XHP foi apoiado pelo National Institute of Health (NIH) doações do National Institute on Aging (NIHK01AG024496) e A Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e Desenvolvimento Humano (NIHR21HD056530).

1. Solução e Mídia Preparação <ol><li> Solução de revestimento de gelatina: 0,1% (w / v) de gelatina em DDH 2 O, autoclavado e armazenar a 4 ° C. </li><li> Matrigel soluções de revestimento. Solução estoque: lento degelo Matrigel (10 ml) a 4 ° C durante a noite, adicionar 10 ml gelada DMEM ou DMEM/F12, misture bem e alíquota de 1 ml / tubo sob capô de cultura de tecidos esterilizados, armazenar a -20 ° C. Solução de trabalho: descongele lenta 1 ml alíquota Matrigel a 4 ° C por 1-2 horas a transferência, a 14 ml ou refrigerados DMEM DMEM/F12 e misture bem debaixo capa de cultura de tecidos esterilizados imediatamente antes de revestimento. </li><li> Solução de revestimento laminina humana: diluir 1 ml de solução de laminina humana (0,5 mg / ml em Tris Buffered NaCl, armazenar a -80 ° C, degelo lento a 4 ° C por 1-2 horas) com gelado DMEM ou DMEM/F12 para 12,5 ml de solução de trabalho (40 mcg / ml) por baixo capota de cultura de tecidos esterilizados imediatamente antes de revestimento. </li><li> Soluções estoque de fator de crescimento (500-1000x): dissolver o fator de crescimento de 10 mg/ Ml em tampão esterilizado (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, glicerol 10%, 1XPBS) e armazenar como 50-100 mL / tubo de alíquotas a -80 ° C. </li><li> Media células estaminais embrionárias humanas: DMEM/F12 ou KO-DMEM (80%), KO substituição de soro (20%), L-alanil-L-gln ou L-gln (2 mM), MEM aminoácidos não essenciais (MNAA, 1X), e β-mercaptoetanol (100 mM), filtrado e armazenar a 4 ° C, suplementado com 20 ng / ml bFGF antes de usar. Ou substituição de &quot;KO substituição do soro&quot; com componentes definidos: DMEM/F12 ou KO-DMEM (100%), L-alanil-L-gln ou L-gln (2 mM), MNAA (1X), MEM aminoácidos essenciais (MEAA , 1X), e β-mercaptoetanol (100 mM), filtrado e armazenar a 4 ° C, suplementado com bFGF (20 ng / ml), a insulina humana (20 mcg / ml), ácido ascórbico (50 mg / ml), humanos ativina A (50 ng / ml), albumina humana Albumax / (10 mg / ml), e transferrina humana (8 mcg / ml) antes de usar. </li><li> Media células estaminais embrionárias humanas cardíaca diferenciação: DMEM/F12 (90%), FBS definida (10%), e L-alanil-L-gln ou L-gln (2 mM). </li><li> Mídia contendo nicotinamida (NAM): adicionar NAM células estaminais embrionárias humanas para a mídia ou a mídia células estaminais embrionárias humanas cardíaca diferenciação para concentração final de 10 mM, filtrado loja, a 4 ° C e usar dentro de 2 semanas de preparação. </li></ol> 2. Revestimento placa <ol><li> Placas de revestimento com gelatina: adicionar 2,5 ml / poço de solução de gelatina a 6 placas bem e incubar durante a noite em uma incubadora de 37 ° C umidificado. </li><li> Placas de revestimento com laminina: frio de gelatina revestidos e remover placas de gelatina, adicione 2,5 ml / solução de revestimento bem Matrigel ou humano laminina trabalhando para pré-gelatinizado refrigerados 6-bem placas e incubar a 4 ° C durante a noite. </li></ol> 3. Passaging e propagação hESCs indiferenciado sob condições definidas <ol><li> Permitir