Agradecemos a Sra. Angela Freund para a assistência técnica excelente na secção dos stents embutidos plástico. Agradecemos também a Sra. Roya Soltan e Sra. Angela Freund para a ajuda profissional com coloração imuno-histoquímica.

1. Preparando Stent e Implantação <ol><li> O stent-struts (Fort Wayne Metals, Castlebar, Irlanda) foram trançado e depois cortar para o tamanho desejado no Instituto de Tecnologia Têxtil e Engenharia Mecânica, RWTH Aachen University, na Alemanha (Figura 1A). </li><li> Antes da implantação, os stents devem ser transferidos para um tubo de silicone 2 cm, usando uma pinça, e colocada de 2mm a uma extremidade terminal, referida extremidade frontal (Figura 1A). </li><li> A extremidade dianteira deve ser cortado obliquamente, para garantir uma ponta afiada, para implantação. </li><li> Antes da implantação, o stent devem ser abundantemente regado, para assegurar o deslizamento. </li></ol> 2. Implante de stent <ol><li> 10-12 semanas de idade C57BL / 6 de tipo selvagem ratos machos, 25-27 g são anestesiados com injecção intraperitoneal de 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de xilazina. Anestesia adequada é confirmada antes de cirurgia pela falta de reflexos emovimento barba. Para prevenir o ressecamento, enquanto sob anestesia, os olhos do rato são cobertos por uma película de bepanthene creme. </li><li> Após a depilação e adequada desinfecção da área do pescoço ventral, uma pequena incisão mediana de 1 cm é realizada sob um microscópio estereoscópico, utilizando uma tesoura. Depois de separar os dois corpos gordos com pinças curvas estéreis, a artéria carótida comum esquerda, pode ser visto cíclico juntamente com a traqueia. </li><li> 1 cm da artéria carótida comum esquerda ea bifurcação deve ser livre preparado. Um nó com um fio de 5/0 de seda irá ser ligado em torno da artéria carótida comum esquerda, 2 nós, utilizando 7/0 fio de seda vai ser ligado em torno da artéria carótida externa esquerda, e um nó com um fio de 7/0 seda será ligado em torno da artéria carótida interna (figura 1B). </li><li> O fluxo de sangue é, então, interrompida através da ligação dos nós na artéria carótida interna e da artéria carótida externa firmemente proximal, bem como, puxando o nó de surroundção da artéria carótida comum. O recipiente deve ser fixado de uma maneira que a artéria carótida comum e externa são em linha recta. </li><li> Uma pequena incisão na artéria carótida externa é realizado, próximo do nó proximal, utilizando uma tesoura Vannas. O tubo de silicone contendo o stent é introduzido na artéria carótida externa, com a ponta à frente, utilizando um fio-guia. Após o stent atinge a posição desejada, o tubo de silicone é puxado para trás por cima do arame de guia e permite a expansão com memória de forma do stent (Figura 1B). </li><li> O nó distai na artéria carótida externa é ligar firmemente para fechar o local da incisão e os nós na artéria carótida comum e interna são removidos, restaurando assim o fluxo sanguíneo. </li><li> A incisão na pele é fechada com grampos de sutura 3-4 Michel e um Michel fórceps. O mouse é colocado sob a luz vermelha até a recuperação completa. Um tratamento analgésico não é necessário. </li><li> Oplaca pode ser analisada após 1-3 semanas. Para estudar a re-Endotelização, um ponto do tempo do fim mais cedo é necessário (3-4 dias). Observou-se no nosso modelo de implante de stent que 4 semanas após a intervenção cirúrgica, em particular através da utilização de revestimentos específicos para os stents biofunctionalize miniaturizados, neoangiogénese ocorre em aproximadamente 30% da amostra. Este é um processo posterior para a remodelação e regeneração, com diferentes mecanismos e que representam um outro problema patológico. Para concentrar a formação da neointima, estenose in-stent e / ou análise dos mecanismos subjacentes a esses efeitos secundários após o implante de um ponto de três semanas de tempo de fim seria benéfico para não misturar-se com os efeitos regenerativos induzidas pelo aparecimento da neoangiogénese. </li></ol> 3. Análise da formação de placas <ol><li> No ponto de tempo final, os animais são anestesiados com injecção intraperitoneal de 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de xilazina.Anestesia adequada é confirmada antes de cirurgia pela falta de reflexos e movimento barba. </li><li> Os animais são mortos por sangria intracardíaca. O soro de sangue é recolhido para análise posterior. </li><li> Depois de abrir a cavidade torácica e PBS de lavagem através de punção intracardíaca, um organismo de perfusão com uma solução de paraformaldeído a 4% (PFA) é realizada durante 5 min. A artéria carótida esquerda contendo o stent é dissecado, directamente colocadas numa solução de 4% de PFA e, pelo menos, 16 horas mais tarde embbeded em plástico. </li><li> 50 seções espessas mM são realizados a partir de amostras de plástico embutido usando uma banda serra de diamante. </li><li> Para medir o tamanho da placa, é realizada coloração de Giemsa. </li><li> Para analisar a taxa de re-endotelização stent dentro da área do vaso, a imunohistoquímica para factor de von Willebrand (vWF) é executada. </li></ol>

