Este trabalho foi apoiado por um Grant-in-Aid para a Investigação Científica em áreas inovadoras &quot;Mesoscópica neurocircuitry&quot; (n º 22115002) e &quot;Comprehensive Rede Ciência Cérebro&quot; (No. 221S0003), do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência, e Tecnologia, Japão para AN e Grant-in-Aid para Jovens Cientistas (B) (N º 21700344) do Japão Sociedade para a Promoção da Ciência (JSPS) para HK

1. Preparação larvas <ol><li> Manter a voar linhas de OK6-Gal4, UAS-ChR2 ou OK6-Gal4, UAS-NpHR2 em frascos plásticos contendo alimentos fly padrão. </li><li> Espalhe levedura colar contendo all-trans retinal (ATR) em concentrações adequadas (1 mM para ChR2, 10 mM para NpHR2 (&quot;PNDH&quot; para o short) em uma placa de ágar suco de maçã. </li><li> Pegue 2 º ou 3 º instar as larvas dos frascos e colocá-los na placa ATR-contendo. </li><li> Criá-los a 25 ° C no escuro durante um período de tempo apropriado (1 dia para CHR2, 2 dias para PNDH.) </li></ol> 2. Setup microscópio <ol><li> Anexar uma câmera CCD (XCD-V60, Sony) a um microscópio confocal convencional (no nosso caso, FV1000, Olympus) com um anexo C-mount (ampliação 0,35 x). </li><li> Se houver um obturador ao longo do caminho da luz da lente objectiva para a câmara CCD, que fecha durante a laser scanning, remover cuidadosamente. Como este passo depende do microslidar configuração, contate o fabricante do microscópio para o suporte técnico, se necessário. </li></ol> 3. Dissecação <ol><li> Lavar as larvas ATR-alimentados com água para remover o alimento residual a partir do corpo. </li><li> Coloque a larva em um prato Sylgard revestido, com o lado dorsal para cima (o lado dorsal tem dois tubos traqueais rodando longitudinalmente, um de cada lado da linha média dorsal). A espessura da Sylgard é de cerca de 5 mm. </li><li> Insira um pino de inseto (Austerlitz pinos de insetos, Φ0.10mm, inoxidável) na cauda entre os tubos traqueais com uma pinça (# 5 Inox, FST por Dumont, Suíça). Os pinos, cerca de 10 mm de comprimento, deve ser dobrada ou cortada para ser suficientemente curto (~ 2 milímetros de comprimento) para evitar bater e danificar a superfície da lente objetiva. Em seguida, coloque o segundo pino de inseto na cabeça da larva perto do gancho boca, preto estrutura garra-como no final anterior. </li><li> Adicionar Ca2 + livre salina normal (NaCl 140 mM, KCl 2 mM, MgCl 2 6 mM, HEPES-NaOH a 5 mM,Sacarose 36 mM (pH 7,1)) para manter a larva úmida. </li><li> Adicione uma pequena incisão próximo da cauda com micro-tesouras (MB-50-7 Napox, Japão). </li><li> A partir da incisão, faça um corte longitudinal ao longo da linha média dorsal em direção à cabeça. Tenha cuidado para não danificar o cordão nervoso ventral (VNC) e axônios. </li><li> Fazer uma pequena incisão na cabeça lateralmente. </li><li> Coloque 4 pinos em cada canto do bodywall dissecados. A parede do corpo deve ser esticado o suficiente para visualizar um padrão segmentar da parede do corpo, mas não muito para dificultar o movimento peristáltico. </li><li> Remover os órgãos internos, excepto para o cérebro e o VNC e enxaguar a amostra com a solução salina normal de Ca2 + livre. </li><li> Ajustar a orientação do cordão nervoso ventral ser bilateralmente simétrico, alterando a posição e orientação dos pinos de insectos na parede do corpo. Para fixar a posição do cordão nervoso ventral, inserir um pino através do tecido entre o cérebro e a boca para baixo para ligar o Sylgard. </li> &lt;li&gt; Substitua o tampão com 2 mM Ca 2 + solução de Ringer (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, MgCl2 2 mM, CaCl2 2 mM, HEPES-NaOH 5 mM, sacarose 36 mM (pH 7,3)). </li></ol> 4. Imagem com iluminação a laser <ol><li> Anexar uma lente objetiva seca 4x (UPlanSApo 4x, NA 0,16, Olympus, Japão) no microscópio confocal e definir a preparação larva no palco. </li><li> Obter uma imagem de transmissão da preparação dissecados com um laser vermelho (633 nm) para localizar o cordão nervoso ventral por microscópio confocal. Para esta verificação, não se esqueça de usar um laser de 488nm ou 559nm, que induz a estimulação indesejada de ChR2 ou PNDH, respectivamente. </li><li> Definir a região de interesse (ROI) da imagem de transmissão no. Modo zumbidas poderia ser útil para a determinação pormenorizada da ROI. </li><li> Alterar o conjunto de filtro do microscópio para iluminar com a luz 488nm ou 559nm. </li><li> Iluminar a preparação com uma lâmpada de halogénio de visualizar a parede do corpo. The a preparação pode ser monitorada com uma câmara CCD ligada a um microscópio confocal. </li><li> Registe o movimento da parede do corpo e ligar o feixe de laser ligado e desligado durante a monitorização do movimento. </li></ol>

<ol>
	<li>Cattaert, D., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+the+central+generator+of+locomotor+rhythm+by+noncompetitive+NMDA+receptor+antagonists+in+Drosophila+larvae.">Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila larvae.</a> J. Neurobiol. 48, 58-73 (2001).</li><li>Fox, L. E., Soll, D. R., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+and+modulation+of+locomotion+pattern+generators+in+Drosophila+larvae:+effects+of+altered+biogenic+amine+levels+by+the+tyramine+beta+hydroxlyase+mutation.">Coordination and modulation of locomotion pattern generators in Drosophila larvae: effects of altered biogenic amine levels by the tyramine beta hydroxlyase mutation.</a> J. Neurosci. 26, 1486-1498 (2006).</li><li>Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+TRP+channel+NompC+in+Drosophila+larval+and+adult+locomotion.">The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion.</a> Neuron. 67, 373-380 (2010).</li><li>Gomez-Marin, A., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+sensation+during+orientation+behavior+in+the+Drosophila+larva:+more+sense+than.">Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than.</a> Curr. Opin. Neurobiol. , (2011).</li><li>Gershow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+airborne+cues+to+study+small+animal+navigation.">Controlling airborne cues to study small animal navigation.</a> Nat. Methods. , (2012).</li><li>Suster, M. L., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+assembly+of+a+central+pattern+generator+without+sensory+input.">Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input.</a> Nature. 416, 174-178 (2002).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71, 9-34 (2011).</li><li>Miesenbock, G., Kevrekidis, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+and+control+of+genetically+designated+neurons+in+functioning+circuits.">Optical imaging and control of genetically designated neurons in functioning circuits.</a> Annu. Rev. Neurosci. 28, 533-563 (2005).</li><li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae.">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li><li>Hwang, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps.">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li><li>Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+of+neuronal+activation+by+Channelrhodopsin-2+and+TRPA1+determine+behavioral+output+in+Drosophila+larvae.">Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae.</a> J. Neurophysiol. 101, 3075-3088 (2009).</li><li>Pulver, S. R., Hornstein, N. J., Land, B. L., Johnson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+the+teaching+laboratory:+using+channelrhodopsin-2+to+study+the+neural+basis+of+behavior+and+synaptic+physiology+in+Drosophila.">Optogenetics in the teaching laboratory: using channelrhodopsin-2 to study the neural basis of behavior and synaptic physiology in Drosophila.</a> Adv. Physiol. Educ. 35, 82-91 (2011).</li><li>Inada, K., Kohsaka, H., Takasu, E., Matsunaga, T., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+dissection+of+neural+circuits+responsible+for+Drosophila+larval+locomotion+with+halorhodopsin.">Optical dissection of neural circuits responsible for Drosophila larval locomotion with halorhodopsin.</a> PLoS One. 6, e29019 (2011).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly.">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72, 202-230 (2011).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (1073).</li><li>Hildebrand, E., Dencher, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+photosystems+controlling+behavioural+responses+of+Halobacterium+halobium.">Two photosystems controlling behavioural responses of Halobacterium halobium.</a> Nature. 257, 46-48 (1975).</li><li>Takahashi, T., Mochizuki, Y., Kamo, N., Kobatake, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+long-lifetime+photointermediate+of+s-rhodopsin+is+a+receptor+for+negative+phototaxis+in+Halobacterium+halobium.">Evidence that the long-lifetime photointermediate of s-rhodopsin is a receptor for negative phototaxis in Halobacterium halobium.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 127, 99-105 (1985).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446, 633-639 (2007).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J. Vis. Exp. (24), e1107 (2009).</li><li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+application+of+optogenetics.">The development and application of optogenetics.</a> Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Perturbação temporal e local da atividade neural é uma técnica valiosa para analisar a dinâmica da rede de circuitos neurais. Neste protocolo, apresentamos um método para manipular a atividade neural por optogenetics usando um laser. Alta direcionalidade do laser permite estimulação optogenetic mais localizada do que a estimulação campo largo uso de mercúrio ou uma lâmpada Xenon. Embora iluminações de laser já foram aplicados para Optogenetics em estudos anteriores, configurações especiais, tais como a fibra de vidro, micromanipulador, e uma fonte de laser, são necessários na maioria dos estudos anteriores. Neste protocolo, usamos um microscópio confocal convencional para a iluminação local. Uma vez que o sistema de microscópio confocal é amplamente utilizada, este método vai abrir a possibilidade de aplicar Optogenetics de alta resolução em muitos laboratórios. O protocolo tem dois pontos críticos: dissecção larval e potência do laser. Em primeiro lugar, se o cérebro, o cordão nervoso ventral ou um nervo motor é danificado during dissecção, as larvas apresentam menos ou nenhum movimento peristáltico espontânea. A precisão é, portanto, essencial, especialmente quando se fazer uma incisão no lado dorsal, com uma tesoura de mola e remoção de órgãos internos com uma pinça. Detalhes sobre a dissecação foram relatados anteriormente 21. Em segundo lugar, se a estimulação é suficiente para atingir, a potência do laser de cerca de 0,1 ~ 1 mW / mm 2 para ChR2 ou 1 ~ 10 mW / mm 2 para PNDH é necessária. Avaliou-se a potência do laser, como total de energia de luz abaixo de uma lente objectiva dividida por uma área estimada de iluminação. Medimos a potência total da luz usando um medidor de energia (mobiken, Sanwa MI Technos, Japão). Estimou-se a área de iluminação como constante vezes circular o quadrado do comprimento de onda do laser, o que dá mais ou menos área iluminada no limite de difração. Poder iluminação eficaz na amostra pode ser ajustada não só pela potência da saída do laser, mas também pela alteração da velocidade de digitalização e dormenteser de repetições. Nós digitalizados laser com 20-100 ms / pixel para 63 vezes. Além disso, o nível de proteína Optogenetics e a quantidade de ATR expressão também são críticos para a eficiência da estimulação. Assim, se as larvas não mostrou nenhuma resposta optogenetic, os seguintes pontos devem ser verificados e corrigidos: 1) potência do laser (por meio da otimização do sistema de microscópio), 2) nível de expressão da proteína optogenetics (marcando genótipo e temperatura criação), e 3) a quantidade de ATR (ajustando a concentração de ATR e período de alimentação). PNDH exige maior concentração de ATR que ChR2 faz por razões desconhecidas 13. ChR2 funciona bem em larvas criadas em alimentos contendo ATR menor (por exemplo, 0,1 mM) do que o descrito aqui (a 1 mM). Como a alimentação das larvas de 1 mM ATR é suficiente para fazer ChR2 foto-reativo, recomendamos esta concentração para o primeiro julgamento em ChR2 experimentos. A concentração de ATR pode subsequentemente ser titulada para baixo a partir de 1 mM. Quanto à duração da exposição por ATR, recomendamosa duração descrita aqui para robusto controle optogenetic. Nós muitas vezes não respeitou resposta optogenetic quando se alimentam de larvas de ATR por menor duração. Neste protocolo, iluminação a laser e de aquisição de imagem são operados por um computador separado. Assim, a detecção clara do padrão espaço-temporal da iluminação laser, câmera CCD é fundamental para a análise de dados. Se o ponto de laser ou a linha é fraca imagem CCD, você deve otimizar o poder de lâmpada halógena e valor de ganho da câmera CCD para visualizar a iluminação a laser, mantendo parede do corpo visível. Iluminação espacial e temporal mostrada neste protocolo fornece informações sobre circuitos motores larvais, no entanto, o método tem algumas limitações. Quanto ao aspecto &quot;espacial&quot;, a localização da iluminação é registrado baixa de imagem CCD de ampliação usada para filmar os movimentos da parede do corpo por. Assim, a área de iluminação pode ser atribuído ao nível do segmento, mas não em nível celular. Como para o &quot;temporal &quot;aspecto, intervalo de tempo entre a ligação na analise por microscopia confocal a laser e de iluminação pelo laser depende do sistema de microscópio confocal e condição de digitalização. Consequentemente, alguns ensaios por tentativa e erro, é necessário para ajustar o tempo de iluminação. Desde que a temporização de iluminação pode ser determinado em filmes de imagem CCD, utilizando software adequado como ImageJ, o fator crítico na resolução temporal é a taxa de quadros de câmera CCD de imagem. Nós normalmente definir a taxa de quadros para 7,5-15 quadros por segundo. Avanços em ferramentas optogenetic nos proporcionar uma oportunidade para modificar esse protocolo. Usamos 3 ª larvas possuindo OK6-Gal4 e UAS-ChR2 [H134R] ou UAS-NpHR2. Outras ferramentas optogenetic em vez de ChR2 [H134R] ou NpHR2 como ChR2 [T159C/E123T], NpHR3 ou Arch pode aumentar a eficiência do controle da atividade 22. Além disso, utilizando outros gal4 linhas ou análise em outros estágios de desenvolvimento pode fornecer mais informações sobre o circui do motorts. Neste protocolo, actividade motora foi monitorizada por meio de imagens de transmissão da contracção bodywall com uma câmara CCD. A atividade dos neurônios motores com moléculas de fluorescência de cálcio sensíveis (por exemplo, GCaMP) também pode ser diretamente monitoradas ao manipular a atividade neural com ChR2 ou PNDH. Neste caso, a iluminação a luz azul em uma área ampla e uma câmara CCD altamente sensíveis (por exemplo, câmara EMCCD) são usados ​​em vez de uma lâmpada de halogénio e a câmara CCD normal, aqui descrito anteriormente. Para melhorar a resolução espacial de estimulação durante o monitoramento movimento bodywall, usando uma lente objetiva adicional pode ser um método mais avançado: iluminação do cordão nervoso ventral por uma lente objetiva de grande aumento (por exemplo, 40x) por cima da amostra e monitoramento bodywall por baixo da lente de ampliação (por exemplo, 4x) abaixo da amostra. Este sistema de lente dupla pode permitir-nos para estimular o sistema nervoso em maior resolução espacial. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; O protocolo mostrado aqui pode ser aplicado a outros circuitos neurais, ferramentas optogenetic proporcionados podem ser expressos no sistema nervoso e preparação em que a luz suficiente podem ser entregues no tecido neural pode ser estabelecida.

Locomoção para a frente peristáltica em larvas de Drosophila ocorre pela propagação da contração muscular do posterior aos segmentos anteriores. Este movimento é realizado pela ativação seqüencial dos neurônios motores dentro do cordão nervoso ventral ao longo do eixo longitudinal do corpo. Para examinar o circuito por trás dessa atividade de propagação modelada, perturbação locais da atividade neural poderia ser uma abordagem informativa. Embora o ensaio farmacológico pode controlar substância específica, tais como neurotransmissores, no tecido neural, os efeitos farmacológicos das drogas podem ser semelhantes entre quase todos os segmentos porque o cordão nervoso ventral larval é a estrutura repetitiva composto neuromeres semelhantes ao longo do eixo longitudinal. Alternativamente, pode-se expressar optogenetic ou moléculas de sonda, sensíveis à temperatura, em um pequeno número de segmentos. No entanto, essas linhas Gal4 específicas são muito difíceis de produzir. Aqui é apresentado um método para manipulação de neurónios em alguns segmentos que utilizam iluminação a laser. Aproveitando-se da iluminação espacialmente confinado em microscopia confocal, pode perturbar a atividade dos neurônios em uma área local. Combinado com o padrão de expressão da sonda por subconjuntos de gal4 linhas específicas de neurônios, este método de iluminação a laser melhora muito a resolução espacial para a perturbação. E porque este método requer apenas um microscópio confocal convencional, a compra de equipamentos de laboratório adicional normalmente não é necessário. Utilizando esta técnica, que examinaram o papel da actividade neuronal motora durante a propagação de saída do motor 13. Ao bloquear as actividades dos neurónios motores em poucos segmentos durante o movimento peristáltico, fomos capazes de testar se a actividade dos próprios neurónios motores é necessária para a propagação do sinal de saída do motor. Bloqueio local e transitória dos neurônios motores detido a propagação do movimento peristáltico. Após o bloqueio foi removida, própagation apareceu no segmento em que a onda tinha sido preso. Este fenômeno sugere que sem a ativação neuronal motora, a onda propagativo não pode progredir ao longo do cordão nervoso ventral mais longe, e, portanto, é necessário para o movimento peristáltico a ativação de neurônios motores. Nós relatamos anteriormente dados detalhados e discussões sobre este fenômeno em Inada et al. (2011) 13. Aqui, nós descrevemos o método para perturbar a actividade neural interactivamente durante a monitorização do movimento das larvas dissecados. Usando vários gal4 linhas e uma série de padrões espaço-temporais para a manipulação atividade, pode-se investigar a lógica de circuitos através das propriedades do circuito do motor de resposta de perturbação.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td >Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BX61WI Microscope</td>
 <td>Olympus Corporation</td>
 <td>BX61WI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluoview FV1000 confocal system</td>
 <td>Olympus Corporation</td>
 <td>FV1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CCD camera</td>
 <td>Sony</td>
 <td>XCD-V60</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>all-trans retinal</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>R2500-500MG</td>
 <td>200 mM stock in 95% EtOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silpot184</td>
 <td>Dow Corning Toray</td>
 <td>3255981</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

optogenetic perturbation of neural activity with laser illumination in semi-intact drosophila larvae in motion

Drosophila larval locomoção é um sistema modelo excelente no desenvolvimento fisiológico e neuroscience, em virtude da acessibilidade genética dos componentes neuronais subjacentes existentes nos circuitos 1-6. Aplicação de optogenetics 7,8 no circuito neural larval nos permite manipular a atividade neuronal de uma forma espacialmente e temporalmente estampados 9-13. Tipicamente, as amostras são largamente iluminada com uma lâmpada de mercúrio ou de LED, de modo a especificidade dos neurónios-alvo é controlado por sistemas de expressão de genes binários como o sistema Gal4 UAS-14,15. Neste trabalho, para melhorar a resolução espacial de &quot;resolução sub-genético&quot;, que localmente iluminado um subconjunto de neurónios no cordão nervoso ventral utilizando lasers implementadas em um microscópio confocal convencional. Ao monitorizar o movimento da parede do corpo do semi-larva intactos, nós interactivamente activado ou inibido actividade neural com o 16,17 channelrodopsinar halorodopsina 18-20, respectivamente. Por espacialmente e temporalmente restrita iluminação do tecido neural, pode-se manipular a actividade dos neurónios específicos no circuito a uma fase específica do comportamento. Este método é útil para estudar a relação entre as actividades de um conjunto neural local no cordão nervoso ventral e o padrão de espaço-temporal de saída do motor.

<html> Ativação local e transitória dos neurônios motores com ChR2. Expressamos ChR2 em neurônios motores. Os axônios dos neurônios motores saem de cada projeto segmento VNC a um segmento correspondente da parede do corpo. Quando estimulado um ou dois segmentos do VNC com um laser azul, músculos, nos segmentos correspondentes exibiu contracções (Figura 1). Inibição local e transitória dos neurônios motores com PNDH. Expressamos PNDH nos neurônios motores. Quando estimulado algumas (1 ~ 2) segmentos do VNC com um laser vermelho, durante as contracções musculares peristálticas, a onda de propagação foi preso aos correspondentes segmentos de parede do corpo (Figura 2). Em seguida, a onda reiniciado a partir dos segmentos presos quando desligada a iluminação a laser 13. 50513fig1.jpg &quot;alt =&quot; Figura 1 &quot;fo: content-width =&quot; 5.5in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50513/50513fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Ativação local dos neurônios motores com ChR2. A. Esquema da ativação local de preparação de filetes. Pela iluminação azul-luz de algumas segmentos do cordão nervoso ventral expressando ChR2 em neurônios motores, os músculos dos segmentos correspondentes são contratados (cabeça de seta). B. imagens transmissão de um larva dissecados. Iluminação local do cordão nervoso ventral (seta cabeças) induz contração segmentar dos músculos da parede do corpo (setas). <img src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2highres.jpg"/> Figura 2. Inibição local dos neurônios motores com PNDH. A. Esquema da inibição local de preparação em filetes. Pelo amarelo-liluminação ight de alguns segmentos do cordão nervoso ventral expressando PNDH em neurônios motores, os músculos de contração durante espontaneamente, ocorreu movimento peristáltico (cabeça de seta na parte superior) estão relaxados (cabeça de seta na parte inferior). B. imagens transmissão de uma larva dissecado . Iluminação local do cordão nervoso ventral (cabeças de seta) relaxou os segmentos da parede do corpo espontaneamente-contratadas (setas).

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion at JoVE.com

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Aqui nós descrevemos um protocolo para manipulação optogenetic de atividade motoneurônio enquanto monitora mudanças na saída do motor (contração muscular) em semi-intactas<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas usando laser dentro de um microscópio confocal convencional. Esta técnica permite aos investigadores perturbação atingir locais de actividade neural em poucos neuromeres para elucidar a dinâmica do circuito do motor.

Optogenetic Perturbação da atividade neural com Iluminação Laser no Semi-intacta<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

optogenetic-perturbation-neural-activity-with-laser-illumination-semi

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

11.5K visualizações.  The University of Tokyo. Aqui nós descrevemos um protocolo para manipulação optogenetic de atividade motoneurônio enquanto monitora mudanças na saída do motor (contração muscular) em semi-intactas Drosophila Larvas usando laser dentro de um microscópio confocal convencional. Esta técnica permite aos investigadores perturbação atingir locais de actividade neural em poucos neuromeres para elucidar a dinâmica do circuito do motor.

Vídeo: Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

In vivo Laser axotomia em C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Neurociência

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

Métodos locais e globais de Avaliação nocicepção térmica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualização de Propriocepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas e pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Aprendizagem associativa apetitiva olfativa em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unidade Métodos de gravação para caracterizar a atividade neural no Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuitos olfatórias

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenética estimulação do comportamento de fuga em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in the hippocampus. The transverse hippocampal slice preparation is the most common tissue preparation to study hippocampus electrophysiology. A longitudinal hippocampal slice was also developed in order to investigate longitudinal connections in the hippocampus. The intact mouse hippocampus can also be maintained in vitro because its thickness allows adequate oxygen diffusion. However, these three preparations do not provide direct access to neural propagation since some of the tissue is either missing or folded. The unfolded intact hippocampus provides both transverse and longitudinal connections in a flat configuration for direct access to the tissue to analyze the full extent of signal propagation in the hippocampus in vitro. In order to effectively monitor the neural activity from the cell layer, a custom made penetrating micro-electrode array (PMEA) was fabricated and applied to the unfolded hippocampus. The PMEA with 64 electrodes of 200 &#181;m in height could record neural activity deep inside the mouse hippocampus. The unique combination of an unfolded hippocampal preparation and the PMEA provides a new in-vitro tool to study the speed and direction of propagation of neural activity in the two-dimensional CA1-CA3 regions of the hippocampus with a high signal to noise ratio.

We have developed an in vitro unfolded hippocampus which preserves CA1-CA3 array of neurons. Combined with the penetrating micro-electrode array, neural activity can be monitored in both the longitudinal and transverse orientations. This method provides advantages over hippocampal slice preparations as the propagation in the entire hippocampus can be recorded simultaneously.

Neural Activity Propagação em uma Unfolded Hippocampal Preparação com um penetrante Micro-eletrodo Matriz

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Extracelular Gravação de Neuronal Atividade Combinado com Microiontophoretic aplicação de substâncias neuroativos em Ratos Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Romance Ensaio para Fria nocicepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.