Este estudo foi financiado por subvenções concedidas aos RLM do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália (concessão # 606658).

1. Cultura de Células (3-7 dias antes da Assembleia-BBB) 1.1. Células Cérebro humano microvascular endoteliais primárias (BEC) CEBs foram obtidos comercialmente. As células foram produzidas por dissociação de dispase de tecido do córtex cerebral humano normal e forneceu congeladas a passagem 3 (&lt;12 duplicações da população). <ol><li> Substrato: vasos Brasão de cultura de tecidos com &quot;Fator de Fixação&quot; de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Manutenção celular: Manter BECs em meio completo contendo soro. Para a experimentação, a cultura CEBs em meio isento de soro completo. Manter as células numa atmosfera húmida de 5% de CO 2, 21% de O 2 incubadora a 37 ° C Observação: Como uma alternativa aos reagentes especializados, 0,1% (w / v), soluções de gelatina pode servir como um reagente de revestimento ao mesmo tempo DMEM/F-12 suplementado com HEPES 15 mM, 10% (v / v) de soro fetal de vitelo (FCS), 2 mM de L-glutamina, 50 ug/ Ml de gentamicina, 20 ug / ml de heparina e 20 ug / ml de suplemento de crescimento de células endoteliais pode ser utilizado para a manutenção BEC. </li><li> Sub-cultura de experimentação: CEBs confluentes divididos na proporção de 1:03 - 01:06, dependendo do tempo pretendido para a utilização seguinte (3-7 dias). Altere o meio de manutenção a cada 3 dias. Use BECs até 15 passagens. </li></ol> 1.2. SVG Human Fetal astroglial-line celular SVG células gliais fetais humanas 22 foram originalmente derivadas de culturas primárias de cérebro fetal humano transformada com o vírus símio 40 deficiente em replicação. <ol><li> Manutenção: células Cultura SVG em meio mínimo essencial com solução salina equilibrada de Earle suplementado com 20% (v / v) FCS (mesma percentagem de soro utilizado para manter as células primárias progenitoras 22), 2 mM de L-glutamina, 50 U / ml de penicilina e 50 ug / ml de estreptomicina. Manter as células numa atmosfera húmida de 5% de CO 2, 21% de O2 </sub&gt; incubadora a 37 ° C. </li><li> Sub-cultura de experimentação: SVGs confluentes Dividir a uma proporção de 1:5 a 1:10, dependendo do tempo pretendido para a utilização seguinte (3-7 dias). Remoção de tripsina não é necessário, devido ao alto teor de soro no meio. Troca da mídia a cada 3 dias. Use SVGs até 20 passagens. </li></ol> 2. Montagem e Coculturing da In vitro BBB Modelo Humano (Dia 0) Comentário: O ser humano em contato modelo BBB vitro é preparado de acordo com protocolos publicados 13,23, com modificações. 2.1. Revestimento de inserções <ol><li> Coloque inserções de cultura de tecidos (6,5 mm de diâmetro, com poliéster membrana porosa, de 3 um de tamanho dos poros) nos poços da placa de 24 poços fornecidas. Revestir a superfície luminal das inserções <s> </s> durante a noite numa incubadora humidificada a 37 ° C com colagénio I de rato (20 g / cm 2, 50 ul de 132 ug/ Ml de colagénio I, em 0,02% de ácido acético em água Milli-Q (MQH 2 O)). Lavar as inserções uma vez (tanto do lado abluminal e luminal) com MQH 2 O para remover o ácido residual. Nota: A membrana basal dos capilares do cérebro não contém colágeno I, mas principalmente lamininas, isoformas de colágeno tipo IV, nidogens e proteoglicanos de heparan sulfato 9. Por este motivo, alguns pesquisadores utilizam agentes de revestimento como o colágeno IV, fibronectina 13, ou Matrigel (BD Biosciences) 16 para uma modelagem BBB mais autêntica. </li></ol> 2.2. SVGs Sementeira na parte de baixo (abluminal) superfície da membrana <ol><li> Inverta a inserção e ajustar suavemente em torno da borda da membrana porosa a uma curta peça de tubagem de silicone elástico (&quot;tubo externo&quot;, 8 mm de diâmetro interno ~ 10 mm de comprimento, 1,6 mm de parede), criando essencialmente um novo bem acima da superfície abluminal (Figura 2A). </li><li> A parte inferior da inserção needs para ser selado para evitar