<ol>
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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+in-stent+stenosis+in+ApoE+knockout+mice:+insights+from+a+novel+mouse+model+of+balloon+angioplasty+and+stenting.">Increased in-stent stenosis in ApoE knockout mice: insights from a novel mouse model of balloon angioplasty and stenting.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27, 833-840 (2007).</li><li>Chamberlain, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+of+in+situ+stenting.">A novel mouse model of in situ stenting.</a> Cardiovasc. 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Não há conflitos de interesse declarados.

Para reduzir o risco de trombose intra-stent e restenose e sustentar o desenvolvimento de novos revestimentos para stents farmacológicos, um método fácil, simples e acessível do stent em um modelo animal é necessária. Ratos entregar o sistema ideal para estudar os mecanismos complexos de remodelação arterial após a implantação do stent e a eficiência de tais drogas. Modelos de reestenose intra-stent em rato existentes são difíceis, exigem altas habilidades cirúrgicas e implica elevados riscos de complicações como sangramento ou paralisia 17-19. Por exemplo, no modelo de implante do stent na aorta torácica de um rato dador após balão de dilatação do vaso e, em seguida, o transplante do segmento de stent na artéria carótida de um rato receptor 17, o estudo dos mecanismos de pato-não está influenciado apenas por reacção destinatário material dador, mas também pela enorme prejudicial dos vasa vasorum e adventícia. Implantação de um stee inoxidávell stent directamente na aorta abdominal após a dilatação de balão 19 é seguido por uma elevada taxa de mortalidade (35%) devido à paralisia perna após trombose ou hemorragia da aorta abdominal no local da arteriotomia. Implantação de um em forma de espiral auto-expansível de nitinol-stent em aorta abdominal através da artéria femoral 18 precisa de altas habilidades cirúrgicas, principalmente devido à cegamente dirigir o stent ao longo da ramificação da artéria femoral de aorta para colocar o stent na posição correta. Este procedimento é seguido por um alto risco de danificar o nervo femoral, portanto, paralisia da perna traseira. Comparado com estes procedimentos, o nosso modelo de implante de stent em rato não precisa de altas habilidades cirúrgicas. Nosso modelo oferece um método simples, fácil e eficiente para analisar os efeitos de diferentes drogas revestimentos no remodelamento arterial, a colocação do stent é feito sob visão, e não há riscos de danificar os nervos ou outras estruturas. O commecanismos moleculares complexas podem ser investigados mais fácil em nosso modelo de rato stent na artéria carótida, não só pela acessibilidade direta do navio, mas também devido à existência de diferentes cepas de camundongos knock-out. Como uma limitação, comparando com o procedimento clínico, o nosso modelo utiliza camundongos / artérias saudáveis ​​e não realiza implante de stent em placas pré-existentes (não reestenose intra-stent, mas estenose intra-stent). Nós também não executar balão dilatação antes de stent-implantação. No entanto, devido ao grande dano da parede dos vasos em ambos os modelos, os processos são semelhantes reparadoras. Infelizmente, devido aos artefatos de metal derivados, uma monitorização in vivo do crescimento neointimal não é possível por métodos de imagem existentes, como ultra-som ou computador tomografia. Outro fator limitante é a secção fina de stents baseados em metal, o que requer alguma experiência no processamento de metais. Usando este método, nós éramoscapazes de mostrar que, por neutrófilos, instruindo-biofunctionalized miniaturizado nitinol stents revestidos com o LL-37 reduzem a restenose intra-stent, proporcionando um novo conceito para promover a cura vascular após terapia de intervenção 21. Apesar destas limitações, este modelo parece ser, até agora, o sistema mais adequado, assim, dinheiro e economia de tempo, para investigar novas drogas revestimentos de stents e seus efeitos sobre os eventos moleculares durante a remodelação arterial. Além disso, este modelo pode ser facilmente adaptado para o hamster, que é mais semelhante à humana, de modo que todas as hipóteses terapêutico pode ser verificada, antes de aplicar a animais maiores ou humanos a fim de evitar os efeitos desagradáveis ​​e inesperadas.