colônias CTEh crescer até 5-7 dias de idade, e ter placa de cultura CTEh para microscópio de dissecação (pré-aquecido dissecar palco para 37 ° C) por baixo de dissecação capô esterilizados. </li><li> Selecione colônias CTEh a ser dividido. Morfologicamente, essas colônias devem ter&gt; 75% hESCs indiferenciada (smtodas as células compactas), geralmente um pouco opaco (não-brancos empilhados células não diferenciadas células claras) com borda definida sob o microscópio de dissecação. Cuidadosamente delinear as colônias selecionadas e remover camada de fibroblastos diferenciados em torno da colônia e todas as partes diferenciadas (se houver) da colônia com a borda da P2 ponteira estéril ou puxado capilar de vidro. </li><li> Remover a velha mídia contendo flutuante destacada células diferenciadas por aspiração. Lavar com media hESC (sem bFGF) uma vez. Adicionar 3 ml / media CTEh bem fresco contendo 20 ng / ml bFGF. </li><li> Cortar as colônias CTEh indiferenciado em pequenos pedaços, e retire com ponteira estéril ou vidro puxado capilar. </li><li> Piscina a mídia que contém peças colônia separada juntos em um tubo de 50 ml. Lave a placa uma vez com 1 ml / media CTEh bem contendo 20 ng / ml bFGF e piscina juntos. </li><li> Aspirar o Matrigel ou solução laminina humana, desde as placas revestidas fresco. Alíquota de 4 ml / h bemESC mídia contendo peças colônia para uma placa de seis poços. Suavemente transferir a placa para incubadora, sem agitação e permitir semente peças colônia durante a noite sem perturbar em um umidificado 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO 2. </li></ol> 4. Indução cardíaca de hESCs em Sistema Cultura Definido com Nicotinamida <ol><li> No dia 3 após a semeadura, remover a maior parte velha mídia de cada poço da placa e deixe a mídia o suficiente para permitir colônias CTEh a ser submersa (nunca permitir hESCs a secar). Substituir com 4 ml / media CTEh bem fresco contendo 20 ng / ml bFGF e 10 mM nicotinamida (NAM). </li><li> Substituir a velha mídia com a mídia CTEh fresco contendo 20 ng / ml e 10 mM bFGF NAM cada dois dias, e permitir que as colônias cardíaca induzida CTEh crescer para 10/08 dias. Após expor a NAM, todas as células dentro da colônia vai sofrer alterações morfologia de grandes células diferenciadas que continuarão a se multiplicar. As colónias aumentarão de tamanho, e por 8-10 dias, umcélulas d começará a se acumular em algumas áreas das colônias. </li></ol> 5. Continuando Diferenciação Cardíaca em Cultura Suspensão <ol><li> Tome placa CTEh cultura para dissecar microscópio (pré-aquecido dissecar palco para 37 ° C) por baixo de dissecação capô esterilizados. Cuidadosamente delinear as colônias e remover camada de fibroblastos ao redor da colônia (células diferenciadas migraram para fora da colônia) com a borda da ponta da pipeta estéril ou P2 puxado capilar de vidro. </li><li> Remover a velha mídia contendo flutuante células de fibroblastos destacado por aspiração. Lavar com media hESC (sem bFGF) uma vez. Adicionar 3 ml / media CTEh bem fresco (sem bFGF). </li><li> Cortar as colônias cardíaca induzida CTEh em pequenos pedaços, e retire com ponteira estéril ou vidro puxado capilar. </li><li> Piscina a mídia que contém peças colônia separada