O autor gostaria de agradecer a Steve Siegelbaum pelo apoio. O financiamento é fornecido pelo 5R01NS106983-02, bem como 1 F31 NS113466-01.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Columbia (AC-AAAU9451).
1. Preparar soluções
<ol><li>Prepare a solução de corte de sacarose para fatiamento, conforme descrito na Tabela 1. NOTA: Após preparar 1 L de solução de sacarose, congele uma pequena quantidade (aproximadamente 100-200 mL) em uma bandeja de gelo. Estes cubos de gelo de sacarose congelados serão misturados em um chorume gelado (ver passo 4.3).</li>
	<li>Prepare o fluido cefalorraquidiano artificial (ACSF) para gravação conforme descrito na Tabela 2.</li>
	<li>Prepare 1 M de NaCl para pipetas de estimulação dissolvendo 0,05844 g de NaCl em 1 mL de água purificada que foi filtrada para remover metais de traço e outras impurezas. NOTA: A solução de corte de sacarose e a ACSF devem ser preparadas frescas para cada experimento.</li>
</ol>2. Prepare a rampa de ágar
<ol><li>Prepare 4% de ágar (por exemplo, 2 g de ágar em 50 mL de água) dissolvendo o pó de ágar em água purificada que foi filtrada para remover metais de traço e outras impurezas. Aqueça a mistura em um micro-ondas até começar a ferver (aproximadamente 30-60 s). Despeje o ágar derretido em um molde e deixe esfriar e solidificar a 4 °C em uma geladeira a aproximadamente 12° inclinação. NOTA: Para um molde, pode-se usar qualquer conjunto de vidro ou recipiente plástico em um ângulo, com ágar derretido suficiente derramado para formar uma rampa de 4 cm de comprimento e aproximadamente 0,8 cm de altura.</li>
</ol>3. Encenou a área de corte
<ol><li>Encha um béquer de 400 mL contendo uma câmara de recuperação de fatias com aproximadamente 250 mL de ACSF; colocá-lo em um banho de água aquecido a 32 °C e começar a borbulhar com carbogen (95% gás oxigênio/5% gás dióxido de carbono). NOTA: Encha o béquer de recuperação com fluido suficiente para colocar a malha de nylon da câmara de retenção na própria superfície da solução, de modo que as fatias sejam mantidas na interface da mistura de solução quente e no ar(Figura 1). Coloque pequenos pedaços de papel de lente na malha de nylon. As fatias ficarão em cima do papel da lente, que mais tarde pode ser usado para transferir fatias individualmente para a câmara de gravação (ver passo 6.6).</li>
	<li>Coloque um frasco com a solução de sacarose em um balde de gelo para esfriar e comece a borbulhar com carbogen. NOTA: A solução de béquer e sacarose deve ser aquecida e refrigerada, respectivamente, com carbogen borbulhando por pelo menos 30 minutos antes do mouse ser colocado na câmara isoflurane.</li>
	<li>Retire a bandeja de cubos de gelo pré-fabricados e congelados da solução de sacarose do congelador e coloque no banco para descongelar parcialmente.</li>
	<li>Coloque metade de uma lâmina de barbear de dois gumes limpa no microtome e calibrar se necessário. Reserve a outra metade da lâmina de barbear para uso durante a dissecção.</li>
	<li>Execute uma linha de carbogen e sonda de temperatura na câmara de corte e cerque com gelo para esfriar a câmara.</li>
	<li>Prepare um banco limpo ou mesa coberta com duas almofadas absorventes descartáveis. Coloque todas as ferramentas de dissecção e três pedaços de fita de laboratório na almofada esquerda, onde será realizada a perfusão transcárdia. NOTA: As ferramentas de dissecção incluem tesouras pequenas de Bonn, tesoura dissecatória, espátula/colher grande, microspatula, bisturi com nova lâmina, espátula, tesoura cirúrgica afiada/contundente, fórceps de tecido grande e pequenas fórceps teciduais (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Na outra almofada absorvente à direita da área de perfusão, coloque um pedaço circular de papel filtro na tampa de uma placa de petri de vidro de 100 mm de diâmetro. Coloque o fundo da placa de Petri ao lado da tampa e coloque uma linha de carbogen em ambos os pedaços do prato.</li>
	<li>Use uma lâmina de barbear ou bisturi para cortar uma pequena rampa de ágar (aproximadamente 4 cm ao longo da superfície angular, 0,8 cm de altura, 2 cm de largura). Corte um pedaço da rampa da extremidade alta e reverta para criar um bloco de apoio de ágar. Use adesivo de cianoacrilato para fixar a rampa do ágar e o bloco de apoio à plataforma de corte e reserve. NOTA: O bloco de apoio do ágar ajuda a estabilizar o cérebro durante o corte e fornece uma superfície na qual dissecar tecidos desnecessários de cada fatia(Figura 1).</li>
</ol>4. Perfusão transcárvia
<ol><li>Suspenda uma seringa de capacidade de 60 mL como reservatório para solução de corte de sacarose aproximadamente 18 polegadas acima da bancada (por exemplo, usando um grampo giratório de três pontas em um poste vertical). Anexar tubos ao fundo do reservatório, executar a tubulação através de um grampo de rolo, e conectar a outra extremidade do tubo a uma agulha limpa de 20 G.</li>
	<li>Encha o reservatório de 60 mL com aproximadamente 30 mL de solução de sacarose resfriada e direcione uma linha de carbogen para dentro do reservatório de sacarose para borbulhar continuamente o perfusato. NOTA: Certifique-se de que a sacarose está fluindo através da tubulação e agulha sem quaisquer bolhas presas. A vazão deve ser rápida o suficiente para ter um fluxo constante e contínuo de sacarose pingando da agulha.</li>
	<li>Usando um liquidificador, triture e misture a sacarose congelada em um chorume gelado e use a espátula/colher grande para distribuir o chorume.<ol>
<li>Coloque uma pequena quantidade de pasta de sacarose ao redor das bordas da tampa da placa de petri de vidro. Adicione uma pequena quantidade de pasta de sacarose ao fundo da placa de Petri.</li>
		<li>Adicione cerca de 20-30 mL de sacarose ao reservatório de fluido de perfusão, misturando-o bem com os 30 mL de sacarose líquida resfriada até que o reservatório contenha uma mistura de sacarose muito fria e predominantemente líquida com alguma solução congelada remanescente.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque o mouse em uma câmara conectada a um vaporizador de isoflurane. Com o oxigênio fluindo a aproximadamente 2 L/min, gire o mostrador do vaporizador para entregar isoflurane a 5% de concentração e inicie um temporizador. NOTA: Mantenha este temporizador durante todo o processo de corte para medir a rapidez com que as fatias são obtidas. O procedimento deve ser feito o mais rápido possível, de modo que o corte esteja completo, e o tecido esteja se recuperando na câmara de interface dentro de 15-20 minutos do animal que entra na câmara isoflurane. Observe o mouse para garantir que um estado de anestesia profunda seja alcançado. Após um mínimo de 5 minutos, o mouse deve ser profundamente anestesiado e sem resposta para pinças do dedo do dedo.</li>