As doenças cardiovasculares causados ​​pela progressão da aterosclerose é a principal causa de morte nos países industrializados. A aterosclerose é uma resposta focal, inflamatória fibro-proliferativa da parede vascular à lesão endotelial 1, resultando na formação de uma placa alargada para dentro do lúmen do vaso, que afectam o fluxo sanguíneo através das artérias coronárias. Mais de 75% dos enfartes do miocárdio resultado da ruptura da capa fibrosa fina da placa inflamada 2. Uma vez que esta complicação pode ser fatal, uma transluminal percutânea (coronária) angioplastia (PTCA) com implante de stent tornou-se a terapia de primeira escolha na prática médica atual. O método permite a dilatação da artéria coronária estreitada e, assim, o restabelecimento do fluxo sanguíneo. Ao mesmo tempo, provoca um grau de lesão no endotélio e parede do vaso 3. No entanto, o efeito a longo prazo desta terapia é limitado por um remodelamento arterial excessivaling e reestenose 4. Por emprego de stents, a ACPT tornou-se mais eficaz no tratamento de lesões complexas, permitindo revascularização após um navio encerramento aguda 5. Este método diminui a incidência de restenose intra-stent, para menos de 10% 6. Além destes benefícios, a terapia de primeira escolha para a revascularização coronária tem também os riscos que ameaçam a vida de trombose intra-stent e reestenose. Trombose intra-stent é causada por um de-endotelialização do vaso, seguido por uma adesão maciça de plaquetas e fibrina ao local lesionado. 26% dos pacientes sofrem de trombose intra-stent e 63% morrem de infarto do miocárdio 7. A restenose refere-se ao processo de cicatrização de feridas após trauma mecânico à parede do vaso, envolvendo hiperplasia neointimal (migração e proliferação de células do músculo liso vascular (VSMC), a deposição de matriz extracelular (ECM), e remodelaçãodo navio. Muitas vezes, um procedimento invasivo re-intervenção torna-se necessário dilatate vasos ateroscleróticos severamente estreitadas devido à trombose no stent e reestenose. Para prevenir a trombose intra-stent, é necessário um tratamento a longo prazo com medicamentos anti-trombóticos 8. Para evitar a reestenose, nova geração de stents farmacológicos eluir agentes anti-proliferativa, como imunossupressores (por exemplo, sirolimus, everolimus, zotarolimus) e drogas anti-câncer (por exemplo, paclitaxel) de um revestimento de polímero por vários meses 9,10. Embora estas drogas diminuir a formação da neointima e reestenose, mantêm um elevado risco de trombose intra-stent através da inibição da re-endotelização. Após a lesão arterial, a manutenção do compartimento endotelial é essencial para a prevenção de complicações trombóticas. Sob condições fisiológicas, o endotélio humano apresenta uma taxa de volume 11. Sob pathological condições, contudo, a integridade do endotélio é prejudicada, de modo que uma rápida recuperação envolve as células endoteliais maduras e as células progenitoras endoteliais (CPE) em circulação é necessária 12,13. O estudo destes mecanismos moleculares complexas em animais maiores 14-16 ou na artéria aorta do rato é um processo muito difícil, oferecendo dados limitados 17-19. Para testar a eficácia de novos revestimentos de stents para reduzir a trombose intra-stent e os novos modelos são restenose imperativo. Nitinol representa a plataforma ideal para stents por causa de sua &quot;alta elasticidade, o efeito memória de forma e boa tolerância nos pacientes, sendo utilizado com sucesso como stents bare-metal em uso clínico. Esta liga tornou possível criar um stent miniaturizado com um diâmetro externo de 500 mm, que podem ser revestidos 20 e implantado na artéria carótida de ratos. O desenvolvimento de uma miniatura nitinol stent para rato carotid artéria, permite o estudo dos mecanismos moleculares precisos induzida por colocação de stent e oferece a possibilidade de testar rapidamente e eficientemente os efeitos de diferentes revestimentos de drogas para prevenir a restenose. Além disso, a existência de diferentes cepas de camundongos knock-out representa uma enorme vantagem para esclarecer o papel dos diferentes moléculas envolvidas no crescimento do neo-íntima e trombose intra-stent.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitinol-stents (self-made from nitinol-struts)</td>
			<td>Fort Wayne Metals, Castlebar, Ireland NiTi#1, superelastic, straight annealed, light oxide, diameter 500 &mu;m</td>
			<td>custom-made product</td>
			<td>Institute for Textile Technology and Mechanical Engineering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicon tube</td>
			<td>IFK Isofluor, Germany</td>
			<td>custom-made product</td>
			<td>diameter 500 &mu;m, section thickness 100 &mu;m, polytetrafluorethylene catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ/X9</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>standard tip curved 0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 10%</td>
			<td>CEVA, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 2%</td>
			<td>Medistar, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthene</td>
			<td>Bayer, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Aesculap, Germany</td>
			<td>OC 498 R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/0 Silk</td>
			<td>Seraflex</td>
			<td>IC 108000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7/0 Silk</td>
			<td>Seraflex</td>
			<td>IC 1005171Z</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guide-wire</td>
			<td>Abbott Vascular</td>
			<td>1001782-HC</td>
			<td>0.014-inch angioplastie guide-wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Michel suture clips</td>
			<td>Aesculap, Germany</td>
			<td>BN507R</td>
			<td>7.5 x 1.75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Michel Forcep</td>
			<td>Aesculap, Germany</td>
			<td>BN730R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a murine model of stent implantation in the carotid artery for the study of restenosis

