Os autores gostariam de agradecer a L. Belluscio para equipamentos de cirurgia filmagens, D. Kwon para filmar assistência, K. Liu para edição de vídeo, assistência e K. MacLeod para toda a música de fundo. KW reconhece o generoso apoio da Divisão de Programas de Pesquisa NIMH intramurais e os genes, Cognição e do Programa de Psicose. Este trabalho foi financiado pelo Programa de Pesquisa NIMH intramuros (VC, YY, SMKW) e da Divisão de Programa de Pesquisa NIAAA intramuros clínica e biológica (VC, RMC, DML).

Os procedimentos experimentais descritos abaixo foram aprovados pelo Instituto Nacional de Atenção à Saúde Mental Animal e Comitê de Uso e estavam de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. 1. Preparação pré-operatória <ol><li> Limpe todas as ferramentas em um esterilizador quente talão antes da cirurgia asséptica, limpar o local da cirurgia com etanol 70%, e colocou panos limpos. Usar luvas estéreis. Anestesiar os animais com uma solução preparada de fresco avertina a 1,2%, determinado a 0,02 ml / g, por via intraperitoneal. Alternativamente, anestesiar com gás isofluorano por meio de um cone de nariz, 5% para indução, 1,5% para a manutenção, com um circuito eliminador passiva. Verifique o nível de anestesia com pitadas cauda ou dedo do pé para garantir sedação plena. </li><li> Cobrir os olhos do animal com pomada oftálmica estéril, e injectar a dexametasona preparado de fresco (0,2 mg / kg) e carprofeno (5 mg / kg) subcutaneously para evitar inchaço e inflamação do cérebro 11. Raspar o cabelo sobre o crânio entre as orelhas, e esterilizar a pele com esfoliação betadine e três compressas alternadas de etanol 70%. </li><li> Montar o animal num estágio cirurgia estereotáxica com earbars, com uma almofada de aquecimento de água de circulação abaixo do conjunto de animais, a 37 ° C. Verifique regularmente os níveis do animal de anestesia, e complementar a dose do anestésico original conforme necessário. </li><li> Injectar 200 ul de Marcaine 0,5% sob a pele do couro cabeludo para anestesiar a área. Faça uma incisão na pele e remover a retalho de pele sobre o crânio. Retire o periósteo e secar a área com compressas de algodão limpo. </li></ol> 2. Cirurgia Janela crônica craniana <ol><li> Use uma broca de alta velocidade dental com 0,5 milímetros de rebarbas suavemente para delinear um círculo de diâmetro 3-5 mm sobre a região do cérebro de interesse. Periodicamente molhar o local de perfuração com pó de osso estéril 0,9% e limpar com cotonetes limpos. Se os sangramentos ósseas, use gelfoam previamente embebidos com solução salina estéril para apagar o sangramento e esperar por ele para parar. </li><li> Quando a camada último osso é atingido, levantar e remover a ilha osso com uma pinça de ponta fina. Dura anexos à prateleira inferior do osso pode ser encontrado se a janela atravessa uma sutura óssea. Estes devem ser cuidadosamente removidos como a aba de osso é levantado. </li><li> Rolo de espuma umedecido gel suavemente sobre a dura exposta para limpar a sua superfície e esperar por qualquer sangramento dural parar passo crítico:. Não prossiga até que todo sangramento dural parou. Sangue que fica preso dentro da janela craniano geralmente leva a uma janela opaca. </li><li> Se a região de interesse é em um local em que a dura-máter é particularmente espessa, a remoção da dura-máter acima, pode ser necessário. Se este for o caso, separar o suavemente dura a partir do pia abaixo com uma pinça muito finas, fazer uma pequena incisão na dura levantada com outro par de fórceps finos, então agarrar as extremidades cortadas e suavementedividir a dura-máter. A duração é fina, mas forte, por isso tome cuidado para não cortar o cérebro com as bordas intactas da dura. </li><li> Lavar a área com ACSF estéril ou soro fisiológico estéril. </li><li> Coloque uma lamela de vidro esterilizada (3-5 mm) sobre a dura-máter ou pia passo crítico:. Se as curvas em torno do crânio significativamente, usar Kwiksil adesivo 12 para encher os espaços em que a dura-máter ou pia não fazem contacto estreito com a lamela em regiões que não vai ser trabalhada. </li><li> Use gel de cianoacrilato para cobrir o adesivo elastómero e as bordas da lamela de vidro. Cobrir todo o crânio exposta com gel de cianoacrilato, ou uma mistura de cimento e krazyglue dental passo crítico:. Não permitir que qualquer gel de cianoacrilato de tocar a superfície do cérebro. </li><li> Incorporar uma custom-made barra de metal de fixação da cabeça do lado oposto do crânio. </li><li> Reexpedição