Gostaríamos de agradecer à Facilidade Microscopia Óptica Avançada no Hospital Princess Margaret, em particular James Jonkman por sua assistência na configuração inicial de canais no microscópio 2Photon. Os autores gostariam de agradecer a orientação espaço-temporal e amplificação da resposta do programa de radiação (STTARR) e suas agências de fomento filiadas. Agradecemos ao Dr. Peter Tonge, Dr.Iacovos Michael e Dr.Andras Nagy para fornecer os plasmídeos VEGFTrap e para suas correções manuscritas e feedback. O contínuo apoio e discussão de funcionários da BTRC tem sido inestimável e gostaríamos de comemorar Dr.Abhijit Guha por sua contribuição científica. O trabalho foi financiado pelo NIH CIHR e subvenções.

TODO O TRABALHO animal tem sido realizado sob um cuidado ANIMAL E COMITÊ DE USO protocolo aprovado e executado em conformidade com todas as orientações pertinentes, REGULAMENTOS e as agências reguladoras. Para referência Tabela de solução de problemas 2. 1. Medula Óssea Reconstituição (Opcional) Figura 1 (30 min preparação, 5 min por mouse) Todos cirurgia deve ser realizada utilizando uma técnica asséptica rigorosa com material esterilizado em autoclave. Um camundongo doador vai reconstituir três ratos de acolhimento. <ol><li> Anestesiar destinatário camundongos NODscid e posição, com chumbo para proteger a cabeça, dentro do centro irradiador da Gammacell 40 &#39;opressor&#39;. </li><li> Irradiar camundongos NODscid com 2,5 Gy de irradiação corporal total (TBI). </li></ol> Passo crítico: Otimização do TCE pode ser necessária devido à variação na dose necessária para suficiente imune do hospedeiro ceesgotamento ll em diferentes cepas do mouse. Ponto Pausa: ratos de host podem ser irradiados com antecedência, mas deve ser usado dentro de 24 horas de irradiação. <ol start="3"><li> Eutanásia camundongos doadores de acordo com as orientações do comitê de cuidados de animais institucionais. Limpe os membros posteriores e remover a tíbia eo fêmur de ambos, tirando todo o excesso de tecido dos ossos (Figuras 1ai, 1aii). </li></ol> Passo crítico: ossos da fíbula não são viáveis ​​para o uso devido a lume muito estreitas. <ol start="4"><li> Remover placas finais de ambas as extremidades de quatro ossos extraídos e lave-os com uma agulha 22 G e 1 ml de PBS estéril até que eles são brancos na aparência (Figura 1aiii). Tabela de Referência 2. </li><li> Misture a medula óssea (BM) suspensão extraído bem e tirar 300 ml em três 27 agulhas de tuberculina. BM extraído deve conter cerca de 2 x 10 7 células eé suficiente para 3 de acolhimento ratos reconstituições. Tabela de Referência 2. </li><li> Injectar a suspensão na veia lateral da cauda de três ratinhos NODscid previamente irradiados a partir do passo 1.1 (Figura 1b). Tabela de Referência 2. </li></ol> ATENÇÃO: Para verificar a esterilidade da BM injetado recomendamos chapeamento o restante BM e cultura por 24 horas para verificar se há infecção. Principal causa de morte neste momento é a infecção em camundongos recém-reconstituída. 2. Geração Janela intracraniana - Figura 2 (30 min por mouse) Todos cirurgia deve ser realizada utilizando uma técnica asséptica rigorosa com equipamentos esterilizados em autoclave e sob uma lâmpada de calor para manter os animais quentes (Figura 2A). <ol><li> Anestesiar receptores ratinhos NODscid com IACUC aprovado anestésico, a injecção IP de Avertin a 0,5 mg / g e de posição, com a vantagem de proteger a cabeça, dentro da área doGammacell 40 &#39;opressor&#39; irradiador. Remover o cabelo do couro cabeludo. Além disso aplicar o gel rasgo para evitar a desidratação da córnea. </li><li> Couro cabeludo limpo primeiro com solução de betadine e em seguida com álcool, em seguida, fazer uma incisão desde o ponto médio das orelhas até acima dos olhos. Remover couro cabeludo 3 milímetros de cada lado da primeira incisão, expondo o crânio e marcos da superfície do crânio (Figura 2BI). </li><li> Eleve o periósteo, injetando lidocaína a 2%: solução de adrenalina e dissecar longe da superfície do crânio (Figura 2Bii). </li><li> Usando 2,7 milímetros trefina, enfraquecer a mm círculo do crânio de 2,7 sobre o córtex do hemisfério direito entre lambda e bregma. Não penetram o osso com a broca (Figura 2Biii). Referência Tabela 2. </li></ol> Passo crítico: se broca passa através do crânio superfície do cérebro serão danificados que influenciam os resultados com tra adicionalUMA. Além disso o sangramento excessivo irá ocorrer impedindo que uma janela transparente de ser gerada. <ol start="5"><li> Retire a retalho ósseo enfraquecido, usando uma pinça de dissecção e gancho dental e força deliberada, mas controlada (Figura 2Biii). </li><li> (Opcional) Se olhando para a patologia tumoral, injectar escolhidas linhas celulares tumorais (com o gene repórter fluorescente) no centro da janela gerado na etapa 2.5. <ol><li> Coloque 10 ml 30 G Hamilton seringa com suspensão de células de carga e agulha em um quadro estereotáxico. Passo crítico: O número de células necessitará de ser optimizado para as células tumorais em uso e cronologia do crescimento necessária. Para U87 culturas usamos 2 x 10 5 células em 10 mL por mouse. </li><li> Carregar rato sobre a armação estereotáxica digitais alinhar a agulha para o ponto central da janela gerado centro. </li><li> Agulha menor até tocar a superfície cortical e redefinir as coordenadas digital. </li><li> Baixoer a agulha a 3,2 mm para o tecido cortical e injectar a 3 mm de profundidade. </li><li> Retrair agulha lentamente, em seguida, remover o mouse do quadro. Passo crítico: Injectar solução sobre a duração de 1 min e deixe a agulha na posição após a injeção para garantir reduzido o fluxo de retorno. Passo fundamental: Se a hemorragia menor é encontrado irrigar com soro fisiológico estéril para 1-5 min para parar