vazamento de mídia. Em primeiro lugar, preparar um bujão (Figura 2A e 2B), feita de um tubo de silicone (denominado &quot;tubo interno&quot;; ~ 8 mm de comprimento, 3,2 mm de diâmetro interno, parede de 1,6 milímetros; Figura 2B), selado numa das extremidades, com um cone de vedação de plástico (~ 3 mm de comprimento; preparado pelo corte da parte inferior de uma reacção em cadeia com 0,2 ml de polimerase (PCR) do tubo e a figura 2B). Este cone não só sela o lúmen dos tubos internos, mas também aumenta a sua aresta para encaixe apertado dentro do inserto. Em seguida, utilizando um fórceps estéril, inserir a ficha de silicone na cavidade luminal e avançar até que ele chegue até a ~ 1-2 mm a partir da membrana (Figura 2A). </li><li> Em seguida, as sementes 4 x 10 4 células SVG em 200 mL SVG meio de manutenção (SEcção 1.2.2 acima) directamente para o silicone bem acima da superfície da membrana abluminal (Figura 2A). Permitir SVGs a aderir por pelo menos 4 horas na incubadora. Nota: Para manter a esterilidade transportar as inserções montadas entre duas placas de 6 poços (uma placa invertida sobre a outra; Figura 2C), para minimizar a exposição ao ar não filtrado, durante o procedimento. Os tubos de silicone e os tampões são lavadas em etanol e autoclavado para uso posterior. Nota: Utilize plugs (seção 2.2.2) apenas para pastilhas com poros da membrana com tamanho superior a 1 mícron. As membranas com poros de diâmetro de 1 um ≤ raramente vazar e requerem apenas a montagem do tubo de silicone externa (secção 2.2.1). Além disso, alguns outros do que o colágeno agentes de revestimento I (ver nota a seção 2.1) pode impedir leakiness mesmo através de 3 mM poros. Determinar esta empiricamente. </li><li> A fim de monitorar o estado adesão de seus astrócitos, semear em paralelo emde 96 cavidades de um volume idêntico padrão da célula-suspensão dos astrócitos. Este poço tem a mesma área de superfície que a inserção 6,5 milímetros (0,33 cm 2) e permite a fácil visualização das células por microscopia de contraste de fase do que a membrana de inserção. Quando se verificar a adesão suficiente dos astrócitos no controlo de 96 poços, os astrócitos foram aderidas adequadamente também a inserção da membrana. </li><li> Quando astrócitos têm suficientemente respeitado no controle de 96 poços, transferir os conjuntos de inserção para a capa de cultura de tecidos (ver nota acima) e retire cuidadosamente o tubo de silicone externa e plugues. Retornar inserções para a orientação normal (ou seja, na vertical) nas cavidades fornecidas contendo 800 ul / poço de meio de manutenção BEC (secção 1.1.2, supra). </li></ol> 2.3. Sementeira do BEC para a Câmara Luminal acima dos astrócitos Semente 2x10 4 BECs em 200 mL até a superfície luminal da revestido de colágeno e voltar a insegurançarts na incubadora. 2.4. Coculturing Co-cultura das inserções SVG / BEC-semeados durante 3 dias em meio BEC sem mudança mídia antes de experimentação. 3. Experimentação com o modelo de certificação Humano (Dia 3) <ol><li> Para estimular as células in vitro de BBB primeira lavagem, substituindo os meios de comunicação abluminais e luminais com 600 mL e 100 mL de meio BECs sem soro, respectivamente. </li><li> Aspirar o meio do lúmen de novo e substituir com 100 ul de meio isento de soro, com agentes estimulantes. Nota: Se a estimulação da câmara abluminal é necessária (para ativar o in vitro a certificação do compartimento astrocitária), aspirar o meio abluminal e substituir com 600 ul de meio sem soro com agentes estimulantes. </li><li> Teste cada grupo experimental em triplicado (daí, se a estimulação luminal é realizada, o que requer 3 x 100 mL, recomendamos diluir o re<html> Os agentes para as suas concentrações finais em 350 ul de meio isento de soro em cada grupo para minimizar erros de pipetagem entre poços). </li><li> Realizar paracelular padrão e / ou ensaios de permeabilidade transcelular dos marcadores marcados 16,24 (para o último usamos isotiocianato de fluoresceína (ITCF) conjugadas com albumina) e / ou medição de TEER 13,16,25 como descrito anteriormente. </li></ol> Para ter em conta as flutuações na permeabilidade da linha de base entre os experimentos, analisar alterações na permeabilidade em relação a uma inserção de revestimento sem células (que serve como uma referência para a permeabilidade máxima) e para o grupo tratado com o veículo utilizando a fórmula: permeabilidade (% de máximo) = ( valor de permeabilidade de inserção experimental - valor médio permeabilidade do grupo do veículo) / (valor de permeabilidade do inserto em branco - valor médio permeabilidade do grupo do veículo) X 100. 4. A visualização de células em membranas porosas nt &quot;&gt; Comentário: células não coradas em membranas de inserção são difíceis de observar por contraste de fase ou de contraste de interferência diferencial microscopia (DIC) desde a membrana é bastante opaca e interfere com a transmissão de luz para lidar com esta questão, desenvolvemos vários procedimentos de coloração de células em. pastilhas, que melhoram grandemente a aparência de células sobre a membrana. Geralmente, manchar as membranas de inserção enquanto ainda ligados à inserção, nas cavidades. As membranas devem ser removidos apenas no fim do procedimento de coloração para fins de montagem. 4.1. Coloração Hematoxilina <ol><li> Fix inserções com gelado a 4% (w / v) de paraformaldeído (PFA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS; NaCl 130 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 10 mM de NaH 2 PO 4, pH 7,2) durante 20 min. Lavar uma vez com PBS. </li><li> Mergulhe a inserção em solução de hematoxilina 0,1% de Mayer por 2 min. </li><li> Delicadamente, lave a inserção com água da torneira (submergindo as insert em um copo contendo água da torneira e cuidado pipetando o excesso de água). Transferir a solução para inserção de Scott água de torneira (2 g / l de NaHCO3, 20 g / L de MgSO 4) para ~ 20 segundos até que a cor azul desejada desenvolve. Lave a inserção de novo com água da torneira (seção 4.1.3). Uma mancha de eosina opcional pode ser introduzida aqui por imersão em solução a inserção eosina 1% durante 10 segundos seguido por uma lavagem com água da torneira. </li><li> Ar seco a membrana de inserção. Usando um bisturi (corte ao redor da borda da membrana) remover a membrana e montá-lo em uma lâmina de vidro para imagens de campo claro Nota: Se o di-N-butylphthalateinxylene (DPX) o meio de montagem é utilizada a inserção lavar com etanol a 100% seguido de xileno antes da remoção e a montagem da membrana. </li></ol> 4.2. Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) <ol><li> Fix inserções com gelado a 4% (w / v) de PFA em PBS durante 20 min. Lavar três vezes em PBS. </li><li> Pós-fixar as membranas durante 30 min em 1% (w / v) De tetróxido de ósmio em 2 O. MQH </li><li> Lavar as inserções em água (secção 4.1.3) e desidratar em um gradiente crescente de etanol (50%, 70%, 90% durante 5 min cada, em seguida 3x com etanol a 100% durante 10 min cada intervalo). </li><li> Trate inserções desidratadas com uma mistura de hexametildisilazano (HMDS): etanol (1:2, em seguida, 02:01 por 5 min). </li><li> Trate inserções com 100% de HMDS para 5 min, ar seco e armazenar em condições dessecadas. </li><li> Retirar a membrana utilizando um bisturi (corte em torno do bordo da membrana). Examine as membranas por microscopia eletrônica de varredura. </li></ol> 4.3. Imunofluorescência <ol><li> Fix inserções com gelado a 4% (w / v) de PFA em PBS durante 20 minutos, lavar uma vez em solução salina tamponada com Tris (TBS, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, NaCl 154 mM, 0,22 um filtrado). </li><li> Realizar imunocoloração das células na membrana de inserir tal como previamente descrito 26. </li><li> Retirar a membrana utilizando um bisturi (corte em torno do bordo da membrana) e montá-lo em agslides moça com fluorescência meio de montagem. Examinar membrana por microscopia fluorescente. </li></ol>