Apesar dos progressos consideráveis ​​realizados no desenvolvimento de stents nas últimas décadas, as doenças cardiovasculares permanecem a principal causa de morte nos países ocidentais. Além dos benefícios oferecidos pelo desenvolvimento de diferentes stents farmacológicos, a revascularização coronária tem também os riscos que ameaçam a vida de trombose intra-stent e reestenose. A pesquisa sobre novas estratégias terapêuticas é prejudicada pela falta de métodos apropriados para estudar o implante do stent e os processos de reestenose. Aqui, descrevemos um procedimento rápido e acessível de implante de stent na artéria carótida do rato, que oferece a possibilidade de estudar em uma forma conveniente os mecanismos moleculares da remodelação da embarcação e os efeitos de diferentes revestimentos de drogas.

<ol><li> A implantação de uma miniatura nitinol stent na artéria carótida esquerda de ratos leva 25-30 min e mostra uma taxa de mortalidade de 10%, principalmente devido ao dano do navio durante a intervenção. Uma melhor taxa de sobrevivência é observada em ratinhos com um peso superior a 25 g, no tempo da implantação do stent (taxa de mortalidade de 5%). Portanto, nós escolhemos para os ratos de implantação, com um peso entre 25-27 g. Após a cirurgia, os ratos recuperar da anestesia dentro de 2-5 min e sem deficiências físicas, como por exemplo, paralisia, são observados. Micro-Tomografia Computadorizada (Micro-CT) realizada uma semana após a implantação do stent mostraram que os stents não são deslocadas pelo fluxo de sangue (Figura 1C). Infelizmente, a análise de formação de neoíntima na estas imagens não é possível, devido aos artefactos de metal derivados (Figura 1D, 1E). </li><li> Nós não observamos qualquer navio ou danos endoteliais da área unstented da embarcação, imediatamente abaixo do stent, Detectada pela histológico (Figura 2A) e por coloração específica para endotélio (Figura 2B, anti-ratinho CD31 anticorpo). Para uma melhor visão, a seção foi escaneado usando um microscópio de varredura a laser de dois fótons (Figura 2B, 2C). </li><li> No vaso com stent, uma dilatação permanente de 15% é detectada (razão de stent: artéria, 1,15:1) por ratos com um peso entre 25-27 g. A formação da neoíntima e formação de trombos pode ser analisada por colorações histológicas clássicos (por exemplo Hematoxilina-eosina, Giemsa, Movat, Azul de Toluidina, Masson Trichrom-Goldner, a Figura 3A, 3B). Uma vez que a lâmina externa e interna não são visíveis mais, tamanho da placa foi calculado como a diferença entre o externo e as áreas luminais (média de área de placa: 234.566 ± 3,315 mM 2, a média de área luminal: 12,036 ± 2,662 mM 2). Circunferência externa também foi medido (média de 1799 ± 14 mm). Para a análise dacomposição celular, as secções precisam ser deplastified e coradas com marcadores específicos. Para a re-endotelização, foi utilizado um anticorpo anti-CD31 conjugado com Cy3 e para a proliferação de células do músculo liso de um anticorpo anti-SMA-FITC conjugado (Figura 3C). Reendotelização foi calculado como percentagem de CD-31 coradas positivamente para a superfície luminal totais (média: 23,07 ± 3,14%), uma semana após a implantação do stent. </li></ol> É claro que um número ilimitado de coloração específica é possível, dependendo da experiência de cada laboratório. Análise da miosina de cadeia pesada, para uma melhor caracterização das células musculares lisas, mas também a análise de células infiltradas (monócitos, linfócitos), ou colorações para diferentes citoquinas inflamatórias também podem ser realizadas, de acordo com o objectivo do estudo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50233/50233fig1highres.jpg" sr<html> c = &quot;/ files/ftp_upload/50233/50233fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Visão esquemática do procedimento cirúrgico (A). O fluxo de sangue é interrompido, ligando os nós na artéria