o sangramento superficial. Prossiga com as etapas subseqüentes. </li></ol></li><li> Humedecer superfície do cérebro com uma gota de PBS estéril para manter o tecido cerebral irrigado. </li><li> Flutuador lamela de 3 mm sobre a superfície cerebral para vedar totalmente em torno da janela de 2,7 milímetros gerado. Tabela de Referência 2. </li><li> Crânio circundante osso seco, em seguida, aplicar Vetbond para todo o crânio exposto ao tecido do couro cabeludo reseal ao osso do crânio e da lamela no lugar. NÃO aplique um excesso, uma vez que vai vazar no vidro e diminuir o potencial de imagem. </li><li> Mix fresco em pó acrílico dental e da solução, cerca de 30% (w / v), e aplicar por cima do Vetbond. Para assegurar uma boa vedação sobrepõem-se o acrílico ligeiramente sobre o bordo lamela de vidro (Figura 2Biv). Referência Tabela 2. </li></ol> ATENÇÃO: Dental acrílico é extremamente perigoso, por isso recomendamos o uso de luvas e máscara durante os procedimentos. Passo crítico: acrílico dental necessita de permanecer flexível durante a moldagem para assegurar uma boa vedação e reduzir o excesso. Acumulação de acrílico na janela vai borrar as imagens. <ol start="11"><li> Permitir ratos para recuperar em uma gaiola quente. </li></ol> 3. Radiação estereotáxica (Opcional) - Figura 3 (25 min por mouse) Variações vai existir nas diferentes irradiadores utilizados e, como tal, será necessária optimização. Usamos um irradiador projetado. <ol><li> Anestesiar ratosutilizando isoflurano em 4% para indução seguido de 1,5-2% em todo o processo com 0,5-1 litro O 2 a min, e lugar para restrainer cabeça personalizado dentro do irradiador estereotáxica (Figura 3ai). </li><li> Obter um 360 ° tomografia computadorizada de feixe cônico com o tubo de raios-X rodando a 40 kVp e 0,05 mA através de um filtro de alumínio 2 mm. Utilizar a imagem para guiar o movimento da fase, orientando a radiação isocentre ao hemisfério direito garantindo que é central no sentido ventral dorsal. </li><li> Insira o colimador hemisférica de 8 mm x 11 mm bloco. </li></ol> Passo crítico: Collimators pode ser projetado para muitas configurações diferentes e por isso pode ser melhorado para incluir e excluir diferentes partes do cérebro. 8 milímetros x 11 mm define uma área hemisférica do cérebro. <ol start="4"><li> Obtenção de imagens ortogonais individuais CT tanto de cima (AP) e inferior (PA) através do colimador para aumentar ainda mais o posicionamento do cérebro, Anatestruturas ósseas omical pode ser usado para a reprodutibilidade. </li><li> O filtro de alumínio para um tratamento de cobre 0,93 milímetros de câmbio filtrar e administrar a metade da dose de radiação desejada com o tubo de raios X funcionando com 225 kVp e 13 mA a partir do topo num sentido AP. </li><li> Retorno pórtico para a posição inferior e administrar a segunda metade da dose de radiação de novo com o tubo de raios X funcionando com 225 kVp e 13 mA forma o fundo numa direcção PA. </li></ol> Passo crítico: É essencial para irradiar a partir de ambas as extremidades superior e inferior para reduzir o gradiente de temperatura ambiente através do tecido do cérebro, mas também ajuda o alinhamento do isocentre ao centro do cérebro. 4 In vivo Two Photon Laser Microscopy -. Figura 3 (1-3 horas por sessão) Variações vai existir nas diferentes microscópios usados ​​e, como tal, será necessária optimização. Nós usamos uma Carl Zeiss LSM510 META Laser Scanning Confocal microscópio. <ol><li> Anestesiar ratos com IACUC aprovado anestésico, a injecção IP de Avertin a uma janela de 0,5 mg / g, e limpo utilizando álcool spray. </li><li><ol class="ualpha"><li> (Opcional) Injectar marcaram vascular corante 5-10 minutos antes da imagiologia, na veia da cauda antes da imagiologia. Alexa647-Dextrano usado a 0,35 mg / g ou APC-CD31 usado a 0,2 ug / g. Ver Tabela 2. </li><li> (Opcional) Injectar fluoresceína através da veia da cauda a uma dose de 7,7 mg / kg, 5 minutos antes da imagiologia, para delinear tumor. Tabela de Referência 2. </li></ol></li><li> Canais de instalação no microscópio confocal, conforme determinado pelo fluorocromo utilizado no ratinho quimérico gerado. Tabela 1 mostra os canais descritas neste modelo. </li><li> Inverter o mouse no palco microscópio móvel e estabilizar a cabeça em posição com plasticina moldável. (Figura 3Aii) Tabela de Referência 2. </li></ol> &lt;p = classe &quot;jove_content&quot;&gt; passo crítico: A ICW deve ser perpendicular ao ponto de laser e, como tal, devem ser posicionados na horizontal para assegurar a imagiologia é a ideal. <ol start="5"><li> Ligue primeiro laser de canal e usada para posicionar-se no centro da ICW. </li><li> Use lente de 5x e levar uma imagem de toda a janela para usar como um mapa para imagens de alta resolução mais. </li><li> Imagem deve ser efectuada utilizando 10X e 20X lentes &quot;de longo alcance&quot; para obter a melhor qualidade de imagem. </li></ol> Passo crítico: Canais e os objectivos da 2PLM deve ser configurado usando células manipuladas in vitro, antes da imagem de modelos murinos para garantir que destacar o fluorocromo correta. <table border="1"><tbody><tr><td> Fluorocromo </td><td> PCP </td><td> GFP / Fluorescein / FITC </td><td> mCherry / RFP / DsRed </td><td> APC / Alexa647 </td><td> SHG autofluorescência </td></tr><tr><td> Laser de excitação </td><td> 458 nm </td><td> 488 nm </td><td> 543 nm </td><td> 633 nm </td><td> Chameleon laser de 820 nm </td></tr><tr><td> Coleção Filtro </td><td> 480-520 nm </td><td> 500-550 nm </td><td> 565-615 nm </td><td> 650-710 nm </td><td> 390-465 nm </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Guias de Instalação Fluorocromo. Para que o usuário veja o laser de excitação e colecionador de espectros de emissão utilizados para cada um dos canais disponíveis no modelo.