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Invest. 112, 1533-1540 (2003).</li><li>Abu Fanne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+permeability+and+tPA-mediated+neurotoxicity.">Blood-brain barrier permeability and tPA-mediated neurotoxicity.</a> Neuropharmacology. 58, 972-980 (1016).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+receptor-mediated+induction+of+matrix+metalloproteinase+by+tissue+plasminogen+activator.">Lipoprotein receptor-mediated induction of matrix metalloproteinase by tissue plasminogen activator.</a> Nat. Med. 9, 1313-1317 (2003).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+hemorrhagic+transformation+after+tissue+plasminogen+activator+reperfusion+therapy+for+ischemic+stroke.">Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke.</a> Stroke. 35, 2726-2730 (2004).</li><li>Donnan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+better+use+of+thrombolytic+therapy+in+acute+ischemic+stroke.">How to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke.</a> Nat. Rev. Neurol. 7, 400-409 (2011).</li><li>Acheampong, P., Ford, G. 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Psychiatry. 79, 1093-1099 (2008).</li><li>Garber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+treatment--light+at+the+end+of+the+tunnel.">Stroke treatment--light at the end of the tunnel.</a> Nat. Biotechnol. 25, 838-840 (2007).</li><li>Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+Stroke+in+the+2010s.">Reversing Stroke in the 2010s.</a> Stroke. 40, 3156-3158 (2009).</li><li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).</li><li>Song, L., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+that+maintain+expression+and+cytoskeletal+association+of+tight+junction-associated+proteins.">Culture of murine brain microvascular endothelial cells that maintain expression and cytoskeletal association of tight junction-associated proteins.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 313-320 (2003).</li><li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation.">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).</li></ol>

