Este protocolo de injeção intracraniana é significativo porque permite injeções precisas, monitoramento diário e medição precisa do volume do tumor para um estudo mais eficaz dos mecanismos de metástase cerebral. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o monitoramento em série do crescimento do tumor intercranário. Demonstrando o procedimento estarão Jonathan Spehar, um pesquisador de pós-graduação associado do Laboratório Sizemore, e Anna Bratasz, pesquisadora de imagens da Universidade Estadual de Ohio, Small Animal Imaging Shared Resource.
Antes de iniciar o procedimento, torça o bloqueio de estágio na broca para permitir que um adaptador de broca e uma broca estéril de um milímetro sejam inseridos na broca e aperte manualmente as travas de broca para travar a broca. Conecte a broca ao quadro estereotático e defina a taxa de entrega do injetor digital para 0,4 microliters por minuto, com a meta de dois microliters. Após confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, coloque o rato anestesiado sobre a moldura e use a extremidade contundente de um aplicador de ponta de algodão para posicionar os dentes no cocho da boca.
Pressione a barra de ouvido esquerda contra o canthus medial da orelha esquerda para estabilizar o crânio e use o parafuso na estrutura estereotática para travar o crânio no lugar. Em seguida, fixar o outro lado do crânio com a barra de ouvido direita da mesma maneira. Para fazer uma janela calvária, limpe o couro cabeludo com três soluçãos betadina alternadas sequenciais e esfregões de 70% de etanol e use um bisturi estéril para fazer uma incisão de três milímetros através da pele ao longo do aspecto mediano central do crânio seguindo a linha de sutura sagital.
Identifique e oriente a broca estéril perpendicular ao bregma, certificando-se de redefinir a escala vernier digital a zero e mover a broca dois milímetros lateralmente para a sutura sagital e um milímetro anterior à sutura coronal. Mova a pele para longe da broca e usando a maior velocidade e prestando atenção aos pontos turísticos, faça cuidadosamente um furo, aproximadamente 0,5 milímetros de profundidade, através da calvária, resfriando o local da broca com gotas de soro fisiológico estéril conforme necessário. Uma vez feita a janela calvária, levante cuidadosamente a broca e remova a broca do quadro estereotático.
Para injeção de células cancerígenas, conecte a unidade injetor automática ao aparelho estereotático e carregue os seis a oito microliters de células completamente resuspendidas em DPBS em uma seringa Hamilton estéril. Coloque a seringa no injetor e distribua um pequeno volume de solução em uma cortina estéril descartável para preparar a agulha para injeção. Use um aplicador de ponta de algodão para limpar a seringa com 70% de etanol e alinhar a ponta da agulha ao centro da janela calvária até que ela quase toque o cerebrum exposto.
Reinicie a escala vernier digital a zero e insira lentamente a agulha em uma profundidade de três milímetros no cérebro. Deixe a agulha no cérebro por pelo menos 60 segundos antes de selecionar a execução na tela do injetor para iniciar a entrega da célula ao local da injeção. Quando todas as células tiverem sido entregues, permita que a agulha descanse no cérebro por pelo menos três minutos para permitir que o parênquim cerebral se aclimate à injeção antes de retirar a agulha do cérebro a uma taxa de 0,75 milímetros por minuto.
Para a ressonância magnética da carga tumoral, 10 a 20 minutos antes da imagem no ponto de tempo experimental apropriado, administre 100 microliters por 20 gramas de peso corporal agentes de contraste à base de gadolínio ao camundongo por injeção intraperitoneal padrão. Anestesiar o mouse após a injeção e colocar o mouse anestesiado em um suporte aquecido. Coloque o suporte em um ímã de 9,4 T equipado com uma bobina de superfície cerebral do mouse e obtenha uma imagem localizadora.
Em seguida, imagem o cérebro do rato usando uma sequência rara ponderada T2 e pós-gadolinium contraste T1 ponderada sequência rara. Para medir o volume total do tumor, abra o arquivo de dados de ressonância magnética de interesse no ImageJ e use a ferramenta de seleções manuais gratuitas para desenhar um contorno em torno do tumor. Em seguida, abra a guia de análise e selecione a medida para obter a área da região selecionada.
Quando todos os tumores contendo fatias para um camundongo individual nesse ponto de tempo específico tiverem sido avaliados, exporte os valores para um programa de análise de dados adequado. Aqui, uma visão geral representativa da quantificação do volume do tumor para um único rato no dia 7 e dia 10 pós-injeção de células tumorais mamárias murinas pode ser observada. A avaliação de 30 fatias por exame revelou que para esta análise, no sétimo dia pós-injeção, cinco fatias apresentaram uma carga tumoral.
Enquanto no dia 10, nove fatias exibiam uma carga tumoral. A área do tumor em cada imagem foi então medida como demonstrado, permitindo que a mudança no volume do tumor fosse rastreada ao longo do tempo. Cada linha celular e cada modelo de mouse receptor é único e, portanto, requer a otimização do número de células injetadas e do cronograma de ressonância magnética para garantir a precisão da imagem.
Após este procedimento, o cérebro pode ser colhido para essencialmente qualquer ensaio a jusante, incluindo isolamento de células únicas ou análise histopatológica.