carótida interna e da artéria carótida externa firmemente proximal, bem como, puxando o nó em torno da artéria carótida comum. O tubo de silicone contendo o stent é introduzido na artéria carótida externa através de uma pequena incisão na artéria carótida externa. Após o stent atinge a posição desejada, o tubo de silicone é puxado para trás por cima do arame de guia e permite a expansão com memória de forma do stent. Micro-CT imagens que mostram a posição do stent, uma semana após a implantação cirúrgica (B). Devido aos artefactos materiais derivados, uma análise do crescimento da neointima não é possível (C, D). 3fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50233/50233fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Unstented área do recipiente não é afectada pelo procedimento cirúrgico, como mostrado por Azul de Toluidina (A) e CD31 coloração específica de endotelial (B, C). <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50233/50233fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50233/50233fig3.jpg" /> Figura 3. Análise da placa pode ser realizada por colorações histológicas clássicos (por exemplo Masson Trichrom-Goldner) (A). O trombo organizados pode ser detectada por deposição de fibrina cor preta no interior do neo-intima, em alguns casos, uma completa oclusão do vaso é observada (B). Re-Endotelização (Cy3, vermelho) ou a proliferação de células musculares lisas (FITC, verde) foi detectada pela técnica de imunofluorescência dupla, usando marcadores específicos.A contracoloração foi realizada com 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, azul) (C). Percebemos uma completado reendotelização das hastes do stent (seta para a esquerda, o dobro) em relação a um incompleted luminal reendotelização (direita, seta simples).

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A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Um modelo de implante de stent na artéria carótida do rato é descrito. Comparado com outros métodos similares, este procedimento é muito rápido, simples e acessível, oferecendo a possibilidade de estudar em uma forma conveniente a reação da parede vascular para diferentes stents farmacológicos e os mecanismos moleculares de reestenose.

Um modelo murino de implante de stent na artéria carótida para o Estudo da reestenose

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

25.2K visualizações.  RWTH Aachen University. Um modelo de implante de stent na artéria carótida do rato é descrito. Comparado com outros métodos similares, este procedimento é muito rápido, simples e acessível, oferecendo a possibilidade de estudar em uma forma conveniente a reação da parede vascular para diferentes stents farmacológicos e os mecanismos moleculares de reestenose.

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Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

Biomarcadores em um modelo animal para Revelando correlatos neurais, hematológica e Comportamental do TEPT

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Medicina

Human Internal Mammary Artery (IMA) Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel stenting are crucial for translational approaches1,2.
The commonly used animal models include mice, rats, rabbits, and pigs3-5. However, the translation of these models into clinical settings remains difficult, since those biological processes are already studied in animal vessels but never performed before in human research models6,7. In this video we demonstrate a new humanized model to overcome this translational gap. The shown procedure is reproducible, easy, and fast to perform and is suitable to study the development of intimal hyperplasia and the applicability of diverse stents.
This video shows how to perform the stent technique in human vessels followed by transplantation into immunodeficient rats, and identifies the origin of proliferating cells as human.