Autores têm nada a revelar.

A investigação médica em patologias do cérebro sofre muita dificuldade translacional. Na área de acidente vascular cerebral isquêmico agudo, por exemplo, muitas drogas que mostrou uma grande promessa em modelos animais falharam na clínica 38,39. As razões para estes resultados decepcionantes são diversas e incluem infidelidade dos sistemas de testes pré-clínicos com o cenário traçado humana e sobreavaliação dos resultados obtidos a partir de estudos com animais 21. Uma estratégia pa...

A certificação é uma interface especializada entre a circulação de sangue periférico e o sistema nervoso central, fundamentalmente responsável para a manutenção da homeostasia do cérebro. Ele compreende células distintas cerebrais microvasculares endoteliais (BEC), que são funcionalmente influenciada por alguns componentes celulares e acelulares (abaixo) para formar uma passagem apertada e dinâmico para o cérebro. Sob condições fisiológicas, a certificação restringe a passagem de células do sangue, componentes do plasma e de substâncias nocivas, todos potencialmente neurotóxicos, no cérebro. Em paralelo, a certificação troca selectivamente iões e nutrientes essenciais (glucose e aminoácidos) e produtos residuais do metabolismo entre o cérebro e a circulação de manter com precisão o ambiente cerebral 1,2. Em anos recentes torna-se evidente que a falha da certificação ocorre numa variedade de patologias cerebrais crónicas, tais como as doenças neurodegenerativas ou inflamatórias relacionadas com (por exemplo, doença de Alzheimer e multiple esclerose, respectivamente) 3, bem como em condições agudas, como acidente vascular cerebral isquémico 4. As propriedades únicas BBB de células endoteliais cerebrais (CEBs) são largamente induzida pelo ambiente cerebral 5, e em particular por astrócitos 6,7. Existe um consenso crescente de que outros tipos de células, tais como pericitos 8, neurónios e microglia 1,3, bem como a membrana de base 9, suportar BEC e formam em conjunto uma unidade funcional denominada &quot;unidade neurovascular&quot; (NVU) que simultaneamente casais neuronal demandas metabólicas aos seus capilares que abastecem 10. O envolvimento do BBB em situações patológicas subjaz inúmeras tentativas de desenvolver em modelos in vitro de BBB para ajudar na investigação relacionada com a certificação 11,12. Estes modelos pretendem imitar o mais próximo possível in vivo de BBB características de acordo com o princípio NVU. In vitro </em&gt; modelos de BBB geralmente dependem de uma monocamada de BECs tight-formadoras de junção (principalmente de bovinos 13, humano 14, 15 rato, rato 16 e suínos 17,18 origens), cultivadas em uma membrana porosa, juntamente com astrócitos apoio (extensivamente revistos por Deli et al., 2005 11). Os astrócitos podem ser cultivadas em condições de não-contacto na parte inferior de uma cultura de tecidos bem, separado BEC (cultivadas na superfície superior da membrana) pelo meio de cultura ainda comunicar com CEBs através factores solúveis 16. Em modelos mais avançados que melhor se assemelham à estrutura anatómica do BBB in vivo, os astrócitos são mantidas em condições de contacto e cultivadas directamente no lado oposto da membrana em estreita proximidade com CEBs 13,15,17 (Figura 1). Esta configuração permite o contato físico entre BEC e astrócitos, criado quando o projeto astrócitosseus processos, através da membrana porosa. É importante ressaltar que para um verdadeiro contato para ocorrer os poros devem ser ≥ 1 Hm de diâmetro, desde astrocitárias finais pés não podem passar por poros menores (ou seja, 0,4 mM) 14,15. Notavelmente, os sistemas de contato de BBB são demonstradas em alguns estudos a ser superiores aos seus equivalentes não-contato em relação à sua resistência elétrica trans-endotelial (TEER) e valores de permeabilidade endoteliais de vários traçadores 13,17,18. Uma dimensão adicional de fluxo de meio foram adicionadas recentemente em um certo número de modelos in vitro de BBB para aplicar forças de cisalhamento ao endotélio para a simulação mais próxima da vasculatura cerebral 12,19. Um dos obstáculos técnicos que superada quando a gerar um modelo de contacto certificação é a semeadura de astrócitos contra a gravidade na superfície abluminal da membrana porosa. 13,20 protocolos anteriores, em que os astrócitos foram simplesmente semeadas numa gota de meios no topo de uma eminserção convertida, permitiu vezes só curto semeadura (isto é, 10 min 13 ou 2 horas 20) que foram encontrados em nossas mãos para ser insuficiente para a fixação das células adequado. Usando este método básico, um período mais longo apego astrocyte requer monitoramento constante das inserções de abertura freqüente da incubadora (causando flutuações de temperatura, pH e umidade) e também é propenso a semeadura de células irregulares devido a fugas de meios através dos poros, especialmente se poros maiores do que 1 mícron são empregues. Aqui, nós descrevemos um protocolo geral para a elaboração de um modelo de certificação contato. Nosso procedimento inclui um método alternativo para a célula-semeadura em inserções invertidos, que trata das limitações acima mencionadas. O método permite a adesão sem perturbações dos astrócitos na superfície abluminal membrana, num incubador equilibrado, por um período de tempo prolongado. Como resultado, uma sementeira uniformes de astrócitos é alcançada o que aumenta a qualidade de barreirae minimiza as variações de permeabilidade basais entre inserções. Como o uso de células humanas é importante para a investigação humana relevante 21, que adicionalmente demonstrar neste artigo a utilização específica de uma nova combinação de BECs humanos primários e imortalizado astrócitos humanos para a criação de um modelo de certificação contato humano com uma capacidade de rastreio de alto rendimento . Desde a visualização de células em membranas porosas podem ser difíceis, nós também técnicas de coloração de detalhes que podem ajudar na determinação da confluência e morfologia das células nas membranas porosas. Finalmente, exemplificam como nosso modelo de certificação humano pode ser utilizado para examinar o efeito do tipo de ativador do plasminogênio tecidual (t-PA) - uma enzima coágulo rebentando que serve como uma opção de tratamento único para o AVC isquêmico agudo - no BBB.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Attachment Factor</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-210</td>
			<td style="width:243px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Complete medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC JetFuel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Complete serum-free medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">SF-4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC RocketFue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DMEM/F-12 with 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Endothelial cells growth supplement (from bovine origin)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">E2759-15MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">External silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A080.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Foetal calf serum</td>
			<td style="width:193px;">Lonza</td>
			<td style="width:171px;">14-501F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Gentamycin sulfate</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:193px;">Pfizer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:243px;">1,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">H4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Human brain microvascular endothelial cells</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Internal silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A032.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Mayer&#8217;s hematoxylin solution</td>
			<td style="width:193px;">Amber Scientific</td>
			<td style="width:171px;">MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Minimum essential medium with Earle&#8217;s balanced salt solution</td>
			<td style="width:193px;">HyClone Laboratories</td>
			<td style="width:171px;">SH30244.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rat collagen I</td>
			<td style="width:193px;">Trevigen</td>
			<td style="width:171px;">3440-100-01</td>
			<td style="width:243px;">Cultrex brand</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Tissue culture inserts</td>
			<td style="width:193px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:171px;">3472</td>
			<td style="width:243px;">Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 &#181;m pore-size</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved method for the preparation of a human cell-based, contact model of the blood-brain barrier