	<li>Imediatamente antes de remover o mouse da câmara de isoflurane, encha a tampa da placa de Petri com solução de sacarose resfriada a uma profundidade de aproximadamente 3-5 mm e encha o fundo da placa de Petri com solução de sacarose gelada a uma profundidade de aproximadamente 1,0 cm.</li>
	<li>Transfira rapidamente o mouse para a almofada absorvente esquerda e use as 3 peças de fita para fixar os membros dianteiros e a cauda. Execute uma pinça do dedo do pé traseiro para garantir que o mouse não responda antes que qualquer incisão seja realizada. Usando as grandes fórceps teciduais e tesouras cirúrgicas, tenda a pele e faça uma incisão longitudinal da parte inferior do esterno até o topo do peito. Usando as fórceps puxe para cima no esterno e use a tesoura para cortar através do diafragma. NOTA: O posicionamento inicial do mouse e as primeiras incisões para cortar o diafragma devem ser realizados o mais rápido possível para garantir que o mouse não recupere a consciência. Para garantir uma profundidade adequada da anestesia durante todo o procedimento, um cone de nariz pode ser colocado no mouse para entregar isoflurane durante a perfusão.</li>
	<li>Use a tesoura para cortar a caixa torácica de cada lado, cortando em um grande movimento em direção ao ponto onde o membro dianteiro encontra o corpo. Com os fórceps, gire a frente da caixa torácica para longe e para cima em direção à cabeça, e então remova-a totalmente com um corte horizontal usando a tesoura grande. Segure o coração no lugar usando as grandes fórceps e insira a agulha de perfusão de 20 G no ventrículo esquerdo. Uma vez que a agulha esteja posicionada corretamente, o lado esquerdo do coração deve rapidamente empalidecer à medida que a solução de sacarose resfriada preenche o ventrículo.</li>
	<li>Use a pequena tesoura dissecadora para cortar no átrio direito e permitir que o sangue flua para fora do sistema circulatório. Se as incisões forem realizadas corretamente, deve haver danos mínimos ao coração, e deve continuar bombeando durante toda a perfusão. NOTA: Pedaços enrolados de papel de tecido podem ser usados para afastar a solução de sangue e sacarose do coração e manter a visibilidade da agulha de perfusão durante o procedimento.</li>
	<li>Certifique-se de que a agulha de perfusão permaneça no lugar e não caia do ventrículo esquerdo. Com uma taxa de fluxo e colocação adequadas, o fígado começará a empalidecer a uma cor bronzeada/bege leve com 20-30 s.</li>
	<li>Depois de 30-45, use a tesoura grande para decapitar o rato. Segurando a cabeça na mão esquerda, empurre ou descasque a pele do crânio. Em um animal bem perfumado, o crânio deve ser muito pálido, e o cérebro deve aparecer uma cor rosa muito clara (aproximando-se de branco) através do crânio sem vasos sanguíneos claramente visíveis.</li>
</ol>5. Extrair o cérebro e cortar fatias
<ol><li>Usando a pequena tesoura Bonn, faça dois cortes laterais através do crânio em direção à linha média na frente do crânio, perto dos olhos. Faça dois cortes adicionais em cada lado da base do crânio.</li>
	<li>Transfira a cabeça para o fundo da placa de vidro Petri, onde deve ser principalmente imersa em solução de sacarose gelada. Use a pequena tesoura bonn para cortar a linha média ao longo do comprimento do crânio, puxando para cima com a tesoura para minimizar danos ao tecido cerebral subjacente. Usando as pequenas fórceps teciduais, segure firmemente cada lado do crânio e gire-o para cima e para longe do cérebro, como abrir um livro.</li>
	<li>Use os dedos da mão esquerda para segurar os retalhos do crânio abertos e inserir a microspatula sob o cérebro perto das lâmpadas olfativas. Vire o cérebro para fora do crânio na sacarose e use a microspatula para cortar o tronco cerebral. Lave o cérebro para remover qualquer sangue residual, pele ou outros tecidos.</li>
	<li>Use a espátula/colher grande para transferir o cérebro para a tampa da placa de vidro Petri. Com a outra metade da lâmina de barbear de dois gumes previamente reservada, faça dois cortes coronais para primeiro remover o cerebelo e, em seguida, a porção mais anterior do cérebro, incluindo as lâmpadas olfativas(Figura 1).</li>
	<li>Aplique adesivo de cianoacrilato na rampa do ágar. Coloque brevemente o cérebro em um pedaço de papel filtro seco usando as grandes fórceps teciduais e, em seguida, transfira imediatamente para a rampa do ágar, colocando a superfície ventral do cérebro sobre o adesivo. NOTA: Para fatias do hipocampo intermediário, o cérebro deve ser orientado com o anterior voltado para a inclinação da rampa, e o posterior mais perto da lâmina. Para fatias do hipocampo ventral, oriente o cérebro com a extremidade anterior apontada para baixo da encosta da rampa, com a extremidade posterior no topo da rampa, mais longe da lâmina. Em ambos os casos, o cérebro deve ser posicionado no topo da rampa, de tal forma que a superfície coronally cortada do cérebro entra em contato com o bloco de apoio doágar (Figura 1).</li>
	<li>Coloque a plataforma de corte com o ágar e o cérebro na câmara de corte do microtome e mergulhe completamente com solução de sacarose gelada. Use a espátula/colher grande para transferir um pouco de sacarose para a câmara, mexendo para derreter qualquer sacarose congelada e rapidamente baixar a temperatura da mistura para ~1-2 °C. NOTA: Observe o medidor de temperatura durante todo o corte. Se a solução de sacarose aquecer acima de 3 °C, adicione mais chorume e misture para baixar a temperatura.</li>
	<li>Corte as fatias a uma espessura de 450 μm com a velocidade do microtome definida para 0,07 mm/s. À medida que cada fatia é liberada, use as pequenas fórceps teciduais e um bisturi afiado para primeiro separar os dois hemisférios, e depois cortar tecido até que a fatia consista principalmente nas regiões hipocampo e parahiptocampal(Figura 1).</li>