Human Internal Mammary Artery IMA Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

This video shows a model to study the development of intimal hyperplasia after stent deployment using a human vessel (IMA) in an immunodeficient rat model.

Humanos da artéria mamária interna (IMA) Transplante e implante de stent: um modelo humano para estudar o desenvolvimento de reestenose intra-stent

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel ...

Training a Sophisticated Microsurgical Technique: Interposition of External Jugular Vein Graft in the Common Carotid Artery in Rats

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in peripheral arterial bypass surgery as well as in arteriovenous fistulas.1-5 The experimental procedure of vein graft interposition in the common carotid artery by using the cuff-technique has been applied in several research projects to examine the aetiology of neointimal hyperplasia and therapeutic options to address it. 6-8 The cuff prevents vessel anastomotic remodeling and induces turbulence within the graft and thereby the development of neointimal hyperplasia.
Using the superior caval vein graft is an established small-animal model for venous arterialization experiment.9-11 This current protocol refers to an established jugular vein graft interposition technique first described by Zou et al., 9 as well as others.12-14 Nevertheless, these cited small animal protocols are complicated.
To simplify the procedure and to minimize the number of experimental animals needed, a detailed operation protocol by video training is presented. This video should help the novice surgeon to learn both the cuff-technique and the vein graft interposition. Hereby, the right external jugular vein was grafted in cuff-technique in the common carotid artery of 21 female Sprague Dawley rats categorized in three equal groups that were sacrificed on day 21, 42 and 84, respectively. Notably, no donor animals were needed, because auto-transplantations were performed. The survival rate was 100 % at the time point of sacrifice. In addition, the graft patency rate was 60 % for the first 10 operated animals and 82 % for the remaining 11 animals. The blood flow at the time of sacrifice was 8&plusmn;3 ml/min. In conclusion, this surgical protocol considerably simplifies, optimizes and standardizes this complicated procedure. It gives novice surgeons easy, step-by-step instruction, explaining possible pitfalls, thereby helping them to gain expertise fast and avoid useless sacrifice of experimental animals.

Neointimal hyperplasia is the primary cause of stenosis in arterialized veins. We propose a new protocol whereby the right external jugular vein is grafted using the cuff technique in the common carotid artery of Sprague Dawley rats. The survival rate was 100 % at the time point of sacrifice.

Treinar um técnica microcirúrgica sofisticado: Interposição de enxerto de veia jugular externa na artéria carótida comum em ratos

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms at work during MI and developing effective therapeutic approaches requires methodology to reproducibly simulate the clinical incidence and reflect the pathophysiological changes associated with MI. Here, we describe a surgical method to induce MI in mouse models that can be used for short-term ischemia-reperfusion (I/R) injury as well as permanent ligation. The major advantage of this method is to facilitate location of the left anterior descending artery (LAD) to allow for accurate ligation of this artery to induce ischemia in the left ventricle of the mouse heart. Accurate positioning of the ligature on the LAD increases reproducibility of infarct size and thus produces more reliable results. Greater precision in placement of the ligature will improve the standard surgical approaches to simulate MI in mice, thus reducing the number of experimental animals necessary for statistically relevant studies and improving our understanding of the mechanisms producing cardiac dysfunction following MI. This mouse model of MI is also useful for the preclinical testing of treatments targeting myocardial damage following MI.

We introduce a surgical method to induce experimental ischemia/reperfusion (I/R) injury to simulate myocardial infarction (MI) in mouse models that allows for more clarity in positioning of the ligation on the left anterior descending artery (LAD) to increase the reproducibility of MI experiments in mice.