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Os autores não têm nada a revelar.

Os três canais descritas todas as imagens até agora são intercambiáveis ​​por três marcadores de interesse em outros modelos e folhas de pesquisadores com um inestimável conjunto de ferramentas para procurar uma numerosos tipos de células e interações. O planeamento é necessário para assegurar que todos os marcadores e tipos de células integraram com sucesso uma molécula repórter fluorescente em um canal diferente. Além dos três canais padrão usados ​​aqui que também foram capazes integrar um quarto canal PCP (Figura 4A) e uma base de colagénio SHG canal 7 (Figura 4B). Isto prolonga a possibilidade de olhar para interacções celulares in vivo e, além disso permite a de utilizador para realizar a mistura da população para estudar as interacções célula-célula específicas mantendo dois canais para outros marcadores. Por exemplo, nós olhamos células tumorais (RFP) e as células-tronco cancerosas (PCP) na proporção de 1:3 com um interesse em comparar o seu intratuminterações orais (Figura 4A). Observou-se que sete dias pós-implantação da população mista a relação foi confirmada e duas populações de células ainda podia ser visto. O canal PCP fornece problemas técnicos, devido à sobreposição com o canal de GFP em ambos os espectros de excitação e de emissão e, como tal, o pós-processamento de imagem requer a definir o verdadeiro PCP + células daqueles que estão efectivamente a GFP +. Pós-processamento de imagem pode ser efectuada nos microscópios 2-photon construídos em software Zeiss LSM directamente através do qual, a GFP é subtraída da imagem a partir da imagem resultante PCP em células PCP verdadeiros sendo deixadas para trás (Figura 4A). A premissa para a relação de subtração é dependente de imagens igualmente brilhantes e é devido ao PCP do laser (458 nm) fluorescentes tanto PCP e células GFP, enquanto o GFP a laser (488 nm) é muito alta para fluorescência das células PCP. Além PCP também foram capazes de utilizar configurações previamente publicados para olhar o SHGníveis e assim retratam as fibras de colagénio que constituem a membrana basal em torno vasculatura, (Figura 4B). Outra adaptação deste modelo foi feita vantagem de uma pequena irradiador animais construído sob encomenda, que tem a capacidade de utilizar a radiação guiada estereotáxico para irradiar secções do tecido tão pequena como 2 mm de diâmetro. Visando a janela com a irradiação é possível olhar para a radiação tem efeito sobre o tecido subjacente. Temos um estudo publicado recentemente olhando para a radiação tem efeito sobre o tecido cerebral normal relativamente ao recrutamento de BMDCs à vasculatura, olhando especificamente para o seu papel em modificações pós-radiação dos tecidos. Descobrimos que o recrutamento dos BMDCs era tanto tempo e dose-dependente no tecido normal 11. É possível estudar os mecanismos de fornecimento e integração de terapêuticas que fornecem o medicamento é marcado com um marcador fluorescente. Durantenossa pesquisa, temos sido capazes de controlar a produção de VEGFTrap, uma droga anti-angiogênico que bloqueia toda a sinalização de VEGF no local de produção 25. Ao modificar geneticamente as nossas células tumorais para expressar o gene VEGFtrap juntamente com um IRES para EGFP (Figura 4ci) e usando RFP &#39;doador&#39; BM fomos capazes de a imagem da EGFP: produção VEGFtrap, interação BMDC e vasculatura simultaneamente (Figura 4Cii). Este resultado demonstra a versatilidade do modelo e os canais disponíveis. Também é possível olhar na cinética do fármaco, devido à promessa de resolução de uma única célula. Fluoresceína (GFP +) é utilizado para delinear os tumores durante a cirurgia para assegurar a ressecção máxima é atingida 26. Por injecção intravenosa de imagem, embora seja possível demonstrar que a delimitação não ocorre através da absorção activa da fluoresceína nas próprias células do tumor, mas em vez disso, através da recolha do fármaco para a área do estroma com o tempo, visto pela ausência de co-localização de 10 min após a injecção da fluoresceína (Figura 4D). No geral a nossa estratégia combina técnicas novas e existentes para conseguir uma plataforma experimental original, o que é vantajoso no estudo das interacções celulares dinâmicas. Esta estratégia tem provado ser uma abordagem de valor inestimável para examinar a evolução dinâmica de uma única célula de alta resolução de BMDC, tumor e normal da vascularização do cérebro em resposta à terapêutica, intracraniana. Intravital de imagem podem proporcionar uma melhor compreensão dos reguladores moleculares de recrutamento BMDC, migração e diferenciação na vasculatura do tumor intracraniano cérebro, bem como muitos outros processos dinâmicos adaptáveis ​​a outras áreas de investigação. Factores putativos inibidores que regulam BMDC em combinação com outras estratégias terapêuticas podem ajudar a identificação da temporização precisa de terapias combinatórias. Além disso, esta estratégia pode ser adaptada a muitas futuro projects utilizando não apenas in vivo corantes de coloração intravital, mas também pequenos inibidores moleculares e nanopartículas que são fluorescente etiquetado permitindo aos pesquisadores traçar a distribuição e os padrões de migração de terapêuticas mais específicas, bem como olhar longitudinalmente em sua cinética.