	<li>Use uma pipeta de transferência de plástico para transferir as fatias individualmente para a câmara de recuperação da interface, garantindo que elas estejam posicionadas na interface do ACSF e no ar com apenas um menisco fino de ACSF cobrindo as fatias. Feche bem a tampa da câmara e deixe as fatias se recuperarem a 32 °C por 30 min.</li>
	<li>Após a recuperação inicial a 32 °C, tire a câmara de recuperação da interface do banho de água e coloque em um agitador a uma velocidade lenta, de modo que a barra de agitação magnética promova a circulação de ACSF dentro da câmara. Deixe esfriar gradualmente até a temperatura ambiente à medida que as fatias se recuperam por mais 90 minutos. Certifique-se de que a câmara de recuperação seja continuamente borbulhada com carbogen e não permita que grandes bolhas fiquem presas sob as fatias.</li>
</ol>6. Realizar gravações de potencial de campo local (LFP) de atividade espontânea
<ol><li>Prepare-se para gravações de LFP ligando todos os equipamentos necessários, incluindo o computador executando o software de aquisição, o monitor conectado ao computador, os estimuladores, o micromanipulador, o controlador de temperatura, a fonte de luz do microscópio, a câmera ligada ao microscópio, o amplificador de microeletromes, o digitalizador e a bomba peristáltica. Se usar um sistema de vácuo central, abra a válvula de parede para preparar a linha de vácuo que removerá o ACSF da câmara de gravação.</li>
	<li>Encha o reservatório aquecido com ACSF e coloque uma extremidade da tubulação no béquer de 400 mL contendo o ACSF borbulhante. Ligue a bomba peristáltica para direcionar o ACSF do béquer de 400 mL para o reservatório aquecido, e do reservatório em diante para a câmara de gravação. Toque ou aperte a tubulação para liberar quaisquer bolhas presas.</li>
	<li>Ajuste a bomba peristáltica para garantir que a taxa de fluxo DESF através da câmara de gravação seja rápida (~ 8-10 mL/min). Use uma sonda de temperatura para garantir que o ACSF esteja a 32 °C no centro da câmara de gravação. NOTA: Se o ACSF for entregue na câmara de gravação usando uma bomba peristáltica, uma alta taxa de fluxo pode resultar em uma flutuação significativa na taxa de fluxo. Taxas de fluxo consistentes podem ser alcançadas usando um simples amortecedor de pulsação consistindo de uma série de seringas vazias integradas ao tubo(Figura 2).</li>
	<li>Prepare a estimulação e a gravação de pipetas de capilares de vidro borossilicato usando um puxador de filamento aquecido. O protocolo puller deve ser configurado para produzir pipetas com uma resistência de 2-3 MOhm para estimulação ou eletrodos de gravação em potencial de campo local.</li>
	<li>Encha as pipetas de estimulação com pipetas de 1 M NaCl e LFP com ACSF.</li>
	<li>Fixar brevemente a tubulação e desligar a bomba para pausar o fluxo de ACSF. Transfira uma fatia para a câmara de gravação usando fórceps finos para agarrar um canto do papel da lente que a fatia está apoiada na fatia grudará no papel da lente. Coloque o papel da lente e corte na câmara de gravação com a fatia virada para baixo, em seguida, "descasque" o papel da lente deixando a fatia submersa na câmara de gravação. Segure a fatia usando uma harpa. NOTA: As harpas podem ser compradas pré-fabricadas ou feitas em laboratório usando uma peça em forma de U de aço inoxidável ou filamento de nylon fino e de platina.</li>
	<li>Coloque uma pipeta de estimulação cheia de NaCl no micromanipulador manual e avance lentamente a ponta da pipeta para a superfície da fatia (por exemplo, na camada de radiador do estrato) em um ângulo de aproximadamente 30-45°. Uma vez que a ponta da pipeta entre no tecido, avance a pipeta lentamente e abstenha-se de grandes movimentos na direção lateral ou vertical que poderiam danificar desnecessariamente os axônios dentro da fatia. Coloque a ponta da pipeta a pelo menos 50-100 μm de profundidade na fatia para evitar células próximas à superfície que foram danificadas durante o corte.</li>
	<li>Coloque uma pipeta LFP preenchida pela ACSF no porta-tubos ligado ao micromanipulador motorizado. Aplique uma pressão positiva muito leve usando pressão bucal ou uma seringa de 1 mL conectada através de uma válvula de torneira e um curto comprimento de tubulação ao suporte da pipeta. NOTA: Posição Pipetas LFP dentro da fatia para registrar os sinais de interesse: no caso de ondulações de ondas acentuadas, uma pipeta LFP deve ser colocada no estrato pyramidale (SP) e uma segunda pipeta no radiador estrato (SR). Esta configuração permite gravações simultâneas da onda acentuada negativa no RS e da oscilação de ondas de alta frequência na SP (Figura 3).</li>
	<li>Usando o micromanipulador, avance lentamente a ponta da pipeta LFP para a região de interesse (por exemplo, a camada de célula piramimácida CA1) em um ângulo de aproximadamente 30-45°. Coloque a ponta da pipeta a pelo menos 50-100 μm de profundidade na fatia para evitar células próximas à superfície que foram danificadas durante o corte. Ao avançar a pipeta LFP, ofereça continuamente um pequeno pulso de teste de tensão usando o software de aquisição e observe um aumento repentino na resistência ao eletrodo. Isso pode indicar que a pipeta foi entupida ou pressionada contra uma célula.</li>
	<li>Uma vez que a pipeta LFP esteja posicionada na região de interesse, solte cuidadosamente a pressão positiva abrindo a válvula na tubulação presa ao suporte da pipeta.</li>
	<li>Para registrar o LFP em um segundo local simultaneamente, repita as etapas 6.8-6.10 com uma segunda pipeta e micromanipulador.</li>
	<li>Use o amplificador de microeletroda na configuração atual do grampo para registrar atividade espontânea no potencial de campo local após o uso da função de equilíbrio da ponte no software de aquisição para corrigir a resistência em série da pipeta. SwRs espontâneos aparecerão como deflexões positivas no potencial extracelular da camada sp(Figura 3).</li>
	<li>Para registrar os potenciais de campo evocados, use os estimuladores conectados ao digitalizador para fornecer um pulso curto (200 dólares) de tensão quadrada através da pipeta de estimulação preenchida pela NaCL. Ajuste o mostrador de tensão de estimulação para evocar uma gama de amplitudes de resposta.</li>
</ol>