A barreira sangue-cérebro (BBB) ​​compreende impermeáveis ​​mas adaptáveis ​​capilares do cérebro que controlam o ambiente fortemente cérebro. A falha da certificação tem sido implicada na etiologia de várias patologias cerebrais, criando uma necessidade de desenvolvimento de humano em modelos in vitro de BBB para ajudar na investigação clinicamente relevante. Entre os numerosos modelos de BBB, até agora descritos, uma estático (sem fluxo), contactar modelo certificação, em que os astrócitos e as células endoteliais do cérebro (CEBs) são co-cultivadas nos lados opostos de uma membrana porosa, emergiu como um sistema ainda autêntica simplificado para simular o BBB com capacidade de rastreio de alto rendimento. No entanto, a geração de tal modelo apresenta alguns desafios técnicos. Aqui, descrevemos um protocolo para a elaboração de um modelo de certificação contato humano, utilizando uma nova combinação de BECs humanos primários e astrócitos humanos imortalizados. Especificamente, detalhamos um método inovador para a célula-semeadura em inserções invertidas, bem como especificar insert técnicas de coloração e exemplificar como usamos o nosso modelo de investigação relacionada com a certificação.

A fim de estabelecer um ser humano, o modelo de contato BBB tínhamos de cultivar SVGs e BEC em membranas porosas com um 3 mM poros de tamanho, mostrado para permitir a passagem de astrócitos finais pés para o contato com as células endoteliais 14,15,27,28. Uma representação esquemática do modelo de contacto completa está ilustrada na figura 1 (figura da esquerda). O principal desafio técnico apresentado por um sistema de contacto é a necessidade de semear astrócitos contra a gravid...

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Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Estabelecimento de modelos humanos da barreira sangue-cérebro (BBB) ​​pode beneficiar de pesquisa em condições cerebrais associadas com insuficiência certificação. Descrevemos aqui uma técnica melhorada para a preparação de um modelo de certificação de contacto, o que permite coculturing de astrócitos e células endoteliais cerebrais sobre os lados opostos de uma membrana porosa.

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

improved-method-for-preparation-human-cell-based-contact-model-blood

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.2K visualizações.  Monash University.  Estabelecimento de modelos humanos da barreira sangue-cérebro (BBB) ​​pode beneficiar de pesquisa em condições cerebrais associadas com insuficiência certificação. Descrevemos aqui uma técnica melhorada para a preparação de um modelo de certificação de contacto, o que permite coculturing de astrócitos e células endoteliais cerebrais sobre os lados opostos de uma membrana porosa. 

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Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

Método de extrusão constante pressão controlada para a Preparação de vesículas lipídicas nanométricas

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Bioengenharia

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

Um método aperfeiçoado para a preparação de colágeno tipo I Da Pele

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

Desenvolvimento de um modelo organotípicas multicelular tridimensional da Mucosa Intestinal Humano cultivadas sob microgravidade

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

In Vitro permeação de Ferritinas FITC-carregados através de um Rat barreira sangue-cérebro: um modelo para estudar a Entrega de Nanoformulated Moléculas