Uma melhor compreensão das alterações estruturais e biológicas que possam surgir no cérebro em resposta a várias patologias, e intervenções terapêuticas é crítico para melhorar estratégias de tratamento. No entanto, um dos desafios atuais em estudar essas mudanças estruturais e biológicos, particularmente em relação às patologias intracranianas, é a inacessibilidade do tecido e da incapacidade para estudar a evolução temporal e progressão dinâmica de mudanças em um cenário em vivo. A geração da &quot;janela&quot; A tecnologia já havia sido bem sucedida em examinar as mudanças dos tecidos moles através do desenvolvimento de tumor 5-7. O desenvolvimento de modelos ICW prova ser mais tecnicamente difícil, devido à necessidade de remover o osso do crânio, sem danificar a instigar a infecção no tecido cerebral subjacente. Trabalhos anteriores tentaram diluir o crânio para visualizar os 8-10 tecido no entanto, a produção de alta resolução clara imidades remoção completa do osso do crânio é necessário 11. Repita a longo prazo de imagem (30 dias +) só recentemente se tornou uma opção viável através de imagens 1,11, prazos mais curtos anteriormente foram estudados 5. Durante a última década, um objectivo importante tem sido a elucidar a origem de estímulos patológicos seguintes neo-vascularização, em particular, em resposta à formação e progressão tumoral, para fornecer novos alvos terapêuticos para o tratamento de tumores. Muita controvérsia continua em torno da fonte de nova vasculatura no cérebro durante o desenvolvimento do tumor ou a radiação seguinte. Tradicionalmente, tem sido considerado vascularização ocorrer através de angiogénese, um processo pelo qual novos vasos se formam a partir do surgimento de vasos pré-existentes 12. Estudos mais recentes, no entanto, sugerem que o processo embrionário anteriormente assumido de vasculogénese podem jogar um papel mais importante na formação de vasculatura patológico. Vasculogenesis envolve o recrutamento dos homólogos angioblast adultas da medula óssea, o que por sua vez são, então, envolvidos directamente na formação de novo endotélio dos vasos 12-14. Acumulando as evidências indicam que as células precursoras endoteliais são mobilizados da medula óssea para iniciar formação de novo de vaso em resposta a mediadores oncogénicos 15-17. No entanto, esses estudos fornecem evidências contraditórias para a contribuição direta dessas células derivadas da medula óssea (BMDCs) ao endotélio dos vasos com percentual de contribuição variando com o tipo de estímulo patológico e resposta ao tratamento 18-21. Por conseguinte, estabelece métodos experimentais reprodutíveis que permitem elevada resolução de imagem para intravital estudo repetido a longo prazo do processo de integração no BMDC vasculatura do tumor e, em resposta à terapia é valiosa. Técnicas histológicas padrão deixar de fornecer a informação dinâmicamação necessária para determinar a sobrevivência a longo prazo, diferenciação e integração das células que dão origem a neovasculatura e, portanto, não pode demonstrar definitivamente os mecanismos de interacção célula. Mostrámos utilizando a nossa abordagem experimental que existe um grau variável de recrutamento BMDC, tanto após radiação ionizante intracraniana e o crescimento do tumor, um processo de recrutamento que é, no entanto, o local da patologia específica e não uma invasão de todo o tecido intracraniana 11,22. Nós mostramos que o recrutamento segue um padrão sensível vez demonstrado pela imagem repetida de um único animal 11,22. Da mesma forma, imagem in vivo também pode fornecer informações valiosas para o mimetismo das células tumorais através do qual as células tumorais fluorescente etiquetado podem ser visualizados e monitorados com um anticorpo CD31 intra-vital para as células endoteliais para destacar a possibilidade de transdiferenciação de células tumorais para formar diretamente o seu próprio endotélio. <pclasse = &quot;jove_content&quot;&gt; A versatilidade do modelo é reforçada pela capacidade de imagem 4 canais fluorescentes, proporcionando um número de combinações exaustiva para o estudo de diferentes processos celulares e biológicas. Somos capazes de intravitally imagem CFP (azul), GFP (verde), Cereja / RFP (vermelho), e Alexa647/APC (far-vermelho), simultaneamente em um único campo repetidamente ao longo do tempo. Os investigadores podem modificar geneticamente as células para expressar fluorocromos para cada um dos canais, bem como corantes de compra e de anticorpos para realçar as alterações estruturais de interesse particular. Até à data, os corantes e os anticorpos utilizados em estudos incluem CD31 e dextrano que salientam a microvasculatura e das suas alterações no tecido 1,11,23,24, embora utilizados no canal vermelho extremo para este propósito, tanto estão disponíveis para uso na outra canais mencionados. Da mesma forma, outros corantes incluindo Sytox laranja, que irá destacar as áreas de apoptose, e marcadores, como os da empresa VisEn, têm sido specamente projetado para uso in vivo. Para além dos quatro canais fluorescentes utilizadas mencionadas, canal de uma segunda geração de harmónicas (SHG) podem ser adicionados e optimizado para a imagem das fibras de colagénio endógenas do modelo 7, visualizando a membrana basal vascular circundante. Para demonstrar a capacidade de adaptação do nosso modelo, assim como as interacções célula-célula acima citadas, foram capazes de estudar as interacções célula-droga. Nós olhamos inibidores de drogas como AMD3100, um inibidor da SDF-1, e seu papel na sinalização redes envolvidas no recrutamento BMDC 11. Do mesmo modo, temos geneticamente para células U87 xenoenxertos de glioma de expressar VEGFTrap, um inibidor de VEGF 25, em conjunto através de uma IRES para uma molécula de GFP. Usando RFP + BM somos capazes de estudar o papel do VEGF tem sobre o recrutamento de BMDCs na vasculatura. Mais recentemente, têm utilizado o modelo para estudar a cinética de drogas olhando para o MEChanism trás do tumor delinear droga Fluoresceína 26, a um nível celular. Através da utilização de uma encomenda foi construído em casa pequena irradiador de animais que foram capazes de integrar de radiação administrada estereotáxico para avaliar a resposta de ambos os tumores e BMDCs ao tratamento. Através do uso das nossas novas imagens intravital método pesquisadores irão obter insights sobre os unicelulares mudanças em tempo real que ocorrem em diferentes patologias e sistemas, auxiliando na elucidação de muitas características funcionais e biológicos de alterações do tecido.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NODSCID mice</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>001303</td>
			<td>8 week old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B5/EGFP Mice</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>003516</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTB/DsRED mice</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>005441</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tear Gel</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>T296/2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Lidocaine-Epinephrine</td>
			<td>Bimeda MTC</td>
			<td>25SP</td>
			<td>Use neat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self curing acrylic kit</td>
			<td>Bosworth</td>
			<td>166260</td>
			<td>Use ~30% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10K MW Dextran-Alexa647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D22914</td>
			<td>Use @ 0.6 mg/kg in Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-APC</td>
			<td>BDPharmingen</td>
			<td>551262</td>
			<td>Use @ 0.3 mg/kg in Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AK-fluor (Fluorescein) 10%</td>
			<td>AKORN inc.</td>
			<td>NDC 17478-253-10</td>
			<td>Use @ 7.7 mg/kg in Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution</td>
			<td>Purdue Products</td>
			<td>NDC 67618-150</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Tweezers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-402</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Dissection Scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25870-002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305156</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G 0.5 ml TB syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305620</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld Micro-Drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-17</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.7 mm Trephine drillbit</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18004-27</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l 30G Hamilton syringe</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>20909-U</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip 3 mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0720 CS-3R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence goggles</td>
			<td>BLS</td>
			<td>FHS/T01</td>
			<td>Basic head frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>stoelting</td>
			<td>51950</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer for IV injection</td>
			<td>Brain Tree Lifescience</td>
			<td>MTI</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics

Estamos integrados com sucesso previamente estabelecido janela intracraniana (ICW) tecnologia 1-4 com intravital microscopia confocal dois fótons para desenvolver uma plataforma nova que permite a visualização direta de longo prazo da estrutura do tecido mudanças intracraniana. Imagem em uma resolução única célula de uma forma em tempo real fornece informações dinâmicas complementares além do previsto pela análise histológica padrão de ponto final, que analisa apenas as &quot;snap shot&quot; secções de tecido. Estabelecer esta técnica de imagem intravital em camundongos quiméricos fluorescentes, que são capazes de imagem quatro canais fluorescentes simultaneamente. Ao incorporar células marcadas por fluorescência, como a GFP + da medula óssea, é possível rastrear o destino destas células a estudar a migração de longo termo, integração e diferenciação no tecido. Continuação da integração de uma célula repórter secundário, tal como uma linha de tumor de glioma de mCherry, permite a caracterizaçãozação de interacções célula-célula. As mudanças estruturais no microambiente do tecido podem ser destacadas por meio da adição de corantes vitais intra-e anticorpos, por exemplo, CD31, anticorpos marcados e das moléculas de dextrano. Além disso, descrevem a conjugação do nosso modelo de imagens ICW com um animal pequeno micro-irradiador que fornece irradiação estereotáxica, criando uma plataforma através da qual as alterações dinâmicas de tecido que ocorrem após a administração de radiação ionizante pode ser avaliado. Limitações atuais do nosso modelo incluem penetrância do microscópio, que é limitada a uma profundidade de até 900 mM a partir da superfície subcorticais, limitando imagiologia para o eixo dorsal do cérebro. A presença do osso do crânio faz a ICW um processo técnico mais difícil, em comparação com os modelos de câmara mais estabelecidos e utilizados actualmente utilizados para o estudo de tecidos e as almofadas de gordura mamaria 5-7. Além disso, a ICW provides muitos desafios em termos de optimização de imagem.

