Agradecemos Bernard Foucart para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo Fundo Belga para a Investigação Científica (FRS-FNRS) e pelo Fundo Rainha Elisabeth de Pesquisa Médica. Agnès Villers é pesquisador do Fundo Belga para a Investigação Científica.

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com o National Institutes of regulamentos de saúde para o cuidado e uso de animais em pesquisa e com o consentimento do comitê de ética local. 1. Preparação de Artificial líquido cefalorraquidiano Os mesmos meios de comunicação é utilizado para dissecar, cortar e perfundir fatias (1 ml / min) durante o período de repouso e as gravações eletrofisiológicas. Este meio é composto por NaCl 124 mM, KCl 4,4 mM, NaHCO 3 26, 1 mM de NaH 2 PO 4, 2,5 mM CaCl2, 1,3 mM de MgSO4 e 10 mM de D-glucose. <ol><li> Pesar os componentes diferentes para 2 L de MgSO4 ACSF excepto que já se encontra em solução (1 M). Usando uma solução padrão permite ter a certeza da exata concentração de Mg 2 + porque MgSO4 em pó é altamente higroscópico. Ca 2 + e Mg 2 + rácio influencia grandemente a indução e manutenção da LTP14 e, assim, as proporções devem ser sempre respeitados. </li><li> Coloque todos os componentes, exceto CaCl2 num cilindro de vidro graduado e trazer a 2 L com H2O destilada </li><li> Mexa vigorosamente. Quando tudo está dissolvido, adiciona carbogénio através de um borbulhador de aquário e tubo ligado ao tanque (95% O2, 5% de CO 2). Espere alguns minutos e adicionar cloreto de cálcio, quando o pH é fixado em 7,4 por acção de tampão de bicarbonato. </li><li> Manter a 600 ml num prato de vidro rectangular refrigerado e arrefecer a 4 ° C com gelo em volta do prato. Este meio será utilizada para dissecação do hipocampo. </li><li> Filtre os restantes 1.400 ml e manter-se em um erlenmeyer. </li></ol> 2. Preparação do Rig eletrofisiológica ea Slice câmara de gravação Cérebro O circuito de perfusão é feita de duas bombas peristálticas, um bombeamento de fluidos frescos de um tanque de reserva e outro de bombeamento de fluido usado de tele gravar câmara a um bin. Fluido fresco é adicionada a um sistema de perfusão caseira, onde é re-oxigenada e aquecida antes de atingir a câmara de registo de interface, por gravidade (Figura 1A). A câmara de gravação interface foi projetada pelo FST (Belas Tools Ciência, em Vancouver, Canadá, Figura 1B). Fatias de tecido são colocados em rede tecida filtro ligado a um anel bem removível e pode ser mantida continuamente sob condições de interface, ajustando a altura da agulha de aspiração bem. Um tubo de plástico caseira bloqueado na sua extremidade e perfuradas lateralmente (0.5 mm) é fixada à agulha de sucção para aumentar a estabilidade do nível da câmara. A cabeça de gravação é montada sobre um banho de água contendo uma pedra de dispersão de gás que ajuda a manter um ambiente húmido passando o ar húmido através de portas de deflexão da cabeça de gravação (para diminuir a formação de gotículas de água). Banho e temperatura do meio é controlado por variação contínua do nível de corrente DC tháspero um silicone de borracha incorporado elemento de aquecimento em banho-maria. Termistores em banho de água e poços de gravação permitir que a temperatura da câmara para ser fixado e precisamente controlada nestes locais. O sistema de aquecimento da câmara é completado por um sistema de aquecimento global, controlando a temperatura de toda a plataforma. O software desenvolvido por pesquisadores da University of Edinburgh ( <a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a> ) monitora e equilibra a temperatura do ar oxigenado, a fatia do cérebro, os eletrodos eo equipamento restante proporcionando um ambiente estável para gravações de longa duração (Figura 1C) . A temperatura utilizada para fatias de hipocampo de ratos é de 28 ° C. <ol><li> Lavar todo o circuito de perfusão com H 2 O destilada por um período mínimo de 20 min e iniciar os sistemas de aquecimento. </li><li> Iniciar o borbulhamento carbogénio no circuito. Carbogen chega nas home-made tubos de perfusão através de fvelas ILTER e no banho de água abaixo da câmara de gravação. O caudal do banho de água é controlada por um medidor de fluxo. Se o caudal for demasiado lento, o tecido pode tornar-se hipóxico. Por outro lado, se o caudal for demasiado elevado, o gás pode não ser suficientemente aquecido e hidratada levando a secagem do tecido. Taxa de fluxo de gás de alta poderia também aumentar a possibilidade de a pulverização de água sobre o tecido a partir do banho de água abaixo levando ao choque osmótico. Isto pode ser evitado pela adição de pedaços de rede de nylon (100 um) na saída das portas de deflexão. </li><li> Escorra o circuito e encher com ACSF filtrada. </li><li> Coloque o anel que irá apoiar a fatia na câmara de retenção. Um filtro de rede tecida com aberturas de malha de 500 a 750 um é esticado e ligado ao anel com resina de duas partes de cola epóxi. O filtro de rede de tecido é feito de 87% de poliamida e 13% elastano (calça 15 den). Cola deve ser aplicado com cuidado para evitar a formação de relevos na superfície da ring. </li><li> Remova cuidadosamente todas as bolhas de ar do circuito. </li><li> Ajustar o nível de ACSF na câmara de registo com o parafuso da agulha de aspiração. A velocidade das bombas peristálticas é ajustado para 1 ml / min para a entrada da bomba e a 5 ml / min, para a saída da bomba. </li></ol> O sistema de perfusão é colocado sobre uma mesa de vibração rígida resistente e rodeado por uma gaiola de Faraday. 