Este trabalho foi financiado pela Sociedade Max Planck.

1. Preparação de Matrigel revestidos Pratos e Mídia <ol><li> Preparação de Matrigel revestido Matrigel placas foi encontrado para ser um substrato preferido para a ligação de diferenciação EBs e também promove o crescimento eficiente dos neurónios a partir destes 10. <ol><li> Ml degelo 10 de Matrigel durante a noite em gelo. </li><li> No dia seguinte, diluir a Matrigel gelatinosa com dois volumes de gelado DMEM/F-12 e preparar alíquotas de 1 ml em 15 ml previamente arrefecido de tubos cónicos que podem ser armazenados congelados a -20 ° C. </li><li> Decidir sobre um formato de placa para a diferenciação neuronal. Por exemplo, como ponto de partida, recomendamos realizar uma rodada inicial de diferenciação em um formato de 12 poços. Pré-cool quatro placas de 12 poços a 4 ° C. Dissolver uma alíquota de Matrigel congelada através da adição de 9 ml de pré-resfriada DMEM/F-12 seguido por pipetagem para cima e para baixo até que todo o pré-diluído Matrigel foi descongelado e dissolvido. </li><li> Depois, Transferir o conteúdo para um tubo de 50 ml novo, contendo 15 ml de DMEM/F-12 em gelo (Matrigel diluição final: 1:75). Em seguida, adicionar 0,5 mL de Matrigel diluído a cada poço das pré-arrefecidos placas de 12 poços. Enrole placas com Parafilm e deixe descansar em temperatura ambiente durante a noite. </li><li> No dia seguinte, placas de transferir a 4 ° C. Placas revestidas podem ser armazenadas durante várias semanas antes de usar. </li></ol></li><li> Mídia </li></ol> EB meio de formação (~ 15 ml necessário para realizar a diferenciação de uma placa de 96 cavidades - ver Quadro 1 e esquema da Figura 2): DMEM/F-12 com 0,4% (PVA) 1x N2 1x B27 0,05% de BSA 20 ng / ml FGF2 10 uM Y-27632 1x PenStrepGln Meio de diferenciação (~ 30 ml necessário para realizar a diferenciação de uma placa de 96 poços, seguindo-se a formação de um neurónio Matrigel revestido placa de 12 poços, ver Quadro 1): DMEM/F-12 1x N2 <br/&gt; 1x B27 0,05% de BSA 0,5 uM PD0325901 15 SB431542 fiM 0,5 mM Dorsomorphin 1x PenStrepGln 2. Formação EB forçado <ol><li> HPSCs crescer sob seus preferidos alimentador sem condições. Usamos MEF meio condicionado em Matrigel revestidas placas de 6 poços 15. No entanto, sistemas de cultura, tais como caseiros ou comerciais de mídia definidos também deve funcionar. No momento de iniciar a experiência, diferenciação hPSCs deve ser sub-confluente e em crescimento activo. </li><li> Remover mecanicamente espontaneamente colônias diferenciadas com uma ponta de pipeta estéril de plástico sob um microscópio estéreo. </li><li> Lavar restantes colónias indiferenciadas utilizando PBS, e as células individuais de digest utilizando Accutase contendo 1X Y-27632. Células individuais pelotas por centrifugação a 200 xg durante 2 min, ressuspender em um pequeno volume de meio de formação de EB e determinar titre célula usando um hematocytometer. </li><li> Adicionar uma parte alíquota de células parao meio de formação restantes EB para resultar em um título entre 40.000 e 80.000 células por ml. </li><li> Utilizando uma pipeta de canais múltiplos, transferir 100 ul por poço de uma placa de fundo 96V, resultando em 4.000 a 8.000 células por poço. Placa de 96 poços de centrifugação numa centrífuga de placa swing-out a 400 xg durante 1 min para recolher as células no fundo dos poços, e transferir para a cultura de células de incubadora. EBs irá formar durante a noite, como mostrado na Figura 1. </li></ol> 3. Indução neuroectoderma <ol><li> No dia seguinte (dia 0), a partir de chapa de recolher EBs 96V sob um microscópio estéreo e transferência para um pequeno volume numa placa de 3,5 centímetros bacteriana contendo 2 ml de meio de diferenciação. Agite suavemente o prato por vários segundos para lavar a EBS. </li><li> Adicionam-se 100 ul de meio por poço a diferenciação de um ultra-low-fixação fundo em U de 96 poços da placa. Sob estereomicroscópio, transferência EBs em pequenos volumes a partir da lavagem do prato para o 96U-poços (um EB por nósll). Colocar a placa de cultura de células em 96U incubadora durante 4 dias, para permitir a formação de neuroectoderme. </li></ol> 4. Formação neurônio <ol><li> No dia 4, preparar um prato de lavagem como descrito no passo 3.1 e, adicionalmente, substitua DMEM/F-12 num pré-aquecido Matrigel revestido placa de 12 poços por meio de diferenciação (1 ml por poço). </li><li> Chapeamento de EBs <ol><li> Recolha de EBs placa 96U, lavar estas sementes como acima, e cuidadosamente uma por uma nos poços do Matrigel revestido placa de 12 poços (cerca de 8 EBs por poço): EBs deve ser igualmente distribuído dentro dos poços para permitir outgrowth imperturbada do neurônios ao longo dos próximos dias (ver &quot;dia 5&quot; imagem na Figura 2). </li><li> Antes da transferência da parte de trás da placa de 12 poços na incubadora, permitir EBs para anexar livremente por cerca de 10 min à temperatura ambiente. Em seguida, transferir cuidadosamente placa de 12 poços para cultura de células de incubadora. Neurónios vai crescer para fora da EBs chapeado de um modo radial dentro dos 4 dias seguintes, tal como shown na Figura 2 (&quot;dia 8&quot; imagem à direita). </li></ol></li></ol> 5. Neurônio Formação como monocamadas <ol><li> Como uma alternativa para os passos do ponto 4), no dia 4 do procedimento, recolher EBs em um prato de 3,5 centímetros bacteriana contendo 2 ml de meio de diferenciação, em seguida, transferir EBs em um pequeno volume para um prato de PBS contendo, em seguida, em outro prato contendo Accutase. </li><li> Deixe digerir a células individuais, centrifugar a 200 xg durante 2 minutos, ressuspender em um pequeno volume de meio de diferenciação e determinar titre célula usando um hematocytometer. Ajustar a título de 1-2x10 6 células por ml em meio de cultura de diferenciação (sem Y-27632). </li><li> Células da placa para fora na pré-aquecido Matrigel revestido placa de 12 poços (1 mL por cavidade), e transferência para a incubadora de cultura de células. Formação Neuron como monocamadas foram observadas entre os dias 7-8 (Figura 3C). Deve notar-se, contudo, que esta variante de monocamadao processo não está completamente optimizada no que se refere à sobrevivência das células e substrato mais adequado. </li></ol>

