Este trabalho foi apoiado pela Divisão de Investigação intramuros do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID), Instituto Nacional de Saúde (NIH), EUA. Todos os animais foram mantidos em uma associação americana para a Acreditação de Laboratório Animal Care credenciados biotério do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID) e alojados em conformidade com os procedimentos descritos no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório sob os auspícios de um protocolo aprovado pelo Animal Care e do Comitê de Uso do NIAID.

1. Isolamento de rato Células da Medula Óssea <ol><li> Eutanásia camundongos usando o protocolo cuidados com os animais da instituição comitê-aprovado e pulverizar a superfície animal com etanol 70%. </li><li> Realizar uma incisão da pele, em meados dos abdómen e remover a pele a partir da parte distal do rato, incluindo a pele que cobre as extremidades inferiores. </li><li> Cortar os músculos dos membros inferiores usando tesoura e deslocar cuidadosamente o acetábulo do quadril, evitando quebrar a cabeça do fêmur. </li><li> Remova os músculos remanescentes do fêmur e da tíbia utilizando um bisturi e tesoura e separar o fêmur da tíbia no joelho cuidado exercitar para não quebrar as extremidades ósseas. Colocar os ossos numa placa de Petri contendo gelada 1X RPMI 1640 suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina / estreptomicina. </li><li> Prossiga com as seguintes etapas sob uma capa de cultura de tecidos. Tome precauções extras para manter técnicas estéreis rigorosas para evitar neutrophiativação l. </li><li> Lavar cada osso com etanol a 70% (dentro de uma placa de Petri), seguido de três lavagens subsequentes em PBS gelado (estéril dentro de placas de Petri) para enxaguar o etanol a partir da superfície dos ossos. </li><li> Dentro de uma placa de Petri estéril limpo, cortar as epífises dos ossos e mantê-los de lado. </li><li> Utilize uma agulha de calibre 25 e uma seringa de 12 cc cheio com meio RPMI suplementado com 10% de FBS e 2 mM de EDTA, e lave as células da medula óssea a partir de ambas as extremidades dos veios de osso em um ml de tampa de rosca tubo Falcon de 50 equipado com um 100 um filtrar. De modo a remover de forma eficiente todas as células, raspar a superfície interior dos ossos utilizando a agulha de calibre 25. </li></ol> NOTA: O branqueamento dos ossos indica que as células tenham sido suficientemente raspada. NOTA: Use aproximadamente 10 ml de mídia para liberar um fêmur / par tíbia. Adição de EDTA para o meio é essencial para prevenir a aglutinação das células. <ol start="9"><li> Corte as epífises ósseasem pequenos 0,5-1 mm 3 peças com um bisturi e esmagá-los através do filtro 100 mM utilizando o back-end de um 2,5 ml Eppendorf Combitip Além disso Biopur ponteira. </li><li> Centrifugar a 1400 rpm durante 7 minutos a 4 ° C. </li><li> Lisar as células vermelhas do sangue por ressuspensão do sedimento celular em 20 ml de 0,2% de NaCl por aproximadamente 20 seg, seguido pela adição de 20 ml de 1,6% de NaCl. (Crítica: Não exceda 20-30 seg de lise hipotônica para evitar a morte de células de medula óssea O uso de NaCl para a lise hipotônica é recomendado em tampão de lise ACK porque este último tem o