3. Preparação da área de dissecção Instrumentos cirúrgicos: um bisturi com lâmina n º 11, tesoura pequena padrão de dissecação, tesouras, pinças de mola curvas, duas Heidemann espátulas e uma colher. Material suplementar: uma guilhotina, um resguardo, um triturador de tecido Mcllwain, com uma lâmina de barbear, papel de filtro, uma pipeta de Pasteur de vidro com uma tetina de borracha, duas pipetas de Pasteur de plástico uma das quais com uma boca larga, uma placa de Petri, um cilindro metálico 7 mm de diâmetro (Figura 2A). <ol><li&gt; no prato de dissecação enchido com ACSF gelado (preparada no Passo 1), mergulhar uma tampa de vidro refrigerado a partir de uma placa de coloração, embrulhado em papel de filtro. Cuidadosamente remover bolhas de ar e oxigenar a ACSF através de um borbulhador de aquário (Figura 2A). </li><li> Lay out instrumentos em ordem de uso. Adicionar três camadas de papel de filtro na placa de triturador de tecido e uma lâmina nova lavados com água destilada e com éter (Figura 2B). A lâmina deve ser horizontal quando toca o papel. Força da lâmina é ajustada a metade do valor da velocidade máxima e a cerca de um terço do valor máximo. </li><li> Atentamente verificar se tudo está pronto (instrumentos, temperatura ...), porque você não vai ter tempo depois. </li><li> Peça a alguém para pulverizar a dissecção com uma pipeta Pasteur preenchido com ACSF frio. </li><li> Anestesiar o rato com IP Nembutal (100 mg / kg) antes de decapitação. Anestesia halotano também podem ser usadas. Comparamos os dois métodos e obtainada mesmos resultados. Decapitação deve ser realizada sob anestesia mas deslocamento cervical também podem ser utilizados. No entanto deslocamento cervical precisa de uma boa prática para evitar o sofrimento do animal. </li><li> Dissecar no resguardo tão rapidamente quanto possível, sob frio ACSF contínuo banho. </li></ol> 4. Remoção cérebro <ol><li> Enquanto ainda segurando a cabeça com o dedo indicador eo polegar de uma das mãos sobre a boca, fazer uma incisão com a tesoura de dissecção ao longo do meio do topo da cabeça começando na borda do corte guilhotina e funcionando rostralmente até o osso frontal . </li><li> Cortar o músculo cutâneo em cada lado da cabeça para expor totalmente as placas do crânio e remover os músculos na parte lateral da cabeça do caudal. </li><li> Com as tesouras de dissecação, cortados do músculo temporal de cada lado, ao longo da placa temporal, depois cortar as placas frontais no meio, transversalmente. Em seguida, fazer um pequeno corte no osso occipital, entre os dois plates. </li><li> Para cada um dos lados, cortadas na base caudal das placas occipitais. </li><li> Corte ao longo da sutura sagital com uma tesoura de mola. </li><li> Com uma pinça, retire as metades do crânio, espalhando-los longe um do outro. </li><li> Com o bisturi, cortar transversalmente logo após o bulbo olfatório e pouco antes do cerebelo, em seguida, mergulhar o cérebro extraído no prato de dissecação com ACSF frio. </li></ol> 5. Dissecção do hipocampo <ol><li> Uma vez que o cérebro está imersa no prato de dissecação, separar os dois hemisférios do outro com um bisturi inserido no meio. </li><li> A dissecção do hipocampo é realizada com espátulas sob controle visual por meio de um microscópio cirúrgico binocular (X25, Figura 2A). Em um hemisfério, cuidadosamente espalhar as estruturas para ver o ventrículo lateral. Remover o tronco cerebral e diencéfalo. Isto é feito pela aplicação da espátulas no córtex frontal de um lado e do diencéfalo naoutro lado. Tome cuidado para não tocar no hipocampo com o espátulas e não esticá-lo durante o corte do tecido. </li><li> Sever do fornix então empurre o hipocampo fora do córtex (rolar), através da inserção de uma espátula no ventrículo. </li><li> Quando o hipocampo é extraído, remover o excesso de tecido cortical e restantes vasos sanguíneos. </li></ol> 6. Corte das fatias <ol><li> Com um plástico de boca larga pipeta Pasteur, transferir o hipocampo em uma colher com seus Alvear para cima da superfície (lado convexo). </li><li> Remover o excesso de fluido com uma pipeta de Pasteur de