O autor não tem nada a revelar.

Existem várias etapas neste protocolo de corte projetado para promover a saúde do tecido e favorecer o surgimento da atividade de rede naturalista espontânea: o camundongo é transcardialmente perfumado com solução de corte de sacarose resfriada; as fatias do córtex horizontal-entorhinal (HEC) são cortadas a uma espessura de 450 μm do hipocampo intermediário ou ventral; as fatias se recuperam na interface do ACSF aquecido e do ar umidificado e rico em carbogen; durante as gravações as fatias são superfundidas...

A medição eletrofisiológica de fatias hipocampais vivas in vitro é uma abordagem experimental poderosa com inúmeras vantagens. O experimentador pode usar um microscópio, micromanipuladores e um sistema de gravação para visualizar e coletar diretamente medições de neurônios individuais no tecido. As fatias de tecido também são muito acessíveis à fotostimulação ou à entrega de medicamentos para experimentos optogenéticos, quimigênicos ou farmacológicos.
A rede hipocampal gera atividade populacional altamente síncrona in vivo,visível como oscilações no potencial de campo local extracelular1,2,3,4,5. Os métodos de fatia cerebral foram aproveitados para obter uma visão dos mecanismos celulares e de circuito subjacentes a essas oscilações da rede neuronal. O trabalho fundamental de Maier et al. demonstrou que complexos de ondas acentuadas (SWRs) podem surgir espontaneamente em fatias do hipocampo ventral6,7. Estudos subsequentes de múltiplos pesquisadores têm gradualmente elucidado muitos aspectos das SWRs, incluindo o papel dos neuromoduladores na regulação do estado de rede do hipocampo8,9,10 e os mecanismos sinápticos que impulsionam a reativação in vitro de conjuntos neuronais anteriormente ativos durante o comportamento in vivo11. Experimentos com fatias cerebrais também forneceram uma visão da oscilação da gama gama gama (30-100 Hz), um estado distinto da rede hipocampal que se acredita apoiar a codificação da memória e recordar12,13. Finalmente, reconhecendo o papel central do hipocampo e das estruturas associadas na fisiopatologia da epilepsia do lobo temporal14,15, pesquisadores têm usado preparações de fatias hipocampais para investigar a geração e propagação da atividade epilépforme. Carter et al. demonstraram que fatias combinadas de córtex hipocampal-entorhinal preparadas a partir de animais cronicamente epilépticos podem gerar espontaneamente descargas epilépticas in vitro16. Posteriormente, Karlócai et al. exploraram os mecanismos subjacentes às descargas epilépformas em fatias hipocampais usando fluido cerebrospinal artificial modificado (ACSF) com concentrações de íons alteradas (Mg2+ ou K+elevados ) ou drogas adicionadas (4AP ou gabazina)17.
Os pesquisadores desenvolveram numerosas abordagens de fatias hipocampais que diferem de formas-chave: (1) a região do hipocampo contida na fatia (dorsal, intermediária ou ventral); (2) a presença ou ausência de tecidos extrahiptocampais, como o córtex entorhinal; (3) a orientação utilizada para cortar fatias (coronal, sagital, horizontal ou oblíqua); e (4) as condições sob as quais o tecido é mantido após o corte (submerso totalmente em ACSF ou mantido na interface do ACSF e ar umidificado, rico em carbogênio).
A escolha de qual abordagem de corte deve ser determinada pelo objetivo experimental. Por exemplo, fatias transversais ou coronais do hipocampo dorsal mantidas em condições submersas têm sido utilizadas de forma muito eficaz para a investigação de circuitos intrahipotecampal e plasticidade sináptica18,19,20. No entanto, tais preparações não geram espontaneamente oscilações de rede tão facilmente quanto fatias do hipocampo ventral21,22,23. Embora um estado de atividade SWR persistente possa ser induzido pela estimulação tetanica em fatias transversais do hipocampo dorsal e ventral24, swRs espontâneos são mais facilmente observados em fatias ventrais7,25.
Uma distinção fisiológica e anatômica inerente entre o hipocampo dorsal e ventral é apoiada por estudos realizados tanto in vivo quanto in vitro26. Gravações em ratos revelaram ritmos de fortemente coerentes em todo o hipocampo dorsal e intermediário, mas com pouca coerência entre a região ventral e o resto do hipocampo27. SWRs in vivo propagam-se prontamente entre o hipocampo dorsal e intermediário, enquanto os SWRs que se originam no hipocampo ventral permanecem frequentemente locais28. As projeções associacionais originárias de neurônios piramimais ca3 que residem no projeto de hipocampo dorsal e intermediário a longas distâncias ao longo do eixo longitudinal do hipocampo. As projeções de CA3 originárias de regiões ventrais permanecem relativamente locais e, portanto, são menos propensas a serem cortadas durante o processo de corte29,30. As fatias ventrais podem, portanto, preservar melhor a rede recorrente necessária para gerar sincronia populacional. A propensão de fatias ventrais para gerar atividades espontâneas de rede in vitro também pode refletir maior excitabilidade intrínseca de neurônios piramidários ou inibição mais fraca do hipocampo ventral em comparação com regiões mais dorsais31. De fato, as fatias hipocampais ventrais são mais suscetíveis à atividade epilépforme32,33. Assim, muitos estudos de fisiológicas espontâneas8,9,11,24 ou patológicos16,34,35,36 oscilações de rede têm tradicionalmente utilizado uma abordagem de corte horizontal, às vezes com um leve ângulo na direção fronto-occipital, que produz fatias de tecido paralelas ao plano transversal do hipocampo ventral.
A conectividade de rede é inevitavelmente impactada pelo procedimento de corte, pois muitas células na fatia serão cortadas. O ângulo e a espessura da fatia e o tecido retido na preparação devem ser considerados para otimizar a conectividade nos circuitos de interesse. Muitos estudos utilizaram fatias horizontais combinadas de córtex hipocampal-entorhinal (HEC) para explorar interações entre as duas estruturas no contexto de oscilações fisiológicas ou patológicas da rede. Roth et al. realizaram gravações duplas do subcampo CA1 do hipocampo e da camada V do córtex entorhinal medial para demonstrar a propagação da atividade SWR através da fatia HEC37. Muitos estudos de atividade epilepiforme têm utilizado a preparação da fatia hec para investigar como as descargas epilépformes se propagam através da rede corticohippocampal16,35,36,38. É importante notar que a preservação do laço corticohippocampal intacto não é um pré-requisito para SWRs espontâneos, descargas epilépticas ou oscilações gama; oscilações de rede podem ser geradas em fatias transversais do hipocampo dorsal ou ventral sem tecidos parahiptocampais anexados21,22,23, 25,39,40,41. Um fator mais importante para a geração espontânea de oscilações de rede em fatias hipocampais pode ser a espessura de cada fatia, pois uma fatia mais grossa (400-550 μm) preservará mais conectividade na rede recorrente CA2/CA321,22,25.
Embora as fatias de HEC horizontais angulares (cortadas com ângulo de aproximadamente 12° na direção fronto-occipital) tenham sido utilizadas para estudar a conectividade funcional do laço corticohippocampal11,16,34,35,42, tais preparações angulares não são necessárias para a atividade espontânea da rede43,44,45. No entanto, o uso de um plano de corte angular permite ao investigador fazer seletivamente fatias que melhor preservem o lamellae transversalmente orientado do hipocampo ventral ou intermediário, dependendo se um ângulo para baixo ou para cima é aplicado(Figura 1). Esta abordagem é conceitualmente semelhante à usada por Papatheodoropoulos et al., 2002, que dissecou cada hipocampo livre e depois usou um helicóptero de tecido para criar fatias transversais ao longo de todo o eixo dorsal-ventral21. À luz das distinções funcionais acima mencionadas entre o hipocampo ventral e dorsal-intermediário, os pesquisadores devem considerar a origem anatômica das fatias ao projetar experimentos ou interpretar resultados. O uso de uma rampa de ágar durante o procedimento de corte é uma maneira simples de produzir preferencialmente fatias do hipocampo intermediário ou ventral.
As fatias hipocampais podem ser mantidas em uma câmara submersa (com o tecido totalmente imerso em ACSF), ou em uma câmara de estilo interface (por exemplo, câmara de Oslo ou Haas, com fatias cobertas apenas por uma fina película de mídia fluindo). A manutenção da interface aumenta a oxigenação do tecido, o que promove a sobrevivência neuronal e permite altos níveis sustentados de atividade interneuronal. Tradicionalmente, as condições de gravação submersas utilizam uma taxa de fluxo ACSF mais lenta que não fornece oxigenação adequada do tecido para uma expressão estável de oscilações em nível de rede. Em fatias hipocampais submersas, as oscilações gama induzidas por carbachol são observadas apenas transitoriamente46,47, enquanto podem ser mantidas de forma estável nas câmaras de gravação de interface10,48,49. Como tal, muitos estudos de atividade espontânea complexa in vitro têm se apoiado em câmaras de gravação de interface para investigar complexos de ondas agudas6,7,8,9,10,25,37, oscilações gama10,13, e atividade epilépforma16,38,45,47.
Em uma câmara de gravação de estilo submerso, um objetivo de microscópio de imersão pode ser usado para visualizar células individuais e direcionar seletivamente células de aparência saudável para gravações. A preparação submersa também permite um bom controle sobre o meio celular, pois a submersão facilita a rápida difusão de drogas ou outros compostos para o tecido. Assim, uma metodologia modificada na qual as oscilações estáveis da rede são mantidas em condições submersas representa uma abordagem experimental poderosa. Esta abordagem é exemplificada pelo trabalho de Hájos et al., no qual as fatias hipocampais se recuperam em uma câmara de retenção simplificada no estilo interface por várias horas antes da transferência para uma câmara de gravação submersa modificada com uma alta taxa de fluxo de ACSF (~6 mL/min) para aumentar o fornecimento de oxigênio ao tecido12,48,49. Nessas condições, altos níveis de atividade interneuron e oscilações estáveis da rede espontânea podem ser mantidos em uma câmara de gravação submersa. Esta abordagem modificada permite que os pesquisadores realizem gravações de grampos de remendo de células inteiras visualmente guiadas e caracterizem a contribuição de tipos de células morfologicamente identificadas para as oscilações gama induzidas por carbachol12. SwRs também podem ocorrer espontaneamente em fatias hipocampais submersas com uma taxa de fluxo rápida de ACSF11,48,49. Maier et al. demonstraram que as fatias hipocampais que se recuperaram em uma câmara de interface antes da transferência para uma câmara de gravação submersa exibiam de forma confiável SWRs espontâneas, enquanto as fatias que se recuperavam submersas em um béquer antes da transferência para uma câmara de gravação submersa apresentaram respostas de campo evocadas menores, níveis mais baixos de correntes sinápticas espontâneas, e apenas muito raramente exibiam SWRs espontâneos43. Schlingloff et al. utilizaram essa metodologia aprimorada para demonstrar o papel das células cestos expressas por parvalbumin na geração de SWRsespontâneas 44.
O protocolo a seguir apresenta um método de corte através do qual neurônios espontaneamente ativos em fatias hipocampais horizontais podem ser recuperados em condições de interface e posteriormente mantidos em uma câmara de gravação submersa adequada para manipulações farmacológicas ou optogenéticas e gravações visualmente guiadas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Lulzbot</td>
			<td>LulzBot TAZ 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acute brain slice incubation holder</td>
			<td>NIH 3D Print Exchange</td>
			<td>3DPX-001623</td>
			<td>Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9187-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag-Cl ground pellets</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-1309, (E205)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>214530-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (250 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beaker (400 mL)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>14000-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blender</td>
			<td>Oster</td>
			<td>BRLY07-B00-NP0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn scissors, small</td>
			<td>becton, Dickinson</td>
			<td>14184-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-86-10HP</td>
			<td>Fire polished capillaries are preferable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride solution (1 M)</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>R040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLY-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compressed oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>constant voltage isolated stimulator</td>
			<td>Digitimer Ltd.</td>
			<td>DS2A-Mk.II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips (22x50 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>KG925</td>
			<td>Ideally use the brush-on form for precision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data acquisition software</td>
			<td>Axograph</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any equivalent software (e.g. pClamp) would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop</td>
			<td>Dell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-2950-0367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td>4-channel Traceable timer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable absorbant pads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissector scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14082-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-edge razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>BP9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual automatic temperature controller</td>
			<td>Warner Instrument Corporation</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment rack</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>FR-EQ70&#34;</td>
			<td>A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N&#39;,N&#39;-teetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004 070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>XS204DR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass petri dish (100 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3160-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice buckets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>BAM168072002-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
			<td>General Anesthetic Services</td>
			<td>Tec 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lens paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>TH4-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride solution (1 M)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-56</td>
			<td>Catalog number will be dependent on the size of the stir bar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator (manual)</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>LBM-2000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10089-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monitor</td>
			<td>Dell</td>
			<td>2007FPb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>MULTICLAMP 700B</td>
			<td>The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle (20 gauge, 1.5 in length)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon filament</td>
			<td>YLI Wonder Invisible Thread</td>
			<td>212-15-004</td>
			<td>size 0.004. This cat. # is from Amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon mesh</td>
			<td>Warner Instruments Corporation</td>
			<td>64-0198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perstaltic pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine di(tris) salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1937-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holders</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum wire</td>
			<td>World Precision</td>
			<td>PT0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polylactic acid (PLA) filament</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td>RAL 9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1550001-200MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60377-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>razor blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roller clamp</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>PM2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slice harp</td>
			<td>Warner</td>
			<td>SHD-26GH/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S369-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula/spoon, large</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470149-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile scalpel blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>72044-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirrer / hot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6795-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 1-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopcock valves, 3-way</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC177142500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>support for swivel clamps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-679Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors, sharp/blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (1 mL)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe (60 mL with Luer-Lok tip)</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>three-pronged clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-769-8Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, large</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11021-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue forceps, small</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfer pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>E-3603</td>
			<td>ID 1/16 inch, OD 3/16 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>R-3603</td>
			<td>ID 1/8 inch, OD 1/4 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT 1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibration-dampening table with faraday cage</td>
			<td>Micro-G / TMC-ametek</td>
			<td>2536-516-4-30PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (1 L)</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>KIM-28014-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volumetric flask (2 L)</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>65640-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>warm water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1209 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute mouse brain slicing to investigate spontaneous hippocampal network activity

