Usando o ensaio de ponto de luz, o comportamento das larvas pode ser rastreado antes, durante e depois de entrar na área de luz permitindo que os detalhes do movimento larval sejam analisados. Este ensaio é simples e fácil de executar. A resposta à luz é testada apenas uma vez, de modo que qualquer possível efeito da adaptação da luz pode ser excluído.
Para preparar as placas de ágar, cubra lentamente e uniformemente o fundo de uma placa de Petri de 15 centímetros com uma camada de aproximadamente quatro milímetros de espessura de ágar quente de 1%. Deixe a placa esfriar à temperatura ambiente até que o ágar se solidifique. Para configurar o sistema de estimulação visual, corte uma fonte de luz LED preparada em uma estrutura de ferro, tomando cuidado para que a luz se projeta em direção à área de trabalho.
Incline o cilindro ligeiramente até que o ângulo entre o cilindro e o plano vertical esteja em torno de 10 graus. Conecte a luz LED azul de 470 nanômetros ao led um plugue do driver LED de alta potência e ligue o motorista. Gire o botão no canto superior direito do driver para selecionar o canal 470 nanômetros e clique em LED.
Quando a tela exibir uma verificação, um ponto de luz azul aparecerá na área de trabalho. Clique em OK e gire o botão para ajustar a intensidade da luz. Mova a posição da fonte de luz para cima e para baixo para ajustar o diâmetro do ponto de luz para dois centímetros.
Gire o botão para selecionar a intensidade da luz de acordo com os requisitos experimentais. Use um console de medidor de potência compacto com um sensor de alimentação de diodo fotográfico padrão para medir a potência máxima e mínima de luz no local. O poder de luz precisa ser medido no escuro no experimento real.
Em seguida, registo a energia da luz, meça-a três vezes e use o valor médio. Para configurar o sistema de imaginação, aperte uma câmera web de alta resolução com um clipe de ferro cerca de 10 centímetros acima do ponto de luz na área de trabalho e ajuste a orientação da lente da câmera em direção à área de trabalho. Conecte a câmera a um computador executando o Windows 7 através de uma interface USB e coloque a placa de ágar na área de trabalho logo abaixo da câmera.
Abra o software AMCap 9.22, o ponto de luz será mostrado automaticamente na janela AMCap. Mova a câmera ligeiramente para a esquerda ou para a direita para garantir que o ponto de luz esteja perto do centro da janela. Use um clipe para corrigir um filtro de bandpass de 850 mais ou menos três nanômetros a cinco a sete milímetros imediatamente abaixo da câmera.
Coloque três LEDs geradores de luz infravermelha com um comprimento de onda central de 850 nanômetros uniformemente ao redor da placa de ágar a cerca de cinco centímetros de distância da borda da placa e com lentes LED em um ângulo de 70 graus voltado para a placa. Em seguida, conecte os LEDs a uma fonte de energia através de seus conversores AC a DC. No menu do software AMCap, selecione opções, dispositivo de vídeo e formato de captura e defina o tamanho do pixel do vídeo capturado para 800 por 600 e a taxa de quadros para 60 quadros por segundo.
Remova o filtro e coloque uma régua sob a câmera. Ajuste o foco da câmera até que a linha de escala esteja clara e paralela à largura do campo de exibição de vídeo e clique na captura, configuração e captura de vídeo para selecionar o caminho de salvar. Em seguida, clique em iniciar a gravação para gravar a distância real correspondente a 600 pixels e calcular a razão de cada pixel para a distância real.
Antes de introduzir a larva na configuração de imagem, adquira um pequeno vídeo da posição de luz e nomeie a área de luz de vídeo de fundo de controle não filtrada. Coloque o filtro de volta na lente da câmera e acenda uma luz longe do dispositivo experimental o mais baixo possível, enquanto ainda permite que as larvas sejam claramente observadas. Use uma colher para remover algumas larvas do meio de cultura e selecione delicadamente uma terceira larva instar.
Lave a larva em água destilada e coloque a larva no centro da placa de ágar. Remova suavemente qualquer excesso de água da larva e desligue a luz do quarto. Deixe a larva se aclimatar por dois minutos no ambiente escuro antes de ligar a luz LED infravermelha.
O seguinte experimento de comportamento de prevenção de luz precisa ser realizado no escuro. Para a conveniência da demonstração filmamos com a luz brilhante. Escove suavemente a larva para o centro da placa.
Quando a larva começar a rastejar em linha reta, gire a placa para fazer a larva ir em direção ao ponto de luz. Clique em capturar, configurar e capturar vídeo para selecionar o caminho salvar e clicar em iniciar a gravação para gravar. Deixe a larva rastejar em direção, entrar e deixar o ponto de luz até que esteja quase fora do campo de visão e clique em parar de gravar.
Mova o filtro para longe da câmera e adquira um pequeno vídeo da posição do ponto de luz. Em seguida, nomeie a área de luz de vídeo não filtrada de postagem dois e compare este vídeo com a área de luz um vídeo para garantir que a posição do ponto de luz não seja alterada. Aqui, podem ser observadas curvas de tempo da velocidade da cauda, ângulo de dobra corporal e velocidade angular de dobra corporal de uma larva representativa.
O tamanho da cabeça larval lançada e, portanto, o ângulo máximo de dobra corporal é significativamente reduzido em terceira larva instar com neurônios octoaminérgicos inibidos pela expressão tóxica do tétano em comparação com os controles parentais indicando que os neurônios Tdc2-Gal4 são necessários para uma resposta normal de luz larval. Para um processamento de imagem bem-sucedido, certifique-se de que a câmera não bloqueie a luz e que o ponto de luz esteja redondo e perto do centro da janela. Após este procedimento, a optogenética pode ser realizada para observar como as larvas reagem quando neurônios específicos são ativados.
Por meio desse ensaio, os detalhes do movimento larval podem ser analisados permitindo que o impacto distante do meio ambiente e dos fatores internos sobre o comportamento de prevenção da luz larval seja estudado.