plástico normal. </li><li> Dica a colher verticalmente quase tocando o papel de filtro do helicóptero (Figura 2B) e cair fora do hipocampo da colher, tocando rapidamente o papel de filtro, em seguida, voltar a colher. </li><li> Orientar o hipocampo e corta transversalmente a 400 m com o helicóptero (ver Figura 2C para orientação do hipocampopus em relação à lâmina de barbear). Aja tão rapidamente quanto possível. </li><li> Retire o papel de filtro com o hipocampo fatias e envolvê-la em torno do cilindro metálico para espalhar as fatias um pouco. Então, sem as fatias com sprays de ACSF usando um padrão de plástico pipeta Pasteur e coletá-los em uma placa de Petri cheia de ACSF frio. </li></ol> 7. Incubação de fatias em interface <ol><li> Seleccione fatias com uma pipeta de Pasteur de plástico padrão e colocá-los rapidamente na câmara de gravação. Fatias recuperar do trauma dissecção directamente na câmara de gravação, em relação a 28 ° C. </li><li> A fatia será mais provável pia. Diminuir o nível de fluido para atingir o nível fatia, e, em seguida, aumentá-lo para fazê-lo flutuar. </li><li> Vire a fatia na posição correta, baixando o nível. As fatias são sempre orientada da mesma forma a facilitar o posicionamento dos eléctrodos (2 estimulante e um eléctrodos de registo), na região CA1. </li><li> Pare quandoo fluido está na interface. Um &quot;menisco&quot; dos meios de comunicação em torno da fatia é indicativo de um nível suficiente de meios de comunicação. O filtro de rede deve ser saturado com a mídia, mas não completamente submerso. </li><li> Manter a câmara coberta com papel de filtro colocado sobre a tampa perfurada. </li><li> Deixe o resto fatia de pelo menos 1,5 horas a 28 ° C. </li></ol> 8. Gravação de respostas sinápticas <ol><li> Gravação de eletrodo: capilares de vidro são puxados para obter uma resistência de ponta de 2-5 mohms quando preenchidos com ACSF. Um pequeno pedaço de papel de filtro é colocado em torno da ponta do eléctrodo e cera óssea é aplicada na extremidade para reduzir a condensação. Eletrodos estimulantes: eletrodos bipolares de cluster de platina-irídio, com um diâmetro de 12,5 m são comprados de FHC (EUA). Com os devidos cuidados, cada eletrodo pode ser usado pelo menos 30 vezes (Figura 1B). </li><li> Posicione os eletrodos na radiatum estrato da região CA1, todos os eletrodos alinhadoscima (Figura 3A). Os eléctrodos são reduzidos 75-150 mM sob a superfície da fatia com micromanipuladores Narishige. Os dois eletrodos estimulantes são colocadas para estimular a dois pacotes distintos de Schaffer garantias. Quando os eletrodos são rebaixados para a fatia, papéis de filtro são cuidadosamente colocados ao redor para fechar a câmara. </li><li> Estimulação bifásica (0,08 ms de duração de pulso por meio de ondas) é realizada em tensão constante com um estimulador de grama ligado a unidades de isolamento SIU-V. Resposta máxima é verificada, aumentando a intensidade do estímulo de 2 V a 12 V. máximo EPSP de campo são amplificados 1000 vezes com um WPI ISO-amplificador 80 e filtrada em 10 Hz e 10 kHz. O sinal é então enviada para um PC através de uma National Instrument conversor A / D. Estimulação, aquisição e análise de dados são realizadas utilizando o programa WinLTP ( <a href="http://www.winltp.com">www.winltp.com</a> ). EPSP de campo são registados a 40% da amplitude máxima obtida numa entrada Saídacolocar curva. Para cada fatia, as encostas fEPSP são normalizados contra a inclinação média do min 30 precedendo indução da LTP. </li><li> A LTP é desencadeada pela aplicação de um único trem de estimulação (100 Hz) para testar a força de uma via enquanto o segundo percurso serve como controlo. </li></ol> 9. A limpeza do Setup <ol><li> Lavar todo o circuito, com uma solução a 3% de peróxido de hidrogénio (H 2 O 2) durante pelo menos 10 min, depois drenar. O circuito terá de ser cuidadosamente lavado com água destilada antes de começar cada experiência. O uso de H 2 O 2, não é absolutamente necessário que outros laboratórios utilizam apenas água destilada para a limpeza, mas notamos a deposição de resíduos escuras no sistema tubagem quando se utiliza apenas água. </li><li> Substituir a água em banho-maria sob a câmara de gravação. </li><li> Banheira as dicas eletrodos estimulantes no álcool por 5 min. </li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Temos desenvolvido no nosso laboratório um protocolo que resulta da combinação de métodos desenvolvidos e utilizados por outros laboratórios têm uma grande experiência na LTP gravações 11,17. Este protocolo é adaptado para hipocampo do rato adulto e pode ser usado em animais de qualquer idade e qualquer genótipo de fundo. Ele também permite a análise da LTP em camundongos transgênicos desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer 18,19. <p class="jove...