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rosette-type,+self-renewing+human+ES+cell-derived+neural+stem+cell+with+potential+for+in+vitro+instruction+and+synaptic+integration.">A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+directed+differentiation+of+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).</li><li>Pera, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+embryonic+stem+cell+differentiation+by+BMP-2+and+its+antagonist+noggin.">Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin.</a> J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).</li><li>Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+early+fate+decisions+in+human+ES+cells+by+distinct+states+of+TGFbeta+pathway+activity.">Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity.</a> Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).</li><li>Greber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signalling+inhibits+neural+induction+in+human+embryonic+stem+cells.">FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells.</a> EMBO J. 30, 4874-4884 (2011).</li><li>Anderson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Familial+dysautonomia+is+caused+by+mutations+of+the+IKAP+gene.">Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene.</a> Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs.">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461, 402-406 (2009).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+human+embryonic+stem+cell+embryoid+body+homogeneity+and+cardiomyocyte+differentiation+from+a+novel+V-96+plate+aggregation+system+highlights+interline+variability.">Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability.</a> Stem Cells. 25, 929-938 (2007).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability.">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6, e18293 (2011).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A maioria dos protocolos de diferenciação que envolvem a formação de EB hPSCs, incluindo o nosso procedimento publicado anteriormente 10, baseiam-se manual ou enzima-assisted colheita de hESCs como agregados, o que conduz inevitavelmente a heterogeneidade nos tamanhos de EB. Este fato leva à variabilidade na eficiência de diferenciação com algumas linhas de células, tornando análises sistemáticas difícil, em particular, em uma escala rendimento médio. Além disso, o esvaziamento manual é de trab...