O passo opcional de reconstituição da BM de ratinhos NODscid deve resultar numa absorção de 80% do &quot;dador&quot; fluorescente BM em 100% dos ratinhos NODscid o &quot;hospedeiro&quot;, no entanto optimização do TCE irá ser necessária para melhorar a reconstituição no outro não -immunocompromsed cepas. Se os ratos são, sem sucesso reconstituído eles vão ficar doentes e morrer rapidamente após o procedimento, os ratos enfraquecidos podem requerer adicional de alimentos e fontes de água. A ICW uma vez terminado deverá ser parecido com o observado na Figura 2Biv. É ideal para ter uma crista de acrílico em torno da lamela de vidro, pois isso dá força para a junção com o crânio. Janelas perfeitos são reprodutíveis e permitir a imagiologia repetido até 8 semanas após a sua produção (Figura 2C). Imagens produzidas por estas janelas óptimos será como as observadas na Figura 3Bi. Imperfeições na geração janela irá produzir imagens de baixaqualidade, por exemplo, bolhas de ar sob a janela irá impedir campos inteiros de exibição que está sendo trabalhada, áreas aparece escuro como o ar impede a gravação a laser (Figura 3Bii). Com excesso de cola e acrílico sobre a lamela haverá um elevado nível de fundo fluorescência e áreas do campo que está sendo apagado, como visto na Figura 3Biii, da mesma forma, se há sujeira nas janelas pequenos pontos de fluorescência de fundo será visível no campo (Figura 3Biv). O sucesso da ICW imagiologia é predeterminado pela integridade da técnica cirúrgica, no entanto, até mesmo ICWS óptimas podem ter problemas durante a sessão de imagem. Como tal, uma gama eo grau de clareza existe nas imagens geradas como pode ser visto na Figura 3. A qualidade de imagem publicação retratado na Figura 3C ocorre quando tudo está ótimo. Embora não seja possível, para todos os ratos, é realista esperar que 80% da imagems gerado para ficar assim. Uma das principais falhas na configuração microscopia corrente é o uso de lasers invertidos. Ratos têm de ser posicionados em suas costas e isso resulta em estresse excessivo e desconforto que pode levar à dificuldade para respirar durante a imagem. Isto produz uma imagem &quot;alinhado&quot; como a respiração interfere com a média que ocorre durante a criação da imagem, pelo que, cada fila de pixels é fotografada e quatro vezes a média dos quatro é apresentado na imagem final. Qualquer movimento durante o cálculo da média, como a causada pela respiração difícil, vai criar um artefato que aparece como uma linha na imagem, como pode ser visto na Figura 3D. Ratos que são insuficientemente anestesiado durante o exame pode encontrar esse problema também. O efeito &quot;alinhado&quot; pode ser diminuída, limitando a imagem média em que, no entanto, este por sua vez irá reduzir a qualidade da imagem e não pode eliminar o problema. Alternativamente, os ratos podem ser reposicionados ou repetida quando a respiração se normalizou. O uso de of um 2PLM verticais negaria este problema como ratos pode ser trabalhada &quot;na posição prona. Um problema adicional com a imagem sobre um 2PLM invertido inclui a acessibilidade limitada para posicionar a ICW uma vez que o ratinho está no microscópio, e isto leva a imagens &#39;segmentados&#39; como as observadas na Figura 3E. Aqui, o laser e lamela não estão posicionados perpendicularmente uma à outra e, como tal, a imagiologia ocorre em um ângulo. Isto resulta na geração de uma imagem de &quot;segmentada&quot;, onde os lados do campo de visão não são gravadas. O problema é resolvido facilmente com o reposicionamento do rato para assegurar a lamela é completamente horizontal uma vez sobre a cabeça de montagem como visto na Figura 3Aii. O modelo apresentado aqui foi usado especificamente para examinar o papel de BMDCs na vascularização do tecido tumoral e demonstra a capacidade de usar três canais diferentes ao mesmo tempo (Cherry, GFP, Far-vermelho - Alexa647 e APC) fazendog PCP e SHG redundante para esta história particular. Fomos capazes de ratinhos da imagem longitudinalmente por até 8 semanas, estudando o recrutamento ea integração de células de MO na vasculatura de um único nível de célula, sem efeitos prejudiciais causados ​​pela janela. Este modelo demonstra a facilidade de coleta de informações dinâmicas sobre a origem e formação da vascularização e da interação de diferentes tipos de células de interesse, previamente perdidos através do ponto final de análise histológica. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Problema </td><td> Raciocínio </td><td> Solução </td></tr><tr><td> 1.4 </td><td> Osso quebrar </td><td> Ferramentas Blunt </td><td> Recolha de medula óssea formar um rato fresco com uma tesoura afiada ou bisturi fresco, fragmentos de ossos irá inibir a injeção de TV </td></tr><tr><td> 1.5 </td><td> Baixa extração (baixo viscosity) </td><td> Endplates osso cortado muito distal; método de coleta de pobres </td><td> Bones deve ser cortado como proximal possível e coletados com o osso no interior do tubo de recolha para evitar respingo de volta Tempo deve ser gasto para extrair o máximo BM e com cuidado Se a piscina necessário mais do que um rato em 1 ml </td></tr><tr><td></td><td> Extração de alta (alta viscosidade) </td><td> Buffer de coleta baixo </td><td> Diluir a solução com acréscimo de 0,1% BSA, dividido em três ratos destinatário até 500 mL por rato máximo </td></tr><tr><td> 1.6 </td><td> Bad injeção intravenosa </td><td> Vasodilatação pobres e visibilidade navio </td><td> Melhorar a dilatação com lâmpada de calor. Coloque o rato em restrainer veia da cauda com construído em fonte de luz para ajudar o acesso </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Ratos doentes </td><td> Infecção </td><td> Sacrificar camundongos de acordo com as regras da instituição. Certifique-se de caudas são limpos antes da injeção e verificar a esterilidadeextraídos do BM na cultura </td></tr><tr><td></td><td> Ratos morrer </td><td> Má absorção BM </td><td> Verifique% de absorção fluorescente BM de rato morto. Otimizar TBI para linhagem de camundongos sendo usados Aumenta quantidade de BM injeção (por exemplo o uso de um camundongo doador para dois destinatários) </td></tr><tr><td> 2.4 </td><td> Hemorragia Minor </td><td> Dura violado durante a perfuração </td><td> Pressão com almofadas de gel e solução salina estéril e lavagem contínua </td></tr><tr><td></td><td> Grande hemorragia </td><td> Cérebro danificado por perfuração </td><td> Sacrifício do mouse de acordo com as diretrizes da instituição </td></tr><tr><td> 2.8 </td><td> Bolhas de ar sob a lamela </td><td> Mau contato com a superfície cortical impede a colocação adequada </td><td> Remover lamela e adicionar PBS extra para flutuar sobre a lamela da janela para remover as bolhas </td></tr><tr><td> 2.10 </td><td> Derrapagem de lamela durante a colagem </td><td> Acrmassa ylic é pesado, colocando pressão sobre a lamela e move-se a lamela para fora do caminho </td><td> Pinças deve ser usado para armazenar lamela para baixo, enquanto Vetbond e acrílico é aplicada </td></tr><tr><td> 4.2 </td><td> Bad injeção intravenosa </td><td> Vasodilatação pobres e visibilidade navio </td><td> Melhorar a dilatação com lâmpada de calor. Coloque o rato em restrainer veia da cauda com construído em fonte de luz para ajudar o acesso </td></tr><tr><td> 4.4 Figura 3C </td><td> Imagens &#39;alinhados&#39; </td><td> Trabalharam ou respiração irregular </td><td> Retire do mouse de quadro e permitir a recuperação Aumentar o nível de anestésico administrado e ajustar a posição para garantir o pescoço não é excessivamente flexionado ou estendido para impedir a respiração </td></tr><tr><td> Figura 3C </td><td> Image &#39;segmentada&#39; </td><td> Cérebro não é paralelo aos objetivos </td><td> Ajuste a posição da lamela para garantir que ele é plano </td></tr><tr><td></td><td> Navio não visualizou </td><td> injeção não vi intravascular </td><td> Refazer injeção na veia da cauda alternativa, rabo quente para garantir uma boa vasodilatação </td></tr><tr><td></td><td> Alta fundo </td><td> Sujo lamela, Bolhas de ar, acrílico </td><td> Limpe com pano úmido lamela de etanol a 70%, não encharcar como podem penetrar em acrílico e danificar o tecido cerebral </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Solução de problemas. Uma diretriz para medidas corretivas necessárias para áreas problemáticas dos procedimentos. <img alt="Schemata 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363schemata1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363schemata1.jpg" /> Schemata 1. Diagrama de fluxo Experimental. Isso demonstra o cronograma de eventos por meio de medidas experimentais 1-4. Modelos de mouse são configurados mais de uma semana, agarantir a BM reconstitui corretamente, e não são tratados com a droga até o dia 7 do tumor para garantir os enxertos tumorais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50363/50363schemata1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig1.jpg" /> Figura 1. Reconstituição BM. (A) procedimento de extração BM i. Dissecção dos ossos dos membros posteriores. Ii. Fêmur e tíbia dissecado dos membros posteriores, limpo e pronto para a extração. Iii. Ossos com placa final removida e lavada através, demonstrando a aparência branca dos ossos vazios. (B), demonstrando que Schemata nervuras laterais para injecção são posicionados na cauda. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-Page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig2.jpg" /> Figura 2. Geração ICW. (A) a instalação asséptica recomendado (B), i. Superfície do crânio exposta revela os marcos necessários para a cirurgia, a ICW deve ser posicionada no hemisfério direito, equidistantes do bregma e lambda. Ii. Periostieum içadas com solução de lidocaína, pronto para a remoção . iii. gancho dental necessário para a remoção do fragmento de osso gerados com a broca. iv. acabamento ICW com acrílico dental. (C) de três janelas exemplo demonstrar a reprodutibilidade do método. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig3.jpg" /><br/&gt; Figura 3. 2PLM resultados esperados. Todas as imagens mostram verde BM, tumor vermelho, azul (pseudo cor muito vermelha) vasculatura. (A) i. Demonstra o quadro cabeça que mantém o fluxo de isoflurano dentro da pequena irradiador animal. A 8 x 11 mm mira também podem ser vistos movendo-se através do pórtico. Ii. Mouse no invertido posicionados no quadro cabeça necessário para geração de imagens, plastercine moldável garante todas as janelas podem ser acomodados. (B) Fotos demonstrativos dos resultados de problemas com a geração de janela a partir de i. uma janela ideal, ii. uma janela com bolhas de ar presas embaixo, iii derrame acrílico sobre a lamela e iv. sujeira na própria janela. (C) Destaca os problemas que ocorrem com a imagem seguindo geração bem sucedida de um ICW i. ótima imagem ii artefatos. respiratórioscriar uma imagem de &#39;alinhado&#39; iii. lamela não perpendiculares ao laser gerar uma imagem &quot;segmentada&quot;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50363/50363fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig4.jpg" /> Figura 4. Utilizações funcionais e adaptações do modelo. (A) PCP pós processamento de imagem da imagem em que a GFP é subtraída da imagem PCP para revelar a imagem PCP verdade que pode ser sobreposta aos outros três canais em branco. Verde BM, tumor Vermelho Branco CSCs, Azul (pseudo cor muito vermelha) vasculatura (B) Demonstração das fibras de colágeno que pode ser fotografada com SHG. verde Dextran, BM vermelho, Cyan colágeno (C) i. células VEGFTrap em VITRó demonstrar o sinal de GFP produzida com o VEGFtrap. ii. In vivo de imagens demonstra que as células VEGFtrap claramente e, além disso destaca a facilidade de mudar de canal para demonstrar o sistema que você está olhando. VEGFTRap Verde + Tumor, BM Vermelho, Azul (pseudo colorida vermelho longínquo) vasculatura. (D) Demonstra a recolha de fluoresceína no estroma do tumor e não em células directamente, mostrado pela falta de sinal verde de sobreposição com o tumor vermelho. Verde Fluorescein, tumor Vermelho. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50363/50363fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> .