Hoje em dia, há uma compreensão limitada de como as memórias complexas são armazenados e recuperados no nível do circuito neuronal. No entanto, uma hipótese unificadora de armazenamento de memória disponível e largamente aceites: memórias são armazenadas como variações na força das conexões sinápticas entre neurónios no sistema nervoso central. Por si só, a pesquisa sobre a plasticidade sináptica foi amplamente beneficiado com duas descobertas revolucionárias. (1) Num experimento seminal, Bliss e Lomo 1, utilizando o coelho anestesiado intacto, descobriram que a entrega de uma breve alta frequência (1 s, 100 Hz), a estimulação do caminho perfurante do hipocampo causada uma longa duração (vários horas) aumento das conexões sinápticas relacionadas. Este fenômeno fascinante foi chamado de &quot;potencialização de longo prazo&quot;, ou PLP por Douglas e Goddard, em 1975 2. (2) Mais tarde, verificou-se que um fenómeno semelhante poderá ser desencadeada em fatias de cérebro (0,4 mm), mantido artificialmente vivo, in vitro </em&gt;. A LTP mais amplamente estudados foi observado in vitro, fornecendo um ou vários tetani a um feixe de axónios (os chamados colaterais de Schaffer) durante a gravação do campo resultante sináptica excitatória potencial evocado nos neurónios piramidais da região CA1 chamada. Os mecanismos de indução da LTP têm sido amplamente revelados. Basicamente, um influxo de Ca2 + através dos receptores NMDA activa enzimas com duas consequências: a fosforilação de receptores AMPA (o que aumenta a sua eficiência) e uma incorporação de receptores de AMPA extra na membrana pós-sináptica 3. Por outro lado, os mecanismos da fase de manutenção da LTP são em grande parte desconhecida, nomeadamente porque é experimentalmente muito mais difícil manter uma fatia saudável durante muitas horas de 30 a 60 min. Muitos estudos têm sido dedicados à compreensão dos mecanismos de LTP e teorias interessantes foram elaborados ao longo dos anos 4-11. Mas unaté agora, os mecanismos moleculares exactos subjacentes ao aumento estável na força sináptica não foram elucidados. Isto pode ser parcialmente devido à dificuldade para reproduzir os resultados obtidos em laboratórios diferentes, utilizando diferentes técnicas para a preparação e para a manutenção de fatias do hipocampo. Em seu papel metodologia, Sajikumar et al. 12 ressaltou a importância das condições experimentais para a preparação de fatias de hipocampo de ratos e ao registo das LTP estável. Neste vídeo, apresentamos todas as etapas de otimização desenvolvidos em nosso laboratório ao longo dos anos para poder gravar um LTP muito estável em fatias de hipocampo de ratos. Essa otimização foi feita a partir de protocolos desenvolvidos e utilizados com sucesso por outros laboratórios que estudam mecanismos de LTP em camundongos e ratos 13 11. Ele permite que os investigadores experientes para induzir e gravar uma LTP duradoura por muito tempo em ratos adultos com uma alta taxa de sucesso. O pbase hysiological da LTP induzida foi cuidadosamente verificada e demonstrada 14. Neste trabalho a metodologia, vamos mostrar que qualquer modificação das condições experimentais, como a temperatura ou a oxigenação pode ter um impacto profundo sobre a manutenção LTP enquanto o procedimento de dissecção pode modificar profundamente fatias excitabilidade. Também deve ser enfatizado que o controle preciso de todos estes parâmetros requer um treinamento de vários meses para os alunos novatos.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 1M</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>63126</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen</td>
			<td>Air Liquide (Belgium)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries</td>
			<td>WPI, Inc. (UK)</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulating Electrodes</td>
			<td>FHC (USA)</td>
			<td>CE2B30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td>FST (Germany)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper 84 g/m2</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>FT-3-105-110</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh</td>
			<td>Lycra</td>
			<td>15 den</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>UHU</td>
			<td>plus endfest300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>WPI, Inc. (UK)</td>
			<td>ISO-80</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface recording chamber</td>
			<td>FST (Germany)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pumps</td>
			<td>Gilson (USA)</td>
			<td>Minipuls 3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>University of Edinburgh</td>
			<td><a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a></td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Chopper</td>
			<td>Mcllwain</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulators</td>
			<td>Grass (USA)</td>
			<td>S88X + SIU-V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Program analysis</td>
			<td>WinLTP</td>
			<td><a href="http://www.winltp.com" target="_blank">www.winltp.com</a></td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3 and MMO-220A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A/D converter</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NIPCI-6229 M-series</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved preparation and preservation of hippocampal mouse slices for a very stable and reproducible recording of long-term potentiation