hPSCs, compreendendo embrião derivado de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e as células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs), são pluripotentes sentido de que eles podem dar origem a linhagens de células diferentes in vitro 1-2. Vários tipos de células diferenciadas foram derivados de hESCs até à data, apoiar a noção de que essas células apresentam ferramentas valiosas para a pesquisa científica e as abordagens baseadas em células de triagem, e uma promessa para a célula-base terapêutica. Protocolos para a diferenciação neuronal hESCs são geralmente complexo e demorado uma vez que são muitas vezes baseados na primeira indução destino global neural, seguido por isolamento manual das células progenitoras neurais, e subsequente diferenciação terminal em um tipo de dado de interesse neurónio 3-6. Em alguns respeito, essa complexidade não é surpreendente e inevitável, dado que tal estado-da-arte protocolos de diferenciação direcionadas tendem a imitar gradual desenvolvimento humano precoce, which é em si extremamente complexo. Por outro lado, pode, em parte, também reflectem a falta de compreensão dos processos moleculares subjacentes, o que resulta em protocolos de diferenciação que ainda estão longe de ser totalmente otimizado. No que se refere à conversão de hPSCs indiferenciadas em neuroectoderme, Pera et al. descobriu que a supressão de BMP / SMAD1/5/8 sinalização aumenta a indução neural de hESCs 7. Além disso, a inactivação de Smad2 / 3 de sinalização tem sido mostrado para promover a formação de neuroectoderme 8. Por conseguinte, a inactivação combinado destas duas vias tende a levar a mais eficiente de indução neural hPSCs 4,9. Mais recentemente, têm demonstrado que a via de sinalização do terceiro, FGF / ERK, serve como um repressor forte dos primeiros passos de compromisso neuroectodérmica em hESCs. Inversamente, a repressão simultânea de todos estes três vias levam a quase homogénea conversão de hESCs em neuroectoderme comem apenas quatro dias 10. Posteriormente, a diferenciação terminal altamente eficiente em neurônios funcionais foi observado no prazo de oito dias. Os neurônios obtidos eram susceptíveis de ser neurónios sensoriais do sistema nervoso periférico, o que pode, em parte, explicar a sua derivação rápida 10. Defeitos na manutenção neurônio sensorial é considerada uma causa de certas doenças humanas, tais como disautonomia familiar 11. Para a modelagem de tais doenças baseadas em tecnologia hiPSC 12, para a caracterização funcional adicional, bem como para fins de aplicação não exigem qualquer tipo específico de neurónios, este processo de diferenciação podem apresentar uma base útil. No entanto, a estratégia de diferenciação que originalmente empregado envolvido formação de corpos embrionárias (EBS) de touceiras de colônias CTEh 10, e isso resultou em um bom grau de heterogeneidade em relação a tamanhos EB, e também apareceu para comprometer neurônio eficiência de formação em algumas celinhas ll. Por outro lado, devido à heterogeneidade nos tamanhos EB, a capacidade para testar sistematicamente os efeitos de factores de crescimento adicionais ou pequenas moléculas, durante e depois da formação de neurónios parecia ser um pouco confusa. Neste relatório, nós adaptamos o nosso procedimento anterior para um meio de rendimento compatível, forçado técnica de agregação baseado gerar EBs de uma forma altamente tamanho controlado, como também mostrado em outros contextos 13. Subsequentemente, o EBs gerada em forma de V poços de placas de 96 poços foram transferidas para fixação em forma de U de ultra-baixo de 96 poços, para iniciar a formação de neuroectoderme em suspensão. Quatro dias mais tarde, o EBs pode ser plaqueada para