencial coletar o máximo possível da camada de pelagem bufante, coletando o mínimo possível das camadas adjacentes. Essa técnica permitiu que os pesquisadores estudassem novas estratégias para endotelizar dispositivos cardiovasculares implantáveis usando um modelo de porco com células endoteliais de crescimento sanguíneo autólogo.