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of non-essential ions and toxic substances. Tight junctions (TJ) effectively seal the paracellular space in the monolayers resulting in an intact barrier. This study describes a LY-based fluorescence assay that can be used to determine its apparent permeability coefficient (Papp) and in turn can be used to determine the kinetics of the formation of confluent monolayers and the resulting tight junction barrier integrity in hCMEC/D3 monolayers. We further demonstrate an additional utility of this assay to determine TJ functional integrity in transfected cells. Our data from the LY Papp assay shows that the hCMEC/D3 cells seeded in a transwell setup effectively limit LY paracellular transport 7 days-post culture. As an additional utility of the presented assay, we also demonstrate that the DNA nanoparticle transfection does not alter LY paracellular transport in hCMEC/D3 monolayers.

We present a fluorescence assay to demonstrate that Lucifer Yellow (LY) is a robust marker to determine the apparent paracellular permeability of hCMEC/D3 cell monolayers, an in vitro model of the human blood-brain barrier. We used this assay to determine the kinetics of a confluent monolayer formation in cultured hCMEC/D3 cells.

Amarelo de Lucifer-um marcador Paracellular robusto da permeabilidade em um modelo da pilha do sangue humano-barreira do cérebro

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Quantificação simultânea de kynureninas selecionadas analisadas por espectrometria de cromatografia líquida-massa em média coletada de culturas celulares cancerosas

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ligation is a challenging procedure and has a high mortality rate due to its nature. We developed a method to consistently transplant bioprinted patches of cells and hydrogels onto the epicardium of an infarcted mouse heart to test their regenerative properties in a robust and feasible way. First, a deeply anesthetized mouse is carefully intubated and ventilated. Following left lateral thoracotomy (surgical opening of the chest), the exposed LAD is permanently ligated and the bioprinted patch transplanted onto the epicardium. The mouse quickly recovers from the procedure after chest closure. The advantages of this robust and quick approach include a predicted 28-day mortality rate of up to 30% (lower than the 44% reported by other studies using a similar model of permanent LAD ligation in mice). Moreover, the approach described in this protocol is versatile and could be adapted to test bioprinted patches using different cell types or hydrogels where high numbers of animals are needed to optimally power studies. Overall, we present this as an advantageous approach which may change preclinical testing in future studies for the field of cardiac regeneration and tissue engineering.

This protocol aims to transplant a 3D bioprinted patch onto the epicardium of infarcted mice modeling heart failure. It includes details regarding anesthesia, the surgical chest opening, permanent ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery and application of a bioprinted patch onto the infarcted area of the heart.

Transplante de um Patch Bioimpresso 3D em um modelo murino de infarto do miocárdio

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...

Um novo método de injeção lenta minimamente invasivo para reduzir a lesão tecidual

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient amount of suspension solution to allow the cells to enter the tissue. The volume of the suspension solution affects the tissue, and this can cause major invasive injury as a result of the cell injection. This paper reports on a novel cell injection method, called slow injection, that aims to avoid this injury. However, pushing out the cells from the needle tip requires a sufficiently high injection speed according to Newton's law of shear force. To solve the above contradiction, a non-Newtonian fluid, such as gelatin solution, was used as the cell suspension solution in this work. Gelatins solution have temperature sensitivity, as their form changes from gel to sol at approximately 20 &#176;C. Therefore, to maintain the cell suspension solution in the gel form, the syringe was kept cooled in this protocol; however, once the solution was injected into the body, the body temperature converted it to a sol. The interstitial tissue fluid flow can absorb excess solution. In this work, the slow injection technique allowed cardiomyocyte balls to enter the host myocardium and engraft without surrounding fibrosis. This study employed a slow injection method to inject purified and ball-formed neonatal rat cardiomyocytes into a remote area of myocardial infarction in the adult rat heart. At 2 months following the injection, the hearts of the transplanted groups showed significantly improved contractile function. Furthermore, histological analyses of the slow-injected hearts revealed seamless connections between the host and graft cardiomyocytes via intercalated disks containing gap junction connections. This method could contribute to next-generation cell therapies, particularly in cardiac regenerative medicine.

Autor em destaque: um novo método de injeção de células com invasão mínima  

This method eliminates any major invasion during cell injections caused by the cell suspension solution.

Um novo método de injeção de células com invasão mínima

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient ...