O protocolo aqui apresentado diminui danos hipóxicos excessivos durante a preparação de fatias hipocampais de camundongos adultos e envelhecidos, removendo assim um grande obstáculo para estudar a função de circuitos neurais maduros e envelhecidos. A introdução de hipotermia em soluções livres de sódio resulta em fatias hipocampais saudáveis por até 10 horas após o corte e apropriadas tanto para os estudos de registro de campo de longo prazo quanto para patch-clamp. Este método de preparação de fatias hipocampais pode ser particularmente relevante para modelos animais em doenças neurodegenerativas que, por definição, requerem uma preparação cerebral envelhecida.
O passo mais crítico neste protocolo é introduzir hipotermia via profusão transcárquia com uma solução gelada. Com alguma prática, os pesquisadores poderão executar essa etapa de forma confiável. Comece preparando um litro de solução aCSF para a câmara de recuperação e gravações subsequentes.
Em seguida, prepare 300 mililitros de NMDG-aCSF para a profusão transcárvia e etapas de corte. Coloque a bandeja de corte de microtóme vibrante e o disco de montagem em um congelador de menos 20 graus Celsius. Para preparar a câmara de recuperação, preencha-a um pouco acima da malha de segurando a fatia e inicie o borbulhante mantendo a câmara no banco em temperatura ambiente.
Esfrie os 300 mililitros inteiros de NMDG-aCSF em um congelador até que os cristais de gelo comecem a se formar na superfície e nas paredes da garrafa. Coloque a garrafa com refrigerado e NMDG-aCSF no gelo e borbulhe-a, mantendo a solução entre zero e dois graus Celsius. Tire o disco de montagem do tecido do congelador e limpe-o, se necessário.
Corte um bloco de 5% de ágar do tamanho de um cérebro de rato e cole-o no centro do disco usando uma fina camada de cola cianoacrilato. Coloque o disco com ágar colado no gelo e cubra-o com toalhas de papel até estar pronto para usar. Tire a bandeja de corte do congelador, coloque-a no microtome, em seguida, cerque-a com gelo e carregue a lâmina.
Prepare todas as ferramentas com antecedência para a dissecção cerebral. Configure a bomba peristáltica para perfusão transcárlica. Insira um lado da tubulação da bomba na garrafa com NMDG-aCSF gelado e encaixe o outro lado com uma agulha calibre 27.
Coloque a velocidade da bomba em aproximadamente 3,5 mililitros por minuto. A esta velocidade, o fluxo de saída de um NMDG-aCSF é uma viagem rápida, não um fluxo contínuo. Coloque o mouse de costas em uma fralda.
Antes de continuar, confirmou que o rato está em um plano cirúrgico de anestesia realizando uma pitada de dedo do pé. O rato deve não responder, depois colado pelas pernas dianteiras e traseiras para que o peito e o abdômen sejam expostos. Corte um grande pedaço da pele no peito, indo de baixo do esterno até a garganta.
Pegue o esterno com fórceps, levante-o suavemente e comece a cortar a caixa torácica em ambos os lados até que a cavidade torácica seja exposta. Corte através do diafragma, deixando o retalho da caixa torácica preso através de um fino pedaço de músculo. Deve ser possível colocá-lo de lado sem tê-lo cair de volta na cavidade torácica exposta.
Verifique se o coração ainda está batendo e certifique-se de que a maior parte do fígado é visível. Insira a agulha no ventrículo esquerdo, que parece mais leve em cores do que a direita. Para estabilizar a agulha, dirija-a através das costelas restantes do lado esquerdo do corpo.
Localize o átrio direito de cor vermelha escura e corte-o com uma tesoura pequena. O sangue deve começar a fluir. Inicie a bomba e observe o fígado, que mudará de cor de vermelho para marrom.
Monitore a cor do fígado e continue a perfusão até que o fígado fique castanho pálido. Execute a bomba por mais alguns minutos. A temperatura corporal do animal deve cair para 28 a 29 graus Celsius e seu nariz deve ser frio ao toque.