A potenciação de longa duração (LTP), um tipo de plasticidade sináptica, caracterizada por um aumento na força sináptica e acredita estar envolvida na codificação da memória. LTP provocada na região CA1 do hipocampo fatias agudas tem sido extensivamente estudada. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a fase de manutenção deste fenômeno ainda são pouco compreendidos. Isto pode ser em parte devido às várias condições experimentais utilizadas por laboratórios diferentes. Com efeito, a fase de manutenção da LTP é fortemente dependente de parâmetros externos como a oxigenação, temperatura e humidade. É também dependente dos parâmetros internos como orientação do plano de corte e de viabilidade após a dissecação fatia. A optimização de todos estes parâmetros permite a indução de potenciação de uma muito reprodutível e muito estável a longo prazo. Esta metodologia oferece a possibilidade de explorar os mecanismos moleculares envolvidos no aumento estávelna força sináptica em fatias de hipocampo. Ele também destaca a importância das condições experimentais na investigação in vitro de fenômenos neurofisiológicos.

Esta metodologia foi utilizada para analisar as propriedades de potenciação de longa duração a longo prazo induzida em fatias de hipocampo agudas a partir de ratos adultos (C57Bl/6J JANVIER SAS, França) 14. Surpreendentemente, a melhoria das condições experimentais levou a uma nova forma de olhar para a LTP. Nós mostramos que o aumento de longa duração em sináptica não exigem a síntese de novas proteínas. Aqui, vamos mostrar que a indução de LTP depende fatias de v...