Um modelo murino de isquemia-reperfusão, através da ligadura da artéria Descendente Anterior Esquerda

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

Infusões artéria carótida para farmacocinéticas e farmacodinâmicas Análise de taxanos em Ratos

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Murine Model of Femoral Artery Wire Injury with Implantation of a Perivascular Drug Delivery Patch

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. While these therapies lead to the rapid restoration of blood flow, these technologies remain limited by restenosis in the case of bare metal stents and angioplasty, or reduced healing and possibly enhanced risk of thrombosis in the case of drug eluting stents. A key pathophysiological mechanism in the formation of restenosis is intimal hyperplasia caused by the activation of vascular smooth muscle cells and inflammation due to arterial stretch and injury. Surgeries that induce arterial injury in genetically modified mice are useful for the mechanistic study of the vascular response to injury but are often technically challenging to perform in mouse models due to the their small size and lack of appropriate sized devices. We describe two approaches for a surgical technique that induces endothelial denudation and arterial stretch in the femoral artery of mice to produce robust neointimal hyperplasia. The first approach creates an arteriotomy in the muscular branch of the femoral artery to obtain vascular access. Following wire injury this arterial branch is ligated to close the arteriotomy. A second approach creates an arteriotomy in the main femoral artery that is later closed through localized cautery. This method allows for vascular access through a larger vessel and, consequently, provides a less technically demanding procedure that can be used in smaller mice. Following either method of arterial injury, a degradable drug delivery patch can be placed over or around the injured artery to deliver therapeutic agents.

We describe a surgical technique that produces wire injury in the femoral artery of mice to induce neointimal hyperplasia to serve as a model testing system for the perivascular delivery of therapeutic compounds for the inhibition of restenosis.

Modelo murino de artéria femoral Injury fio com a implantação de uma droga patch Entrega perivascular

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. ...

A Murine Model of Arterial Restenosis: Technical Aspects of Femoral Wire Injury

Cardiovascular disease caused by atherosclerosis is the leading cause of death in the developed world. Narrowing of the vessel lumen, due to atherosclerotic plaque development or the rupturing of established plaques, interrupts normal blood flow leading to various morbidities such as myocardial infarction and stroke. In the clinic endovascular procedures such as angioplasty are commonly performed to reopen the lumen. However, these treatments inevitably damage the vessel wall as well as the vascular endothelium, triggering an excessive healing response and the development of a neointimal plaque that extends into the lumen causing vessel restenosis (re-narrowing). Restenosis remains a major cause of failure of endovascular treatments for atherosclerosis. Thus, preclinical animal models of restenosis are vitally important for investigating the pathophysiological mechanisms as well as translational approaches to vascular interventions. Among several murine experimental models, femoral artery wire injury is widely accepted as the most suitable for studies of post-angioplasty restenosis because it closely resembles the angioplasty procedure that injures both endothelium and vessel wall. However, many researchers have difficulty utilizing this model due to its high degree of technical difficulty. This is primarily because a metal wire needs to be inserted into the femoral artery, which is approximately three times thinner than the wire, to generate sufficient injury to induce prominent neointima. Here, we describe the essential surgical details to effectively overcome the major technical difficulties of this model. By following the presented procedures, performing the mouse femoral artery wire injury becomes easier. Once familiarized, the whole procedure can be completed within 20 min.

The mouse femoral artery wire injury model of restenosis is technically challenging. In this protocol we show the key technical details essential for successfully performing wire injury to induce consistent&#160;neointima for studies of restenosis.

Um modelo murino de Arterial Restenosis: Aspectos Técnicos do Femoral Injury Fio

Cardiovascular disease caused by atherosclerosis is the leading cause of death in the developed world. Narrowing of the vessel lumen, due to ...

Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, obesity and diabetes. Accordingly, when evaluating therapies for stroke in animals, it is important to select a model with excellent face validity. Ischemic stroke accounts for 80% of all strokes, and the majority of these occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA), often inducing infarcts that affect the sensorimotor cortex, causing persistent plegia or paresis on the contralateral side of the body. We demonstrate in this video a method for producing ischemic stroke in elderly rats, which causes sustained sensorimotor disability and substantial cortical infarcts. Specifically, we induce permanent distal middle cerebral artery occlusion (MCAO) in elderly female rats by using diathermy forceps to occlude a short segment of this artery. The carotid artery on the ipsilateral side to the lesion was then permanently occluded and the contralateral carotid artery was transiently occluded for 60 min. We measure the infarct size using structural T2-weighted magnetic resonance imaging (MRI) at 24 hr and 8 weeks after stroke. In this study, the mean infarct volume was 4.5% &#177; 2.0% (standard deviation) of the ipsilateral hemisphere at 24 hr (corrected for brain swelling using Gerriet&#8217;s equation, n = 5). This model is feasible and clinically relevant as it permits the induction of sustained sensorimotor deficits, which is important for the elucidation of pathophysiological mechanisms and novel treatments.