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A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

Nós descrevemos um romance<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica de imagem que os casais ratos quiméricos fluorescentes com janelas intracraniana e alta resolução, microscopia dois fótons. Esta imagem plataforma estudos auxiliares de mudanças dinâmicas no tecido cerebral e da microvasculatura, a um nível de uma única célula, na sequência de insultos patológicos e é adaptável para avaliar a entrega da droga intracraniana e distribuição.

A Novel de alta resolução<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica de Imagem para estudar a resposta dinâmica de estruturas intracranianas ao crescimento do tumor e Terapêutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

a-novel-high-resolution-vivo-imaging-technique-to-study-dynamic

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

11.4K visualizações.  Hospital for Sick Children, Toronto Medical Discovery Tower. Nós descrevemos um romance In vivo Técnica de imagem que os casais ratos quiméricos fluorescentes com janelas intracraniana e alta resolução, microscopia dois fótons. Esta imagem plataforma estudos auxiliares de mudanças dinâmicas no tecido cerebral e da microvasculatura, a um nível de uma única célula, na sequência de insultos patológicos e é adaptável para avaliar a entrega da droga intracraniana e distribuição.

Vídeo: A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Um In Vitro Sistema para Estudo de dormência Tumor ea Mude para o crescimento metastático

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Medicina

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The cell line was originally induced by intracranial injection of 3-methyl-cholantrene into a C57BL/6 syngeneic mouse strain 1; therefore, immunologically competent C57BL/6 mice can be used. While we use GL261, the following protocol can be used for the implantation and monitoring of any intracranial mouse tumor model. GL261 cells were engineered to stably express firefly luciferase (GL261-luc). We also created the brighter GL261-luc2 cell line by stable transfection of the luc2 gene expressed from the CMV promoter. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mice (albino variant of C57BL/6) from the National Cancer Institute, Frederick, MD were used to eliminate the light attenuation caused by black skin and fur. With the use of albino C57BL/6 mice; in vivo imaging using the IVIS Spectrum in vivo imaging system is possible from the day of implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). The GL261-luc and GL261-luc2 cell lines showed the same in vivo behavior as the parental GL261 cells. Some of the shared histological features present in human GBMs and this mouse model include: tumor necrosis, pseudopalisades, neovascularization, invasion, hypercellularity, and inflammation 1.
Prior to implantation animals were anesthetized by an intraperitoneal injection of ketamine (50 mg/kg), xylazine (5 mg/kg) and buprenorphine (0.05 mg/kg), placed in a stereotactic apparatus and an incision was made with a scalpel over the cranial midline. A burrhole was made 0.1mm posterior to the bregma and 2.3mm to the right of the midline. A needle was inserted to a depth of 3mm and withdrawn 0.4mm to a depth of 2.6mm. Two &mu;l of GL261-luc or GL261-luc2 cells (107 cells/ml) were infused over the course of 3 minutes. The burrhole was closed with bonewax and the incision was sutured.
Following stereotactic implantation the bioluminescent cells are detectable from the day of implantation and the tumor can be analyzed using the 3D image reconstruction feature of the IVIS Spectrum instrument. Animals receive a subcutaneous injection of 150&mu;g luciferin /kg body weight 20 min prior to imaging. Tumor burden is quantified using mean tumor bioluminescence over time. Tumor-bearing mice were observed daily to assess morbidity and were euthanized when one or more of the following symptoms are present: lethargy, failure to ambulate, hunched posture, failure to groom, anorexia resulting in &gt;10% loss of weight. Tumors were evident in all of the animals on necropsy.