Decapitar o rato com uma grande tesoura de decapitação, em seguida, use um bisturi com uma lâmina número 10 para cortar a pele em cima do crânio. Com uma tesoura pequena em ângulo, corte o crânio na linha média. Em seguida, use os fórceps número três para arrancar as metades direita e esquerda do crânio, tomando cuidado para levar a dura com ele.
Remova o cérebro, que deve ser uma cor off-white, retirando-o com uma espátula e solte-o na solução NMDG-aCSF no gelo. Deixe lá por até um minuto. Tire o cérebro do NMDG-aCSF e coloque-o em um pedaço de papel filtro.
Corte e remova uma cunha de tecido de 60 graus com uma ferramenta de 60 graus centrada na linha média da extremidade rostral do cérebro. Use os lados cortados da superfície de montagem, pois fornece o ângulo adequado para fatias hipocampais. Separe os hemisférios pela linha média com o bisturi e cole-os no disco de montagem.
Pegue o disco de montagem do gelo e limpe-o, se necessário. Em seguida, cole cada hemisfério em frente ao bloco de ágar, corte de lado para baixo. Certifique-se de que os lados ventral de ambos os hemisférios estão tocando o bloco de ágar e que os lados dorsais de ambos os hemisférios estão voltados para a lâmina.
Quando colados no lado do corte, cada hemisfério deve ser orientado em relação à lâmina de uma forma que garanta fatias transversais do hipocampo dorsal in situ. Submergir o disco com os hemisférios em uma câmara de corte contendo NMDG-aCSF caricaturado a frio do gelo. Corte uma seção de 400 micrômetros e use uma pipeta de transferência descartável com uma ponta de corte para transferir a fatia para uma câmara de recuperação contendo NMDG-aCSF carbogenado à temperatura ambiente.
Continue cortando o resto das seções e transferindo-as para a câmara de recuperação levando não mais do que 10 minutos para cortar um total de oito a 10 fatias da região do hipocampo dorsal. Incubar as fatias em temperatura ambiente por aproximadamente duas horas antes de gravar. Este protocolo foi usado para gerar fatias hipocampais de ratos adultos.
Um grande número de células piramidas no campo CA1 e no subiculum aparecem em baixo contraste, uma marca registrada de células saudáveis, quando observadas sob microscopia de contraste diferencial infravermelho. Gravações de grampos de patch podem ser obtidas a partir de neurônios CA1 de camundongos com mais de seis meses de idade. No experimento de exemplo aqui, a frequência de correntes pós-sinápticas excitatórias em miniatura foi medida após a induzida pelo NMDA-LTD em relação às condições de controle.
A frequência das correntes pós-sinápticas excitatórias em miniatura foi menor nos neurônios após uma indução do NMDA-LTD, indicando poda dependente de atividade de sinopses em CA1. Não foram detectadas alterações na amplitude. Durante as gravações do MEPSC, as células CA1 também foram preenchidas biocitina e arbor déndrítica intacta e habitus de células saudáveis dos neurônios piramihários podem ser vistos aqui.
Uma distribuição robusta do corante fluorescente em toda a célula permite a análise de dendritos e colunas dendríticas em diferentes condições. Observou-se a potencialização de longo prazo, ou LTP, de sinapses CA3-CA1 de aproximadamente 170%, sugerindo que a manutenção das cascatas de sinalização necessárias para o LTP está presente em fatias preparadas a partir de camundongos adultos. Um robusto sinal potencial de campo excitatório de forma exsináptica sugere que a conectividade de rede também foi preservada.
Dois aspectos críticos do protocolo são a profusão transcárdica com uma solução gelada para induzir hipotermia e introdução de um NMDG como um substituto de íon de sódio em soluções para prevenir edema citotóxico. Usando essas precauções, fatias agudas podem ser preparadas de qualquer região cerebral. Além disso, as fatias preparadas desta forma podem ser usadas para imagens de cálcio e tensão usando microscopia de dois fótons ou widefield.
Este protocolo poderia servir de base para uma preparação padronizada para fatias hipocampais agudas de animais envelhecidos e, assim, facilitar comparações entre estudos no contexto de mecanismos de doenças neurodegenerativas.