Here we present a protocol to produce permanent distal middle cerebral artery occlusion in elderly female rats with simultaneous occlusion of the carotid arteries to generate large cortical infarcts and sustained deficits. We show confirmation of the lesion size using structural MRI at 24 hr and 8 weeks after stroke.

Realizando Permanente Distal Oriente cerebral com carótida comum Oclusão da Artéria em ratos idosos para estudar Cortical Isquemia com Deficiência Sustentada

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves focal endothelial-selective transgenesis, thereby allowing an investigator to determine the biological roles of endothelial-expressed transgenes and to quantify the in vivo transcriptional activity of DNA sequences in large artery endothelial cells. The method uses surgical isolation of rabbit common carotid arteries and an arteriotomy to deliver a transgene-expressing viral vector into the arterial lumen. A short incubation period of the vector in the lumen, with subsequent aspiration of the lumen contents, is sufficient to achieve efficient and durable expression of the transgene in the endothelium, with no detectable transduction or expression outside of the isolated arterial segment. The method allows assessment of the biological activities of transgene products both in normal arteries and in models of human vascular disease, while avoiding systemic effects that could be caused either by targeting gene delivery to other sites (e.g. the liver) or by the alternative approach of delivering genetic constructs to the endothelium by germ line transgenesis. Application of the method is limited by the need for a skilled surgeon and anesthetist, a well-equipped operating room, the costs of purchasing and housing rabbits, and the need for expertise in gene-transfer vector construction and use. Results obtained with this method include: transgene-related alterations in arterial structure, cellularity, extracellular matrix, or vasomotor function; increases or reductions in arterial inflammation; alterations in vascular cell apoptosis; and progression, retardation, or regression of diseases such as intimal hyperplasia or atherosclerosis. The method also allows measurement of the ability of native and synthetic DNA regulatory sequences to alter transgene expression in endothelial cells, providing results that include: levels of transgene mRNA, levels of transgene protein, and levels of transgene enzymatic activity.

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

This method is to introduce a transgene into the endothelium of rabbit carotid arteries. Introduction of the transgene allows the assessment of the biological role of the transgene product either in normal arteries or disease models. The method is also useful for measuring activity of DNA regulatory sequences.

Na Vivo Transferência de genes para o endotélio da artéria carótida comum de coelho

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

A Rabbit Model of Durable Transgene Expression in Jugular Vein to Common Carotid Artery Interposition Grafts

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, intimal hyperplasia, and atherosclerosis. The goal of this article is to demonstrate a method for placing bilateral venous interposition grafts in a rabbit, then transducing the grafts with a gene transfer vector that achieves durable transgene expression. The method allows the investigation of the biological roles of genes and their protein products in normal vein graft homeostasis. It also allows the testing of transgenes for the activities that could prevent vein graft failure, e.g., whether the expression of a transgene prevents the neointimal growth, reduces the vascular inflammation, or reduces atherosclerosis in rabbits fed with a high-fat diet. During an initial survival surgery, the segments of right and left external jugular vein are excised and placed bilaterally as reversed end-to-side common carotid artery interposition grafts. During a second survival surgery, performed 28 days later, each of the grafts is isolated from the circulation with vascular clips and the lumens are filled (via an arteriotomy) with a solution containing a helper-dependent adenoviral (HDAd) vector. After a 20-min incubation, the vector solution is aspirated, the arteriotomy is repaired, and flow is restored. The veins are harvested at time points dictated by individual experimental protocols. The 28-day delay between the graft placement and the transduction is necessary to ensure the adaptation of the vein graft to the arterial circulation. This adaptation avoids rapid loss of transgene expression that occurs in vein grafts transduced before or immediately after grafting. The method is unique in its ability to achieve durable, stable transgene expression in grafted veins. Compared to other large animal vein graft models, rabbits have advantages of low cost and easy handling. Compared to rodent vein graft models, rabbits have larger and easier-to-manipulate blood vessels that provide abundant tissue for analysis.

This method describes the placement of interposition vein grafts in rabbits, the transduction of the grafts, and the achievement of durable transgene expression. This allows the investigation of physiological and pathological roles of transgenes and their protein products in grafted veins, and testing of gene therapies for vein graft disease.

Um modelo de coelho da expressão do Transgene durável na veia Jugular para enxertos de interposição da artéria carótida comum

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, ...