para uma câmara de recuperação quente, depois de uma injecção intraperitoneal de cetoprofeno, 5 mg / kg, for gestão da dor. Continuar o analgésico por mais dois dias de pós-operatório. </li><li> Após duas semanas de recuperação pós-operatória, anestesiar o animal com isoflurano (5% para indução, de 1,5% para manutenção), montá-lo em um estágio do microscópio custom-made com um quadro de cabeça de fixação, e verificar a janela craniana para claridade óptica sob iluminação com luz azul. Cérebro superfície clareza vaso sanguíneo é altamente indicativo de qualidade janela craniano. Se as extremidades dos vasos sanguíneos são bem definidas, a janela é susceptível de ser utilizável. A duas semanas de tempo de recuperação pós-operatório é recomendado para permitir tempo suficiente para que o animal a recuperar da cirurgia. Janelas cranianas tipicamente limpar e melhorar durante este tempo, e permanecem opticamente transparentes por semanas adicionais para meses até rebrota de crânio ou espessamento da dura degrada a qualidade da janela. </li></ol> 3. Protocolo de comportamento e de varredura a laser de dois fótons Microscopia <ol><li> Animais com c clarajanelas ranial serão expostos a um estímulo ambiental ou submetidos a uma sessão de treino comportamental, e, em seguida, depois trabalhada no momento de expressão da GFP Arc-maximal. Antes de iniciar um protocolo de comportamento, o animal deve ser mantido num ambiente doméstico consistente gaiola para minimizar dia-a-dia da variação dos níveis de linha de base do arco GFP-expressão. </li><li> Começar a formação comportamental ou paradigmas de estimulação ambientais, dependendo da região do cérebro de interesse. Por exemplo, animais podem ser expostos a diferentes ambientes visuais em dias consecutivos, e visualizados por dia após a estimulação visual para identificar estímulo respostas específicas do córtex visual 10. </li><li> Arc-GFP em neurónios fluorescência tipicamente atinge o seu nível máximo de duas horas após a estimulação. A linha do tempo experimental pode ser otimizada para facilitar a detecção de Arco GFP-expressão em neurônios em seus níveis máximos de fluorescência. </li><li> Depois de uma sessão de formação comportamental ou environmental estimulação é completado, anestesiar os animais com isoflurano (5% para indução, de 1,5% para manutenção) e montar o animal na platina do microscópio sob medida com a cabeça de fixação do quadro sob o microscópio de dois fotões. </li><li> A posição da cabeça do animal é fixado à armação da cabeça de fixação, que liga directamente à fase, utilizando-se a barra de metal implantados no crânio. Isoflurano e oxigénio são continuamente fornecidos ao rato através de um cone de nariz. A temperatura do corpo é mantida através de uma almofada de aquecimento. </li><li> Certifique-se que os detectores de microscópio são protegidos da luz ambiente através da realização de dois fótons de varredura a laser em um quarto escuro. Use uma lente de imersão de 20x ou 25x (1,05 abertura numérica) de água para geração de imagens. Primeiro, sob epi-fluorescência iluminação, adquirir uma imagem da superfície padrões dos vasos sanguíneos mais a região do cérebro de interesse com uma câmera CCD para o alinhamento da imagem futuro. </li><li> Comece dois fótons de varredura a laser para adquirir uma pilha de imagens 3-D. Um FV1000 OlympusMPE microscópio multi-fotão é usado em nossa configuração. A excitação comprimento de onda do laser de dois fotões está fixado em 920 nm, e a potência do laser emitido da objectiva é de cerca de 50 mW. Fluorescência emitida é detectada simultaneamente nos canais de verde e vermelho espelho dicróico (a 570 nm, filtro de barreira de 495-540 nm e 570-625 nm), usando um externo de dois canais do sistema de detecção photomutiplier colocados próximo do espécime. Arco-GFP fluorescência só aparece no canal verde, enquanto que o tecido auto-fluorescência aparece em ambos os canais 13, 14. </li><li> Pilhas de imagens típicas têm dimensões de cerca de 320x320x100 ^ m (comprimento x largura x profundidade), uma resolução horizontal de 0,5 m / pixel e uma resolução vertical de 3 mm / pixel. </li><li> Depois de adquirir a pilha de imagens, o animal regressar à sua gaiola. Não perturbe o animal até a próxima comportamental e sessão de imagem. Repita o comportamento e procedimento de imagem em dia como desejáveled. Use o cérebro adquiridos anteriormente superfície da imagem vaso sanguíneo para orientar volta para o local de imagem mesmo. </li></ol>