O corte cerebral de roedores agudos oferece uma abordagem experimental tratável para obter uma visão sobre a organização e função de circuitos neurais com resolução unicelular usando eletrofisiologia, microscopia e farmacologia. No entanto, uma grande consideração no desenho de experimentos in vitro é a extensão em que diferentes preparações de fatias recapitulam padrões naturalistas da atividade neural como observado in vivo. No cérebro intacto, a rede hipocampal gera atividade populacional altamente sincronizada refletindo o estado comportamental do animal, como exemplificado pelos complexos de ondas agudas (SWRs) que ocorrem durante o despertar de estados consumados ou sono não-REM. SWRs e outras formas de atividade de rede podem surgir espontaneamente em fatias hipocampais isoladas em condições apropriadas. Para aplicar o poderoso kit de ferramentas de fatia cerebral à investigação da atividade da rede hipocampal, é necessário utilizar uma abordagem que otimize a saúde do tecido e a preservação da conectividade funcional dentro da rede hipocampal. Os camundongos são transcardialmente perfundidos com fluido cerebrospinal artificial à base de sacarose fria. As fatias horizontais contendo o hipocampo são cortadas a uma espessura de 450 μm para preservar a conectividade sináptica. As fatias se recuperam em uma câmara estilo interface e são transferidas para uma câmara submersa para gravações. A câmara de gravação foi projetada para superfusão de superfície dupla de fluido cerebrospinal artificial a uma alta taxa de fluxo para melhorar a oxigenação da fatia. Este protocolo produz tecido saudável adequado para a investigação de atividades complexas e espontâneas da rede in vitro.