potencial de ativar os neutrófilos.). </li><li> Centrifugar durante 7 min a 1400 rpm a 4 ° C para recolher as células. </li><li> Lavar as células com meio RPMI 1640 suplementado com 1X SBF a 10% e EDTA 2 mM e centrifugar tal como no passo 1.12. </li><li> O rendimento de células da medula óssea, utilizando este método é cerca de 60-80 milhões por não infectado 8-12 semanas de idade C57BL / 6 mouse. </li></ol> 2. Separação de Neutrófilospor Gradiente de Densidade Centrifugação <ol><li> Contar as células da medula óssea e ressuspender em 1 ml de PBS gelado estéril. </li><li> Adiciona-se 3 ml de Histopaque 1119 (densidade 1,119 g / ml) num tubo cónico de 15 ml. </li><li> Sobreposição de 3 ml de Histopaque 1077 (densidade 1,077 g / ml), em 3 ml de Histopaque 1119. </li></ol> NOTA: Histopaque Histopaque 1119 e 1077 deve ser aquecida até 18-26 ° C antes da utilização. Passo Crítica: Preparar gradientes imediatamente antes da utilização como preparação do gradiente com antecedência irá resultar em difusão entre as duas camadas e de pureza e recuperação de neutrófilos subóptima. Passo Crítica: Sobreposição sobre Histopaque 1077 1119 precisa ser feito lentamente, a fim de evitar a mistura dos dois densidades, que não permita a separação de células, durante a centrifugação. <ol start="4"><li> Sobrepor a suspensão de células de medula óssea no topo do Histopaque 1077. </li></ol> Passo Crítico: Sobrecargaaying a suspensão de células de medula óssea sobre Histopaque 1077 precisa ser feito lentamente, a fim de evitar perturbar a interface entre as células e Histopaque 1077. NOTA: Ressuspender as células da medula óssea de um rato infectado em 1 ml de PBS produz pureza dos neutrófilos de&gt; 90%. No entanto, reunindo muitas amostras de medula óssea compromete a pureza dos neutrófilos, por exemplo, ressuspensão 300 x 10 6 células em 3 ml de PBS, reduz a pureza dos neutrófilos a partir de&gt; 90% para ~ 80%. Portanto, os investigadores devem realizar experiências-piloto para identificar a contagem / volume condições celulares ideais para seus experimentos específicos <ol start="5"><li> Centrifugar durante 30 minutos a 2000 rpm a 25 ° C sem travagem. </li></ol> NOTA: A centrifugação do gradiente à temperatura ambiente é fundamental e essencial para uma separação efectiva das neutrófilos. <ol start="6"><li> Recolher os neutrófilos na interface do Histopaque 1119 e 1077 Histopaque camadas. </li&gt; <li> Lavar os neutrófilos colhidos duas vezes com RPMI 1640 suplementado com 1X SBF a 10% e 1% de penicilina / estreptomicina e centrifugar a 1400 rpm durante 7 minutos a 4 ° C. </li><li> Conte os neutrófilos e determinar sua viabilidade. </li></ol> NOTA: Os neutrófilos são tipicamente&gt; 95% viáveis ​​e&gt; 90% de pureza tal como determinado por análise FACS. O rendimento típico de neutrófilos na medula óssea (isto é, 2 fémur e os ossos da tíbia 2) de uma não infectada 8-12 semanas de idade C57BL / 6 de rato é de ~ 6-12 milhões de células. Este número é substancialmente maior quando os neutrófilos são colhidas a partir da medula óssea de animais infectados. Assim, ~ 30-40000000 neutrófilos / mouse foram recuperados quando os ratos Candida infectados foram utilizados para a colheita de 6 células. 