juntos em um tubo de 50 ml. Lave a placa uma vez com 1 ml / media CTEh bem (sem bFGF) e piscina juntos. </li><li> Alíquota de 4 ml / poço media sem soro CTEh contendo peças colônia para uma placa de fixação 6-ultralow bem e incubar a 37 ° C umidificado incubadora para permitir flutuante aglomerados celulares (cardioblasts) para formar por 4-5 dias. </li></ol> 6. Maturação batendo Fenótipo Cardiomyocyte em Cultura Adhesive <ol><li> Piscina a mídia que contém cardioblasts flutuando juntos em um tubo de 50 ml. Centrifugar a 1400 rpm por 5 min. Aspirar a velha mídia, tanto quanto você pode e adicionar uma quantidade igual de novo CTEh media diferenciação cardíaca contendo 10 mM NAM. </li><li> Pipeta cima e para baixo para misturar cardioblasts flutuante e alíquota de 4 ml / poço a 6-lamelas. Transferir os pratos para a 37 ° C incubadora umidificada para permitir cardioblasts anexar durante a noite. </li><li> Substituirá a mídia CTEh cardíaca diferenciação contendo 10 mM NAM em dias alternados. </li><li> No dia 8, substitua com a mídia CTEh cardíaca diferenciação sem NAM, e continuam a substituir células estaminais embrionárias humanas cardíaca diferenciação de mídia edia muito outros. Cardiomiócitos batendo começarão a aparecer em cerca de 1-2 semanas de cultivo contínuo após a retirada do NAM e aumentar em número com o tempo, e poderia manter fortes contrações rítmicas e por mais de 3 meses. </li></ol> 7. Resultados representativos: Nicotinamida (NAM) é processada suficiente para induzir hESCs mantido no sistema de cultura definida para a transição de pluripotência exclusivamente a um fenótipo cardiomesodermal (Fig. 2B). Após a exposição de hESCs indiferenciado para NAM, todas as células dentro da colônia vai sofrer alterações morfologia de grandes células diferenciadas que baixo-regulam a expressão de Oct-4 e começam a expressar o fator de transcrição cardíacas específicas (CSX) Nkx2.5 e α- actinina, consistente com um fenótipo cardiomesoderm (Fig. 2B). Estas células diferenciadas continuarão a se multiplicar e as colônias aumentam de tamanho. Aumento da intensidade das Nkx2.5 vaigeralmente ser observado nas áreas das colônias, onde as células começam a se acumular (Fig. 2B). Depois de separado, o hESCs NAM-tratados formarão flutuante aglomerados celulares (cardioblasts) em uma cultura de suspensão para continuar o processo de diferenciação cardíaca. Depois de permitir a cardioblasts para anexar e continuar a tratar com NAM por 1 semana, batendo cardiomiócitos começarão a aparecer em cerca de 1-2 semanas de cultivo contínuo após a retirada do NAM com um aumento drástico em termos de eficiência, em comparação com diferenciação multi-linhagem espontânea de hESCs sem tratamento sobre o mesmo período de tempo (Fig. 2C). Células dentro dos clusters vai bater cardiomiócitos expressam marcadores característicos de cardiomiócitos, incluindo Nkx2.5 e α-actinina (Fig. 2C). As contrações dos cardiomiócitos batendo foram confirmados por perfis elétricos para ser forte, rítmica, bem coordenada e bem arrastado, com impulsos regulares lembra do p-QRS-T-complexos de visto a partir de eletrodos de superfície do corpo em clínica eletrocardiogramas (Fig. 2C, também ver o vídeo). Os cardiomiócitos poderia manter a sua contratilidade forte por mais de 3 meses. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemas geral da abordagem convencional versus abordagem de pequena molécula de indução de diferenciação de células-tronco humanas pluripotentes para células especializadas funcional. (A) Um esquema de abordagem convencional, usando multi-linhagem inclinação de células-tronco humanas pluripotentes através da diferenciação espontânea germe de camada. (B) Um esquema de bem-controlados de indução eficiente de células-tronco pluripotentes humanas exclusivamente a uma linhagem particular clinicamente relevante pelo simples fornecimento de pequenas moléculas. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig2.jpg" /> Figura 2. Nicotinamida induz especificação linhagem cardíaca direta de pluripotência em condições definidas e progressão para bater cardiomiócitos. (A) Esquema mostrando a linha do tempo de protocolo de diferenciação dirigida cardíaca de hESCs. (B) Após a exposição de hESCs indiferenciada a nicotinamida (NAM), sob o sistema de cultura definido, grande diferenciados Oct-4 (vermelho) células negativas dentro da colônia começaram a surgir, em comparação com o mock-tratados (DMSO) hESCs como controle. NAM induzida por células Oct-4-negativos começaram a expressar Nkx2.5 (verde) e α-actinina (vermelho), de acordo com a diferenciação cardíaca precoce. Intensidade progressivamente aumentado de Nkx2.5 era normalmente observada em áreas da colônia onde as células começaram a se acumular. Todas as células são indicados por DAPI coloração de seus núcleos (azul). (C) NAM-cardíaca induzida comprometido hESCs rendeu cardiomiócitos batendo com um aumento drástico em termos de eficiência, avaliada pela clus celularters que mostrava contrações rítmicas (ver perfil eletrofisiológicos e vídeos), e imunopositivas para Nkx2.5 (verde) e α-actinina (vermelho). Imagens da fase de grupos representativos de bater grandes cardiomiócitos e imagens de maior poder de representante contrair músculos cardíacos são mostrados (veja também vídeos correspondente). As setas indicam o cluster cardiomiócitos grande batendo utilizado para a gravação eletrofisiológico. Perfil eletrofisiológico dos cardiomiócitos bater mostra regular, arrastado, impulsos rítmicos reminiscência da p-QRS-T-complexos visto em eletrocardiogramas clínicos. Barras de escala: 0,1 mm. Vídeos: Entidade cardiomiócitos diferenciados NAM induzida hESCs. Vídeos 1 e 2 mostram representante vídeo batendo grandes aglomerados de cardiomiócitos em cerca de 1 e 3 meses após a fixação. Video 3 e 4 mostram representante contraindo os músculos cardíacos com maior poder. 5 mostra uma typical aglomerado de cardiomiócitos pequenos batendo espontaneamente diferenciado de hESCs NAM sem tratamento como controle. <a href="/files/ftp_upload/3274/3274video1.avi">Clique aqui para assistir vídeo 1.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video2.avi">Clique aqui para assistir vídeo 2.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video3.avi">Clique aqui para assistir vídeo 3.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video4.avi">Clique aqui para assistir 4 Video.</a> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video5.avi">Clique aqui para assistir Video 5.</a>