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Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Este trabalho apresenta uma metodologia completa para se preparar e preservar<em&gt; In vitro</em&gt; Fatias de hipocampo agudos de ratos adultos. Este protocolo permite a gravação de potenciação de longa duração de longa duração muito estável (LTP), durante mais de 8 horas, com uma taxa de sucesso de 95%.

Melhoria da preparação e preservação de fatias do hipocampo de camundongos para uma gravação muito estável e reprodutível de potenciação de longa duração

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

improved-preparation-preservation-hippocampal-mouse-slices-for-very

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.6K visualizações.  University of Mons. Este trabalho apresenta uma metodologia completa para se preparar e preservar In vitro Fatias de hipocampo agudos de ratos adultos. Este protocolo permite a gravação de potenciação de longa duração de longa duração muito estável (LTP), durante mais de 8 horas, com uma taxa de sucesso de 95%.

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Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Preparação de Oligoméricas β-amilóide 1-42 Indução e de Impairment plasticidade sináptica em fatias do hipocampo

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Neurociência

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

Preparação de fatias do hipocampo aguda de ratos e camundongos transgênicos para o Estudo das Alterações Synaptic durante o envelhecimento e amilóide Patologia

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reprodutível mouse esmagamento do nervo ciático e subsequente avaliação de Regeneração por Análise Whole Mount muscular

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

A polido e reforçado Janela afinado crânio para longo prazo de imagens do cérebro de camundongo

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

Preparação de um mouse Awake para gravar as respostas neurais e injetando Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

A Leitura Molecular de adaptação a longo prazo olfativa em<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Emparelhados Recordings células inteiras em organotï¿½icas fatias do hipocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Longo prazo Time Lapse Imagem do mouse cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Um método simplificado para Ultra-Baixa Densidade, Long-Term Primária do hipocampo Neuron Cultura

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Gravação de plasticidade sináptica em fatias Hippocampal agudas, mantidas em um pequeno volume reciclagem - perfusão- e sistema de câmara de submersão-tipo

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...