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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+a+role+of+arc+in+enhancing+orientation+specificity+in+visual+cortex.">In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex.</a> Cell. 126 (2), 389-402 (2006).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), e680 (2008).</li><li>Dombeck, D. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy.">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).</li><li>Stosiek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de imagem in vivo descrito aqui permite o exame repetido de mudanças Arco de expressão de genes nos mesmos conjuntos de neurônios durante vários dias no animal vivo. É um método eficiente e versátil para a obtenção de informação sobre a plasticidade neural relacionadas com a dinâmica molecular em neurónios individuais em resposta a várias experiências comportamentais. Padrão métodos histoquímicos como a hibridização in situ e imuno pode conseguir uma única célula resolu?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do Equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> FV1000 multi-fotão microscópio de varredura a laser </td><td> Olimpo </td><td> FV1000MPE </td><td> Imagem </td></tr><tr><td> Microscópio de dissecção </td><td> Omano </td><td> 555V107 </td><td> Cirurgia </td></tr><tr><td> Stereotaxis fase cirurgia para ratos </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 726335 </td><td> Cirurgia </td></tr><tr><td> 20X 25X ou objetiva de imersão de água </td><td> Olimpo </td><td> XLPL25XWMP </td><td> Imagem </td></tr><tr><td> Estágio do microscópio com cabeça de fixação de quadro </td><td> Feitos </td><td> N / A </td><td> Imagem </td></tr><tr><td> Pinça fina </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11251-20 </td><td> Cirurgia </td></tr><tr><td> Dental broca rebarba </td><td> Belas Science Tools </td><td> 19007-05 </td><td> Cirurgia </td></tr><tr><td> Câmera CCD </td><td> QImaging </td><td> QICAM 12 bits </td><td> Imagem </td></tr></tbody></table>

in vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons

A capacidade do cérebro de mudar em resposta a experiência é essencial para a função saudável do cérebro, e anomalias no presente processo contribuem para uma variedade de desordens cerebrais 1,2. Para melhor compreender os mecanismos pelos quais os circuitos cerebrais reagem a experiência de um animal requer a capacidade de monitorar as alterações dependentes da experiência molecular em um dado conjunto de neurónios, ao longo de um período de tempo prolongado, em que o animal vivo. Embora a experiência e atividade neural associada é conhecido por desencadear mudanças de expressão gênica em neurônios 1,2, a maioria dos métodos para detectar tais mudanças não permitir a observação repetida dos mesmos neurônios durante vários dias ou não tem resolução suficiente para observar neurônios individuais 3 , 4. Aqui, descrevemos um método que combina in vivo de dois fótons de microscopia, com um repórter fluorescente geneticamente codificado para rastrear experiência dependentes de mudanças de expressão gênica em neurônios corticais individuais sobre o<html> claro do dia-a-dia experiência. Uma das bem estabelecidas experiência dependentes de genes é regulada Atividade proteína associada citoesqueleto (Arco) 5,6. A transcrição do arco é rápida e altamente induzida pela intensificação da actividade neuronal 3, e do seu produto de proteína regula a endocitose de receptores de glutamato e de longo prazo de plasticidade sináptica 7. A expressão do arco tem sido amplamente utilizada como um marcador molecular para mapear os circuitos neuronais envolvidas em comportamentos específicos 3. Na maioria destes estudos, a expressão Arc foi detectada por hibridação in situ ou imuno-histoquímica em secções de cérebro fixos. Embora esses métodos revelaram que a expressão do arco foi localizada para um subconjunto de neurónios excitatórios após experiências comportamentais, como os padrões de expressão celular do arco pode mudar com múltiplos episódios de experiências repetidas ou distintivo mais dias não foi investigada. ntent &quot;&gt; in vivo de dois fótons de microscopia oferece uma poderosa forma de examinar a experiência adquirida dependentes de alterações celulares no cérebro vivo 8,9. Para permitir a análise de expressão Arc em neurônios vivos por dois fótons de microscopia, que anteriormente gerou um knock- na linha de rato em que um repórter GFP é colocado sob o controle do promotor endógeno do arco 10. Este protocolo descreve as preparações cirúrgicas e procedimentos de imagiologia de seguimento experiência dependentes de padrões de expressão de Arc-GFP em conjuntos neuronais do animal vivo. Neste método , crónicas janelas cranianas foram primeiro implantado em ratinhos Arc-GFP nas regiões corticais de interesse. Estes animais foram então repetidamente fotografada por dois fotões microscopia após desejados paradigmas de comportamento ao longo de vários dias. Este método pode ser geralmente aplicável a animais portadores outros repórteres fluorescentes de experiência dependentes de alterações moleculares 4.

<html> Este protocolo descreve um método para rastrear experiência dependentes de alterações moleculares nos neurônios corticais individuais em animais vivos. Uma janela crónica craniana é primeiro criado sobre uma região cortical de interesse num rato carregando um repórter fluorescente da expressão do gene. Dois fotão-microscopia pode então ser acoplado com vários paradigmas de comportamento para observar comportamentalmente induzidas alterações moleculares em neurónios individuais e rastrear tais mudan...

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In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experiência dependentes de alterações moleculares nos neurônios são essenciais para a capacidade do cérebro de se adaptar em resposta aos desafios comportamentais. Um<em&gt; In vivo</em&gt; Dois fótons método de imagem é descrito aqui que permite o acompanhamento de tais alterações moleculares em individuais neurônios corticais através de repórteres codificados geneticamente.

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

21.5K visualizações.  National Institute of Mental Health. Experiência dependentes de alterações moleculares nos neurônios são essenciais para a capacidade do cérebro de se adaptar em resposta aos desafios comportamentais. Um In vivo Dois fótons método de imagem é descrito aqui que permite o acompanhamento de tais alterações moleculares em individuais neurônios corticais através de repórteres codificados geneticamente.

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A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

A Técnica de Janela crânio-fino para Crônica de dois fótons In vivo Imaging da Microglia murino em Modelos de Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Neurociência

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Em Imaging vivo do Cordão do rato Spinal Usando Two-photon Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In Vivo Two-Photon Microscopia de terminações nervosas individuais em Pele

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Dois fótons de imagem da Cellular Dynamics na Medula Espinhal Rato

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Quantificação de filamentosas actina (F-actina) puncta no Rat neurônios corticais

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...