fora dando origem a neurónios terminalmente diferenciadas em alto rendimento e homogeneidade. Alternativamente, 4 dias de EBs foram dissociadas em células isoladas e plaqueadas como tal, o que resultou em baixa densidade monocamadas de neurônios humanos. Os resultados foram coerentes até agora obtida com os dois independentemente deRIVED linhas CTEh, HuES6 e NCl3. Como pré-requisito, a formação de EB sucesso era estritamente dependente da utilização de um polímero sintético, álcool polivinílico (PVA), em conjunto com o inibidor ROCHA Y-27632 conhecido para promover a sobrevivência hESC 13-14. Como resultado, a homogeneidade da EBs formado em 96-V-placas foi substancialmente melhorada em comparação com a formação de EBs como culturas em massa com base em técnicas de separação aleatórios. Este sistema proporciona assim uma plataforma significativamente melhorada para a formação de neuroectoderme em cultura em suspensão, seguindo-se a formação de neurónios em condições altamente controlado aderentes.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Matrigel HC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 354263 </td><td> Ver texto para detalhes sobre o tratamento </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Life Technologies </td><td> 21331-020 </td><td></td></tr><tr><td> Poli (álcool vinílico) </td><td> Sigma </td><td> 363170 </td><td> Dissolver em 0,4% em DMEM/F-12 usando um banho de água de ultra-sons / evitar sobreaquecimento / pode ser mantida a 4 ° C durante várias semanas </td></tr><tr><td> Suplemento N2 </td><td> Life Technologies </td><td> 17502-048 </td><td> 100X, armazenar como alíquotas congeladas </td></tr><tr><td> B27 Suplemento </td><td> Life Technologies </td><td> 12587-010 </td><td> Loja, 50X como alíquotas congeladas </td></tr><tr><td> Albumina de Soro Bovino </td><td> Sigma </td><td> A1595 </td><td> 10% = 500X, loja como alíquotas congeladas </td></tr><tr><td> L-Glutamina com Penicilina / Estreptomicina </td><td> PAA </td><td> P11-013 </td><td> Ou equivalente </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> Peprotech </td><td> 100-18B </td><td> Dissolver a 10 ug / ml em 0,1% BSA / PBS = loja, 1000X como alíquotas congeladas </td></tr><tr><td> ROCHA inibidor Y-27632 </td><td> abcamBiochemicals </td><td> Asc-129 </td><td> Dissolver em 10 mM em DMSO = loja, 1000X como alíquotas congeladas </td></tr><tr><td> PBS </td><td> PAA </td><td> H15-002 </td><td> Ou equivalente </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> PAA </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> De 96 poços de fundo em V placas </td><td> Nunc </td><td> 277143 </td><td></td></tr><tr><td> PD0325901 </td><td> Axon medchem </td><td> Axon 1408 </td><td> Dissolver a 0,5 mM em DMSO = loja, 1000X como alíquotas congeladas </td></tr><tr><td> SB431542 </td><td> abcamBiochemicals </td><td> Asc-163 </td><td> dissolver em 15 mM em DMSO = loja, 1000X como alíquotas congeladas </td></tr><tr><td> Dorsomorphin </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-200689 </td><td> dissolver a 0,5 mM em DMSO = loja, 1000X como alíquotas congeladas </td></tr><tr><td> De 96 poços com fundo em U de ultra baixa placas de fixação </td><td> Corning </td><td> 7007 </td><td></td></tr><tr><td> beta-tubulina III anticorpo (mouse) </td><td> Sigma </td><td> T8660 </td><td> usar em 1:1000 </td></tr><tr><td> beta-tubulina III anticorpo (coelho) </td><td> Covance </td><td> PRB-435P </td><td> usar em 1:2000 </td></tr><tr><td> BRN3A anticorpo (POU4F1) </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-8429 </td><td> usar de 1:500 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela 1. &lt;/ Strong&gt; reagentes e equipamentos específicos. </td></tr></tbody></table>