3. Rotulagem de neutrófilos utilizando corantes CellTracker <ol><li> Ressuspender as neutrófilos a 5 x 10 6 células / ml em PBS pré-aquecido a 37 ° C. </li><li> Adicionar um corante CellTracker numa concent definitivoração de 5 mM. </li></ol> NOTA: CellTracker Verde (CMFDA (diacetato de 5-Chloromethylfluorescein) e CellTracker laranja (CMTMR (5 - (e-6)-4-clorometil tetrametilrodamina Amino benzoíla) foi utilizado neste protocolo para rotular diferencialmente os neutrófilos a partir de tipo selvagem e o gene deficiente ratinhos. NOTA: Prepare uma solução estoque de 10 mM de Green CellTracker e CellTracker Orange, alíquotas e armazenar a -80 ° C até o dia do experimento. <ol start="3"><li> Incubar neutrófilos com 5 uM do corante CellTracker correspondente durante 10 min a 37 ° C num banho de água com agitação no escuro. </li><li> Lave as células duas vezes com meio RPMI gelado 1X 1640 suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina / estreptomicina. </li></ol> NOTA: lavagem eficiente das células após o passo de marcação com o corante CellTracker é essencial para evitar a contaminação cruzada de corante antes de misturar populações de neutrófilos diferencialmente etiquetadas para Downstream estudos repovoamento competitivos. 4. Transferência adotiva de neutrófilos em camundongos e análise de neutrófilos transferidos por citometria de fluxo <ol><li> Neutrófilos Ressuspender em PBS arrefecido com gelo, a uma concentração de 25 x 10 6 células / ml e injectar 200 ul da suspensão para dentro da veia lateral da cauda de modo que 5 x 10 6 neutrófilos são transferidos por ratinho. Para os estudos de neutrófilos de repovoamento competitivo, mistura neutrófilos de tipo selvagem e o gene deficiente em uma proporção de 1:1 e injectar um total de 5 x 10 6 por ratinho neutrófilos como acima. </li></ol> NOTA: pelo menos até 10 x 10 6 de neutrófilos podem ser adoptivamente transferidos por ratinho sem toxicidade imediatamente óbvio para os animais. <ol start="2"><li> Em diferentes momentos após a transferência adoptiva (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4 horas após a transferência), eutanásia ratos e colheita de sangue e / ou medula óssea e / ou outros órgãos alvo (s) de interesse. </li><li> Prepare siAs suspensões de células ngle destes tecidos para análise quantitativa e qualitativa dos neutrófilos marcados adoptivamente transferidos utilizando protocolos publicados 6,15. </li><li> Após vivo / morto a coloração de viabilidade e bloqueio Fc, as células de etiqueta com CD45 (clone 30-F11), Ly6G (clone 1A8) e CD11b (clone M1/70) e portão vivo na CD45 + + CD11b + Ly6G neutrófilos. Os neutrófilos neste portão incluem neutrófilos nativas do ratinho receptor, bem como os neutrófilos marcados transferidas adoptivamente, que são + FITC (se marcado com CellTracker verde) ou PE + (se marcado com células Rastreio de laranja). </li></ol> NOTA: Os neutrófilos podem ser rastreadas no sangue, medula óssea e do rim de ratinhos infectados com Cândida por pelo menos 4 horas após a transferência. NOTA: A fixação com paraformaldeído a 2% em PBS, não afecta negativamente a intensidade de fluorescência média dos neutrófilos marcados com Gr CellTrackereen ou CellTracker laranja por pelo menos 48 horas.