Apresentados aqui estão gravações representativas de fatias hec preparadas como descrito neste protocolo. Após a recuperação em uma câmara de retenção de interface(Figura 1C),as fatias são transferidas individualmente para uma câmara de gravação submersa(Figura 2B). A câmara de gravação é fornecida com ACSF saturada de carbogênio usando uma bomba peristáltica(Figura 2A). A bomba primeiro atrai ACSF de um béquer d...

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Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Este protocolo descreve a preparação de fatias horizontais do córtex hipocampal-entorhinal (HEC) de camundongos que exibem atividade espontânea de ondulação de ondas afiadas. As fatias são incubadas em uma câmara de realização de interface simplificada e as gravações são realizadas em condições submersas com fluido cerebrospinal artificial de fluxo rápido para promover a oxigenação tecidual e o surgimento espontâneo da atividade em nível de rede.

Corte cerebral aguda do rato para investigar atividade espontânea da rede hipocampal

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

acute-mouse-brain-slicing-to-investigate-spontaneous-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K visualizações.  Columbia University. Este protocolo descreve a preparação de fatias horizontais do córtex hipocampal-entorhinal (HEC) de camundongos que exibem atividade espontânea de ondulação de ondas afiadas. As fatias são incubadas em uma câmara de realização de interface simplificada e as gravações são realizadas em condições submersas com fluido cerebrospinal artificial de fluxo rápido para promover a oxigenação tecidual e o surgimento espontâneo da atividade em nível de rede.

Vídeo: Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Combining Transcranial Magnetic Stimulation and fMRI to Examine the Default Mode Network

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful rest."1,2,3 It is thought the default mode network corresponds to self-referential or "internal mentation".2,3
It has been hypothesized that, in humans, activity within the default mode network is correlated with certain pathologies (for instance, hyper-activation has been linked to schizophrenia 4,5,6 and autism spectrum disorders 7 whilst hypo-activation of the network has been linked to Alzheimer's and other neurodegenerative diseases 8). As such, noninvasive modulation of this network may represent a potential therapeutic intervention for a number of neurological and psychiatric pathologies linked to abnormal network activation. One possible tool to effect this modulation is Transcranial Magnetic Stimulation: a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.9
In order to explore the default mode network's propensity towards and tolerance of modulation, we will be combining TMS (to the left inferior parietal lobe) with functional magnetic resonance imaging (fMRI). Through this article, we will examine the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools.