rapid and efficient generation of neurons from human pluripotent stem cells in a multititre plate format

Os protocolos existentes para a produção de neurónios de células pluripotentes humanas estaminais (hPSCs) são muitas vezes entediantes em que se trate de processos com vários passos, envolvendo o isolamento e expansão de células precursoras neurais, antes da diferenciação terminal. Em comparação com estas abordagens demorados, que têm encontrado recentemente que a inibição combinada de três vias de sinalização, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 e FGF / ERK, promove a rápida indução de neuroectoderme de hPSCs, seguido de imediato de diferenciação em neurónios funcionais. Aqui, nós adaptamos o nosso procedimento para um formato de romance placa multititre, para aumentar ainda mais a sua reprodutibilidade e para torná-lo compatível com o meio-throughput de aplicativos. Ele compreende quatro dias de formação neuroectoderme em esferas flutuantes (corpos embrióides), seguido por mais quatro dias de diferenciação em neurónios em condições de aderência. A maioria das células obtidas com este protocolo parecem ser os neurônios sensoriais bipolares. Além disso,o processo é altamente eficiente, não requer conhecimentos especializados particulares, e baseia-se em um meio simples quimicamente definido, com boa relação custo-eficiência moléculas pequenas. Devido a estas características, o procedimento pode servir como uma plataforma útil para investigação funcional adicional, bem como para a célula baseada em triagem aproxima exigindo humanos neurónios sensoriais ou neurónios de qualquer tipo.

Em nosso relatório anterior, em linha com muitos outros, a partir de EBs hPSCs poderiam ser gerados pela simples repique agregados, com a divisão de rotina de hPSCs em fixação de baixa pratos 10. Isso geralmente resulta em uma ampla distribuição de tamanhos EB resultantes (Figura 1C, superior). Outro problema resultante da presente é a de que EBs mantidas em suspensão tendem a agregar uma com a outra, conduzindo a uma ainda maior heterogeneidade de tamanhos de EB. Para contornar esses...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format at JoVE.com

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Os protocolos para a diferenciação neuronal de células pluripotentes estaminais humanas (hPSCs) são muitas vezes demorado e requer habilidades substanciais cultura de células. Aqui, nós adaptamos um procedimento de diferenciação pequena molécula baseada em um formato de placa de multititre, permitindo a geração de simples, rápido e eficiente de neurônios humanos de uma maneira controlada.

Geração rápida e eficiente de neurônios a partir de células-tronco pluripotentes humanas, em um formato de placa Multititre

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

rapid-efficient-generation-neurons-from-human-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

43.5K visualizações.  Max Planck Institute for Molecular Biomedicine. Os protocolos para a diferenciação neuronal de células pluripotentes estaminais humanas (hPSCs) são muitas vezes demorado e requer habilidades substanciais cultura de células. Aqui, nós adaptamos um procedimento de diferenciação pequena molécula baseada em um formato de placa de multititre, permitindo a geração de simples, rápido e eficiente de neurônios humanos de uma maneira controlada.

Vídeo: Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfectando e Nucleofecting células-tronco pluripotentes induzidas

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Biologia

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Derivação eficiente dos recursos humanos Precursores cardíaca e Cardiomyocytes pluripotentes a partir de células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

Geração de Células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sangue periférico usando o STEMCCA Lentivirus Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.

A esporulação eficiente dos<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Num Multiwell Format 96

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and vision. Proteins on the RPE apical surface are tightly associated with proteins on the photoreceptor outer segment surface, making it difficult to consistently separate the RPE from the photoreceptors/retina. We developed a method to efficiently separate the retina from the RPE of human eyes to generate complete RPE/choroid and retina flatmounts for separate cellular analysis of the photoreceptors and RPE cells. An intravitreal injection of a high-osmolarity solution of D-mannitol, a sugar not transported by the RPE, induced the separation of the RPE and retina across the entire posterior chamber without causing damage to the RPE cell junctions. No RPE patches were observed attached to the retina. Phalloidin labeling of actin showed RPE shape preservation and allowed morphometric analysis of the entire epithelium. An artificial intelligence (AI)-based software was developed to accurately recognize and segment the RPE cell borders and quantify 30 different shape metrics. This dissection method is highly reproducible and can be easily extended to other animal models.

We describe a method to efficiently separate retinal pigment epithelium (RPE) from the retina in human eyes and generate whole RPE/choroid flatmounts for histological and morphometric analyses of the RPE.

Geração eficiente e consistente de epitélio/coroide de pigmento da retina a partir de olhos humanos para análise histológica

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...