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial implantation of GL261 cells into C57BL/6 mice produces malignant gliomas that recapitulate many of the hallmarks of human glioblastoma multiforme. We used GL261 cells stably expressing luciferase to allow us to use in vivo imaging to follow tumor progression. The surgery and 3D in vivo imaging are demonstrated.

Implantação intracraniana com 3D subseqüentes In Vivo Bioluminescent imagem de Gliomas murino

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current estimates put the prevalence of amblyopia at approximately 1-3%1-3, the majority of cases being monocular2. Amblyopia is most frequently caused by ocular misalignment (strabismus), blur induced by unequal refractive error (anisometropia), and in some cases by form deprivation.
Although amblyopia is initially caused by abnormal visual input in infancy, once established, the visual deficit often remains when normal visual input has been restored using surgery and/or refractive correction. This is because amblyopia is the result of abnormal visual cortex development rather than a problem with the amblyopic eye itself4,5 . Amblyopia is characterized by both monocular and binocular deficits6,7 which include impaired visual acuity and poor or absent stereopsis respectively. The visual dysfunction in amblyopia is often associated with a strong suppression of the inputs from the amblyopic eye under binocular viewing conditions8. Recent work has indicated that suppression may play a central role in both the monocular and binocular deficits associated with amblyopia9,10 .
Current clinical tests for suppression tend to verify the presence or absence of suppression rather than giving a quantitative measurement of the degree of suppression. Here we describe a technique for measuring amblyopic suppression with a compact, portable device11,12 . The device consists of a laptop computer connected to a pair of virtual reality goggles. The novelty of the technique lies in the way we present visual stimuli to measure suppression. Stimuli are shown to the amblyopic eye at high contrast while the contrast of the stimuli shown to the non-amblyopic eye are varied. Patients perform a simple signal/noise task that allows for a precise measurement of the strength of excitatory binocular interactions. The contrast offset at which neither eye has a performance advantage is a measure of the "balance point" and is a direct measure of suppression. This technique has been validated psychophysically both in control13,14 and patient6,9,11 populations.
In addition to measuring suppression this technique also forms the basis of a novel form of treatment to decrease suppression over time and improve binocular and often monocular function in adult patients with amblyopia12,15,16 . This new treatment approach can be deployed either on the goggle system described above or on a specially modified iPod touch device15.

Amblyopia is a developmental disorder of the visual cortex that is often accompanied by strong suppression of one eye. We present a new technique for measuring and treating interocular suppression in patients with amblyopia that can be deployed using virtual reality goggles or a portable iPod Touch device.

A Medição e Tratamento de Supressão de ambliopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

Implantação estereotáxica intracraniana e<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging Bioluminescent de xenoenxertos de tumores em um Sistema Modelo de Rato Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

A Novel<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica Gene Transferência e<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaios baseados em células para o Estudo da perda óssea em Distúrbios Osteomusculares

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Injeção Orthotopic de células cancerosas da mama na mamária Fat Pad de Ratos para o Estudo de crescimento tumoral.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Facial Nerve Axotomy in Mice: A Model to Study Motoneuron Response to Injury

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and either cut or crush it to induce peripheral nerve injury. Advantages of this surgery are its simplicity, high reproducibility, and the lack of effect on vital functions or mobility from the subsequent facial paralysis, thus resulting in a relatively mild surgical outcome compared to other nerve injury models. A major advantage of using a cranial nerve injury model is that the motoneurons reside in a relatively homogenous population in the facial motor nucleus in the pons, simplifying the study of the motoneuron cell bodies. Because of the symmetrical nature of facial nerve innervation and the lack of crosstalk between the facial motor nuclei, the operation can be performed unilaterally with the unaxotomized side serving as a paired internal control. A variety of analyses can be performed postoperatively to assess the physiologic response, details of which are beyond the scope of this article. For example, recovery of muscle function can serve as a behavioral marker for reinnervation, or the motoneurons can be quantified to measure cell survival. Additionally, the motoneurons can be accurately captured using laser microdissection for molecular analysis. Because the facial nerve axotomy is minimally invasive and well tolerated, it can be utilized on a wide variety of genetically modified mice. Also, this surgery model can be used to analyze the effectiveness of peripheral nerve injury treatments. Facial nerve injury provides a means for investigating not only motoneurons, but also the responses of the central and peripheral glial microenvironment, immune system, and target musculature. The facial nerve injury model is a widely accepted peripheral nerve injury model that serves as a powerful tool for studying nerve injury and regeneration.

We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.

Axotomia do nervo facial em ratos: um modelo para estudo de resposta motoneuron para Injury

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

Criação de um Modelo de Xenoenxerto Humano mieloma múltiplo na galinha para estudar o crescimento tumoral, invasão e angiogênese

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In Vivo e Ex Vivo Abordagens para o Estudo do cancro do ovário metastático Colonização de Estruturas Láctea natural em Peritoneal adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

Utilizando imagens da retina para estudar a demência

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...