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the combination of TMS and fMRI to examine the effects of brain stimulation on the default network.

Combinando Estimulação Magnética Transcraniana e fMRI para o Exame da rede de modo padrão

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful ...

Neurociência

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinação da atividade locomotora espontânea em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Emparelhados Recordings células inteiras em organotï¿½icas fatias do hipocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments that largely determines the quality of results. It has been shown that omitting the cooling step during cutting procedure is beneficial in obtaining healthy slices and cells, especially when dealing with highly myelinated brain structures from mature animals. Even though the precise mechanism whereby elevated temperature supports neural health can only be speculated upon, it stands to reason that, whenever possible, the temperature in which the slicing is performed should be close to physiological conditions to prevent temperature related artifacts. Another important advantage of this method is the simplicity of the procedure and therefore the short preparation time. In the demonstrated method adult mice are used but the same procedure can be applied with younger mice as well as rats. Also, the following patch clamp experiment is performed on horizontal cerebellar slices, but the same procedure can also be used in other planes as well as other posterior areas of the brain.

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

Slice It Hot: Agudo Adulto Cérebro Cortando na temperatura fisiológica

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we describe a pERK immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. Specifically, we used pERK immunostaining to study neuronal activation following Morris water maze (MWM, a classical hippocampal-dependent learning task) in Engrailed-2 knockout (En2-/-) mice, a model of autism spectrum disorders (ASD). As compared to wild-type (WT) controls, En2-/- mice showed significant spatial learning deficits in the MWM. After MWM, significant differences in the number of pERK-positive neurons were detected in specific hippocampal subfields of En2-/- mice, as compared to WT animals. Thus, our protocol can robustly detect differences in pERK-positive neurons associated to hippocampal-dependent learning impairment in a mouse model of ASD. More generally, our protocol can be applied to investigate the profile of hippocampal neuron activation in both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

We describe an immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. This protocol can be applied to both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

A visualização imuno-histoquímica de Hippocampal Neuron Atividade Após Spatial Aprendizagem em um rato modelo de desordens do desenvolvimento neurológico

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In particular, endogenously-generated network activity, which strongly varies as a function of the state of vigilance, significantly modulates neuronal computation. To investigate how different spontaneous cerebral dynamics impact single neurons&#39; integrative properties, we developed a new experimental strategy in the rat consisting in suppressing in vivo all cerebral activity by means of a systemic injection of a high dose of sodium pentobarbital. Cortical activities, continuously monitored by combined electrocorticogram (ECoG) and intracellular recordings are progressively slowed down, leading to a steady isoelectric profile. This extreme brain state, putting the rat into a deep comatose, was carefully monitored by measuring the physiological constants of the animal throughout the experiments. Intracellular recordings allowed us to characterize and compare the integrative properties of the same neuron embedded into physiologically relevant cortical dynamics, such as those encountered in the sleep-wake cycle, and when the brain was fully silent.

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

This procedure performs long-lasting in vivo intracellular recordings from single neurons during physiologically relevant cerebral states and after complete abolition of ongoing electrical activities, resulting in an isoelectric brain state. The physiological constants of the animal are carefully monitored during the transition to the artificial comatose condition.

A indução de um Estado Isoeléctrico cérebro para investigar o impacto da endógena Synaptic Activity na excitabilidade neuronal<em&gt; In Vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Gravação de plasticidade sináptica em fatias Hippocampal agudas, mantidas em um pequeno volume reciclagem - perfusão- e sistema de câmara de submersão-tipo

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

Um modelo pré-clínico para avaliar a recuperação do cérebro após acidente vascular cerebral agudo em ratos

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for sudden death. Despite an abundance of available treatment options, about 30% of patients are drug-resistant. Several novel therapeutics have been developed using animal models, though the rate of drug-resistant patients remains unaltered. One of probable reasons is the lack of translation between rodent models and humans, such as a weak representation of human pharmacoresistance in animal models. Resected human brain tissue as a preclinical evaluation tool has the advantage to bridge this translational gap. Described here is a method for high quality preparation of human hippocampal brain slices and subsequent stable induction of epileptiform activity. The protocol describes the induction of burst activity during application of 8 mM KCl and 4-aminopyridin. This activity is sensitive to established AED lacosamide or novel antiepileptic candidates, such as dimethylethanolamine (DMEA). In addition, the method describes induction of seizure-like events in CA1 of human hippocampal brain slices by reduction of extracellular Mg2+ and application of bicuculline, a GABAA receptor blocker. The experimental set-up can be used to screen potential antiepileptic substances for their effects on epileptiform activity. Furthermore, mechanisms of action postulated for specific compounds can be validated using this approach in human tissue (e.g., using patch-clamp recordings). To conclude, investigation of vital human brain tissue ex vivo (here, resected hippocampus from patients suffering from temporal lobe epilepsy) will improve the current knowledge of physiological and pathological mechanisms in the human brain.

The presented protocol describes the transport and preparation of resected human hippocampal tissue with the ultimate goal to use vital brain slices as a preclinical evaluation tool for potential antiepileptic substances.

Preparação de fatias hipocampais humanas agudas para gravações eletrofisiológicas

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Fatias hipocampais horizontais do cérebro do rato

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Methods Article

Corte cerebral aguda do rato para investigar atividade espontânea da rede hipocampal