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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li></ol>

Os autores declaram interesses conflitantes. XHP é o fundador da Xcelthera. XHP e EYS têm propriedades intelectuais relacionadas com hESCs.

Um dos grandes desafios tanto para estudos de desenvolvimento e tradução clínica tem sido a forma de canalizar o potencial de diferenciação gama de células-tronco pluripotentes humanas a um fenótipo desejado de forma eficiente e previsível. Apesar de tais células podem se diferenciar espontaneamente in vitro em células de todas as camadas germinativas, passando por uma fase agregado multi-linhagem, em CTEh derivados multi-linhagem agregados (corpos embrióides), apenas uma fração muito pequena de células (&lt;2%) espontaneamente diferenciar em cardiomiócitos 13-15 (Fig. 1A). Immunoselection seguintes, a população enriquecida de cardiomiócitos foram capazes de funcionar como marca-passos biológicos para resgatar a função de um miocárdio danificado mecanicamente e eletronicamente após a injeção no coração de modelos animais 13. Em modelos de roedores infartada, enxertada CTEh progênies derivadas cardíacos foram capazes de sobreviver e amadurecer até 12 semanas, e parcialmente remuscularize o coração ferido e melhorar a função contrátil 14,15. No entanto, a ineficiência na geração cardíaco humano comprometido células através de multi-linhagem diferenciação de células pluripotentes e alto risco de transplante tumorigenicidade seguintes têm impedido de nova tradução clínica. Desenvolvimento de estratégias para canalizar o potencial de diferenciação gama de hESCs pluripotentes exclusiva e previsivelmente a um fenótipo cardíaco é vital para aproveitar o poder da biologia CTEh no campo do coração. A fim de alcançar uniformemente conversão de células pluripotentes estaminais humanas a uma linhagem especial, empregamos um sistema de cultura definido capaz de segurar a proliferação de hESCs indiferenciado para identificar as condições para o bem-controlados de indução eficiente de hESCs pluripotentes exclusivamente para uma determinada linhagem clinicamente relevante pelo simples fornecimento de pequenas moléculas (Fig. 1B). Descobrimos que a nicotinamida induzida comprometimento cardíaco de linhagem direta de phESCs luripotent sob cultura definido que mais progrediu para bater cardiomiócitos com alta eficiência (Fig. 2). Nkx2.5 é um fator de transcrição evolutivamente conservada homeobox indispensável para o desenvolvimento cardíaca normal e mutações do gene são associadas à doença cardíaca humana congênitas (CC), o defeito de nascimento mais comuns humana 16. Expressão de Nkx2.5 é o primeiro marcador de células precursoras de coração em todos os vertebrados, até agora examinado e é essencial para a septação cardíaca adequada e formação / amadurecimento do sistema de condução elétrica 16. Nos vertebrados, o início eo padrão de expressão Nkx2.5 início cerca de coincidir com o calendário e área de especificação na embriogênese cardíaca precoce, e Nkx2.5 gene continua a ser expressa através do desenvolvimento no coração 16. Em nosso modelo CTEh, NAM apareceu para acionar a indução direta de hESCs cardíaca pluripotentes através da promoção da expressão de cardíacas específicas transcriNkx2.5 PÇÃO fator em um processo que pode emular a especificação de cardiomesoderm do epiblasto pluripotentes em cardiogenesis embrionárias humanas. Futuros estudos revelarão moléculas controle genéticas e epigenéticas no desenvolvimento coração humano como alternativas, que podem pavimentar o caminho para o controle de molécula pequena mediada direta e modulação do destino pluripotentes CTEh quando derivar linhagens clinicamente relevantes para terapias regenerativas. Sem tratamento NAM, &lt;hESCs 2% passarão por diferenciação espontânea em bater cardiomiócitos 12-15. Com o tratamento NAM, temos sido capazes de gerar&gt; 95% embrionárias precursores cardíacos e cardiomiócitos batendo&gt; 50% de hESCs mantido sob uma cultura define em um processo que pode emular o desenvolvimento embrionário do coração humano 12. Recentemente, conhecido destino cardíacas genes determinantes têm sido usados ​​para transdifferentiate fibroblastos de rato em pós-natal cardiomiócitos batendo com uma baixa eficiência de &lt;0,5% 17, 18 &lt;/ Sup&gt;. No entanto, as células somáticas reprogramadas têm sido historicamente associada com a expressão do gene anormal e senescência acelerada com utilidade terapêutica prejudicada 19-21. Finalmente, o protocolo que estabelecemos aqui é limitado a hESCs pluripotentes derivadas da massa celular interna (ICM) ou epiblasto do blastocisto humano 4,5, pode não se aplicar a outras células pluripotentes, incluindo animais originou-CES, CES derivado de mórula anterior (oito células) em estágio embriões 22, e as células reprogramadas artificialmente 23.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comments (opcional) </th></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD biociência </td><td> 356231 </td><td> Fator de crescimento reduzida </td></tr><tr><td> Laminina humana </td><td> Sigma </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> Nicotinamida </td><td> Sigma </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565042 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> Knock-out substituição de soro </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM solução aminoácido não essencial (MNAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM solução de aminoácidos (MEAA, 100X) </td&gt; <td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido ascórbico </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> Transferrina humana </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> Humana bFGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Insulina humana </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> Humana ativina A </td><td> PeproTech </td><td> 120-14E </td><td></td></tr><tr><td> FBS definido </td><td> Hyclone </td><td> SH30073-03 </td><td></td></tr><tr><td> 6-bem placa de fixação ultralow </td><td> Corning </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6 bem-placa </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

efficient derivation of human cardiac precursors and cardiomyocytes from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction

Até o momento, a falta de uma fonte de células adequado cardíaco humano tem sido o grande revés na regeneração do miocárdio humano, seja por celular baseado em transplante cardíaco ou por engenharia tecidual 1-3. Cardiomiócitos se tornar terminalmente diferenciadas logo após o nascimento e perdem a capacidade de proliferar. Não há evidências de que haste / progenitor células derivadas de outras fontes, tais como a medula óssea ou do sangue do cordão umbilical, são capazes de dar origem a células musculares de contração do coração após o transplante para o coração 1-3. A necessidade de regenerar ou reparar o músculo cardíaco danificado não foi cumprido pela terapia de células-tronco adultas, seja endógena ou através da entrega de célula 1-3. O geneticamente estáveis ​​células estaminais embrionárias humanas (hESCs) têm capacidade de expansão ilimitada e irrestrita plasticidade, proferindo um reservatório pluripotentes no derivação in vitro de grandes quantidades de células somáticas humanas que são restritos à linhagem em necessidadede reparo e regeneração 4,5. Devido à prevalência de doença cardiovascular em todo o mundo e aguda escassez de doadores de órgãos, existe grande interesse em terapias CTEh baseado em desenvolvimento como uma abordagem alternativa. No entanto, como canalizar o potencial de diferenciação gama de hESCs pluripotentes de forma eficiente e previsível para um fenótipo desejado tem sido um grande desafio tanto para estudo de desenvolvimento e tradução clínica. Abordagens convencionais dependem de multi-linhagem inclinação de células pluripotentes através da diferenciação espontânea germe de camada, resultando em ineficiência e incontrolável linhagem compromisso, que é muitas vezes seguido de heterogeneidade fenotípica e instabilidade, portanto, um risco elevado de tumorigenicidade 6-8 (ver um esquema em fig. 1A). Além disso, indefinido estrangeiros / animal suplementos biológicos e / ou alimentadores que tenham sido tipicamente usadas para o isolamento, expansão e diferenciação de hESCs pode fazer uso direto de tais células-specialized enxertos em pacientes problemáticos 9-11. Para superar esses obstáculos, temos resolvido os elementos de um sistema de cultura definidas necessárias e suficientes para sustentar o epiblasto pluripotence de hESCs, servindo como uma plataforma para a derivação de novo de hESCs clinicamente adequado e eficaz direcionando hESCs tais uniformemente para linhagens clinicamente relevante por pequenas moléculas 12 (ver um diagrama esquemático na fig. 1B). Após a triagem de uma variedade de pequenas moléculas e fatores de crescimento, verificou-se que tais condições definidas prestados nicotinamida (NAM) suficiente para induzir a especificação de cardiomesoderm direta de hESCs pluripotentes que mais progrediu para cardioblasts que gerou humana cardiomiócitos batendo com alta eficiência (Fig. 2 ). Nós definimos as condições para a indução de cardioblasts direta de hESCs pluripotentes sem uma intervenção multi-estágio corpo linhagem embrióides, permitindo bem controlados derivação eficiente de umgrande oferta de células cardíacas humanas em todo o espectro de estágios de desenvolvimento para a célula-base terapêutica.

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Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Nós estabelecemos um protocolo para indução de cardioblasts direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores cardíaca e funcional cardiovascular cardiomiócitos para reparação.

Derivação eficiente dos recursos humanos Precursores cardíaca e Cardiomyocytes pluripotentes a partir de células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

efficient-derivation-human-cardiac-precursors-cardiomyocytes-from

Research

JoVE Journal

Biology

19.3K visualizações.  San Diego Regenerative Medicine Institute. Nós estabelecemos um protocolo para indução de cardioblasts direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores cardíaca e funcional cardiovascular cardiomiócitos para reparação.

Vídeo: Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Biologia

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Derivação de células estaminais embrionárias humanas por Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Cromatina imunoprecipitação de células estaminais embrionárias humanas

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congelamento e descongelamento, células estaminais embrionárias humanas

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Isolamento e derivação de células embrionárias de rato Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Diferenciação de células-tronco embrionárias em precursores oligodendroglial

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfectando e Nucleofecting células-tronco pluripotentes induzidas

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Preparação de células embrionárias de camundongos Fibroblastos adequados para a cultura de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

Geração rápida e eficiente de neurônios a partir de células-tronco pluripotentes humanas, em um formato de placa Multititre

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...