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Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.

Apresentamos aqui um protocolo seguro, simples, rápido e económico para o isolamento de grandes números de neutrófilos na medula óssea de ratinhos com elevado grau de pureza e viabilidade usando uma abordagem de centrifugação em gradiente de densidade. Quando este protocolo é realizado correctamente, ~ 6-12 x 10 6 neutrófilos pode ser recuperado a partir de um rato não infectado e tantos como ~ 30-40 x 10 6 neutrófilos podem ser isolados a partir de um rato após a infecção, 6.</s...

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes nos seres humanos. Eles são o principal componente celular do sistema imune inato e agir como uma primeira linha de defesa contra microorganismos invasores. Pacientes com neutropenia adquirida e imunodeficiências primárias que afetam os números de neutrófilos e / ou função desenvolver infecções bacterianas e fúngicas invasoras que ameaçam a vida, destacando a importância dessas células na defesa do hospedeiro 1. O reconhecimento imunológico dos patogénios invasores no local da infecção pelo seu padrão de reconhecimento de receptores de cognato resulta na indução de uma resposta imune inata orquestrada, o que leva à secreção de quimioatractivos que geram um gradiente quimiotáctica capaz de recrutamento de neutrófilos a partir da corrente sanguínea para o tecido inflamado 2 . Depois de introduzir os neutrófilos no local da infecção, eles tornam-se activados, que conduz à produção de citocinas e quimiocinas, absorção de agente patogénico, e me matar através oxidativo e não-oxidativochanisms 3. Além de seu papel bem reconhecida na imunidade inata, os neutrófilos têm também sido mostrado recentemente a desempenhar papéis importantes como iniciadores da resposta imune adaptativa eficaz 4. Por outro lado, para além do seu papel na imunidade de protecção, os neutrófilos podem também mediar lesão tecidual e imunopatologia devido à acumulação excessiva e / ou activação em locais de inflamação, como se mostra em uma variedade de doenças infecciosas e auto-imunes 5-7. Apesar de o papel indispensável de neutrófilos em montagem respostas imune inata eficazes e suas funções efetoras pleiotrópicos em várias doenças infecciosas e inflamatórias, dificuldades técnicas com a manipulação dessas células ea falta de protocolos experimentais de confiança tem dificultado a pesquisa com neutrófilos nas últimas décadas. Portanto, a utilização de ensaios reprodutíveis para o isolamento dos neutrófilos devem facilitar a investigação sobre neutrófilos mediada imunológicasfunções gica ex vivo e in vivo. Até à data, vários métodos têm sido descritos para o isolamento de neutrófilos, tais como a centrifugação do gradiente de densidade de sangue humano e de rato, ou medula óssea 8,9, enriquecimento imunomagnética positiva ou negativa dos neutrófilos do sangue ou da medula óssea do rato 10,11, e colhendo de neutrófilos da cavidade peritoneal de ratinhos a seguir à injecção intraperitoneal de tioglicolato ou outros agentes inflamatórios 12. Apesar de neutrófilos pode ser facilmente isolado em grande número a partir do sangue humano, este método é de qualidade inferior em ratos devido ao volume limitado de sangue de rato que impede o isolamento de neutrófilos suficientes para estudos funcionais ou experimentos de transferência adotivos 13. Além disso, embora o rendimento de tioglicolato-induziu as células da cavidade peritoneal é maior comparada com a de rato no sangue, a pureza dos neutrófilos na lavagem peritoneal inflamatória varia entre60-90%, e os neutrófilos isolados apresentam um fenótipo activado. Assim, as células recolhidas utilizando este método só pode ser utilizado para a realização de estudos funcionais activados, mas não de neutrófilos não estimulados, como a cavidade peritoneal do rato tem alguns neutrófilos no estado estacionário 12. Em vez disso, a medula óssea é um reservatório conveniente para colheita de grandes números de neutrófilos, quer não estimuladas ou ativadas 11,14, que podem então ser utilizadas para estudos funcionais a jusante, tais como fagocitose, matando e desgranulação, ou por transferência adoptiva em ratinhos receptores. Aqui nós descrevemos um método simples e rápido (~ 2 horas) protocolo, o que proporciona um alto rendimento (~ 6-12 × 10 6 neutrófilos / mouse não infectado, ou até 30-40 × 10 6 neutrófilos / mouse infectados) de puro (80 -95%) neutrófilos com&gt; 95% de viabilidade a partir da medula óssea. Este método utiliza Histopaque disponíveis comercialmente, que são a densidade de célula separada gradientemeios ração consistindo de Ficoll e diatrizoato de sódio, para separar os neutrófilos a partir da medula óssea de ratinhos. Este método produz números significativamente maiores de neutrófilos por ratinho em comparação com o sangue ou da cavidade abdominal, que pode ser utilizado para recolher os neutrófilos a partir de ratos, tanto no estado estacionário, ou após a infecção, e que é mais fácil a camada de comparação com o método de centrifugação em gradiente de densidade descontínuo que utiliza gradientes de Percoll consistem em 55% / 65% / 75% de Percoll em PBS 9. Além disso, o tempo e os recursos necessários para recolher neutrófilos puras são significativamente diminuída comparada com o isolamento dos neutrófilos utilizando separação de células activada por fluorescência. Além disso, porque este método não envolve uma etapa de enriquecimento imunomagnética, é mais rentável, e evita a exposição das células à coluna magnética e anticorpos, diminuindo assim a probabilidade de activação de neutrófilos. Além de realizar estudos funcionais de neutroph isoladoils ex vivo e transferência adoptiva de células em ratinhos receptores, este protocolo também descreve um método para a marcação de neutrófilos isolados, utilizando diferentes corantes CellTracker. Rotulagem diferencial de neutrófilos de ratos de diferentes origens genéticas pode ser adaptado em estudos de repovoamento competitivos para acompanhar os neutrófilos transferidos em tecidos de camundongos destinatário usando citometria de fluxo, o que pode fornecer uma visão mecanicista sobre o papel direto de genes específicos no tráfico de neutrófilos do sangue em órgãos-alvo inflamadas 6.

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 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES</td>
 <td>Cellgro</td>
 <td>10-041-CV</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)</td>
 <td>GemCell</td>
 <td>100500</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>15140</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.5 M EDTA</td>
 <td>Quality Biological Inc</td>
 <td>351-027-101</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.2% and 1.6% sodium chloride</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>3624</td>
 <td>Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile filtered Histopaque 1077</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>10771</td>
 <td>Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 &deg;C before use</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile filtered Histopaque 1119</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>11191</td>
 <td>Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 &deg;C before use</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium</td>
 <td>Cellgro</td>
 <td>210-40-CV</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl Alcohol (200 proof)</td>
 <td>The Warner Graham Company</td>
 <td>64-17-5</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C-7025</td>
 <td>Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C-2927</td>
 <td>Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11)</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>170451-82</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td>551461</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td>560599</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD11b (Clone M1/70)</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>47-0112-82</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td>553141</td>
 <td>Use at 1:100 dilution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
 <td>Molecular Probes</td>
 <td>L-23105</td>
 <td>Use at 1:1000 dilution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>67-68-5</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td>
 <td>USB Corporation</td>
 <td>19943</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Materials</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C57BL/6 mice</td>
 <td>Taconic</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml centrifuge tubes</td>
 <td>Corning</td>
 <td>430053</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml centrifuge tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352070</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 ml serological pipettes</td>
 <td>Celltreat</td>
 <td>229225B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml serological pipettes</td>
 <td>Celltreat</td>
 <td>229210B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml serological pipettes</td>
 <td>Celltreat</td>
 <td>229205B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes (3 ml)</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>357575</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12 ml syringes</td>
 <td>Kendall monoject</td>
 <td>512878</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)</td>
 <td>BD</td>
 <td>305122</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 mm cell strainers</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352360</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bactericidal Petri dishes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>351029</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Combitips Plus Biopur</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>2249608-5</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel)</td>
 <td>Biomedical Research Instruments</td>
 <td>10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000</td>
 <td>Instruments sterilized prior to use</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture hood</td>
 <td>The Baker Company</td>
 <td>SG403</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Refrigerated centrifuge</td>
 <td>Thermo Fischer Scientific</td>
 <td>75004521</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>37 &deg;C shaking water bath</td>
 <td>Thermo Fischer Scientific</td>
 <td>3166721</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments

Os neutrófilos são células efetoras críticos do sistema imune inato. Eles são rapidamente recrutados em locais de inflamação aguda e exercem efeitos protectores ou patogénicos, dependendo do meio inflamatório. No entanto, apesar de o papel indispensável dos neutrófilos na imunidade, a compreensão detalhada dos fatores moleculares que medeiam efeitos efetoras e imunopatogênico &#39;neutrófilos em diferentes doenças infecciosas e inflamatórias ainda está faltando, em parte por causa de sua meia-vida curta, as dificuldades com a manipulação destes células ea falta de protocolos experimentais confiáveis ​​para a obtenção de um número suficiente de neutrófilos para estudos funcionais jusante e experimentos de transferência adotiva. Portanto, os métodos simples, rápido, econômico e confiável são altamente desejáveis ​​para a colheita de um número suficiente de neutrófilos de rato para avaliar funções, tais como fagocitose, morte, produção de citocinas, degranulação e tráfico. Para esse fim,apresentamos um protocolo de gradiente de densidade reprodutíveis baseado centrifugação, que pode ser adaptada em qualquer laboratório para isolar um grande número de neutrófilos na medula óssea de ratinhos com elevado grau de pureza e viabilidade. Além disso, apresenta-se um protocolo simples, que utiliza tintas, CellTracker para rotular os neutrófilos isolados, que podem então ser transferidos adoptivamente para ratinhos receptores e rastreadas em vários tecidos, pelo menos, quatro horas após a transferência usando citometria de fluxo. Utilizando esta abordagem, a rotulagem diferencial de neutrófilos de ratinhos de tipo selvagem e o gene deficiente, com diferentes corantes CellTracker pode ser empregue com sucesso para realizar estudos de repovoamento competitivo para avaliar o papel directo de genes específicos no tráfico de neutrófilos do sangue para os tecidos alvo in vivo .

Este protocolo é otimizado para a colheita de células da medula óssea de camundongos e posterior separação de neutrófilos a partir dessas células por centrifugação em gradiente de densidade, utilizando meios de separação Histopaque celulares disponíveis no mercado. Os neutrófilos isolados utilizando este método pode ser usado para uma variedade de estudos funcionais a jusante ex vivo e para experiências de transferência adoptiva em ratinhos receptores. O rendimento t...

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Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Descreve-se um protocolo para o isolamento e purificação de neutrófilos de medula óssea do rato por centrifugação de gradiente de densidade e de neutrófilos para rotulagem com corantes CellTracker. Isso representa um método simples, rápido, reprodutível e econômica para a obtenção de um grande número de neutrófilos para estudos funcionais a jusante ou de transferência e controle de experimentos adotivos.

Isolamento, purificação e Rotulagem de neutrófilos da medula óssea do rato de Estudos funcionais e Experimentos de transferência adotiva

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

isolation-purification-labeling-mouse-bone-marrow-neutrophils-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

61.3K visualizações.  National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH. Descreve-se um protocolo para o isolamento e purificação de neutrófilos de medula óssea do rato por centrifugação de gradiente de densidade e de neutrófilos para rotulagem com corantes CellTracker. Isso representa um método simples, rápido, reprodutível e econômica para a obtenção de um grande número de neutrófilos para estudos funcionais a jusante ou de transferência e controle de experimentos adotivos.

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Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

Metástase experimental e CTL Adoptive Transferência Modelo rato Imunoterapia

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Imunologia e Infecção

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

Geração e Rotulagem de murino derivadas da medula óssea Células Dendríticas com Nanocristais Qdot de Estudos de rastreamento

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

Diferenciando papéis funcionais da expressão do gene de células imunes e não-imunes na colite Rato por Transplante de Medula Óssea

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Isolamento e injecção intravenosa de Murino de Medula Óssea Derivado monócitos

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

Acompanhando Rato Medula Óssea monócitos<em&gt; In Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Murino Hind Limb Ossos Longos Dissecção e Medula Óssea O isolamento

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocitï¿½des do rato de Medula Óssea

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in diameter. MPs are a newly evolving, important part of cell-to-cell communication and signaling machinery. Because of their size and the nature of their release, until recently MP existence was overlooked. However, with improved technology and analytical methods their function in health and disease is now emerging. The protocols presented here are aimed at isolating and characterizing PMN-MPs by flow cytometry and immunoblotting. Moreover, several implementation examples are given. These protocols for MP isolation are fast, low-cost, and do not require the use of expensive kits. Furthermore, they allow for the labeling of MPs following isolation, as well as pre-labeling of source cells prior to MP release, using a membrane-specific fluorescent dye for visualization and analysis by flow cytometry. These methods, however, have several limitations including purity of PMNs and MPs and the need for sophisticated analytical instrumentation. A high-end flow cytometer is needed to reliably analyze MPs and minimize false positive reads due to noise or auto-fluorescence. The described protocols can be used to isolate and define MP biogenesis, and characterize their markers and variation in composition under different stimulating conditions. Size heterogeneity can be exploited to investigate whether the content of membrane particles versus exosomes is different, and whether they fulfill different roles in tissue homeostasis. Finally, following isolation and characterization of MPs, their function in cellular responses and various disease models (including, PMN-associated inflammatory disorders, such as Inflammatory Bowel Diseases or Acute Lung Injury) can be explored.

New protocols are described here to isolate and characterize microparticles derived from human and mouse neutrophils. These protocols utilize ultracentrifugation, flow cytometry, and immunoblotting techniques to analyze microparticle content, and they can be used to study the role of microparticles derived from various cell types in cellular function.

Isolamento e caracterização de micropartículas de neutrófilos-derivado para estudos funcionais

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

Identificação e isolamento de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores da medula óssea de rato

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that antigen-presenting dendritic cells (DCs) can sense elevated extracellular sodium leading to the activation of the NADPH oxidase and formation of isolevuglandin (IsoLG)-protein adducts. These IsoLG-protein adducts react with self-proteins and promote an autoimmune-like state and hypertension. We have developed and optimized state-of-the-art methods to study DC function in hypertension. Here, we provide a detailed protocol for isolation, in vitro treatment with elevated sodium, and adoptive transfer of murine splenic CD11c+ cells into recipient mice to study their role in hypertension.

Here, we present a protocol to isolate dendritic cells from murine spleens by magnetic cell sorting and subsequent adoptive transfer into na&#239;ve mice. The model of high-salt activated dendritic cells was chosen to explain the step-by-step procedures of adoptive transfer and flow cytometry.