Este trabalho foi financiado pelo NIH NIDCD Y1-DC-8002-01. Este trabalho foi realizado sob os auspícios do Departamento de Energia dos EUA por Lawrence Livermore National Laboratory sob contrato DE-AC52-07NA27344.

1. Assembleia da Sonda para Stiffener Esta secção do protocolo descreve a fabricação de um reforçador de silício, e a montagem de uma sonda de polímero de película fina para o reforço. Figura 1 ilustra uma sonda neuronal polímero típico, juntamente com o reforço proposto. Os detalhes da concepção de reforço são mostrados na Figura 2. O romance característica deste projeto é a rasa &quot;absorção&quot; do canal em execução ao longo de seu comprimento, que é usado para distribuir adesivo líquido durante a montagem. A porção mais larga do reforçador é um guia para a manipulação durante a montagem e a inserção cirúrgica. Um reservatório no separador liga ao canal. O componente é fabricado a partir de silício usando os processos de microfabricação padrão. <ol><li> O reforço de silício com um canal de capilaridade foi fabricada a partir de um (SOI) bolacha de silício sobre isolante com uma espessura de camada do dispositivo igual à espessura desejada para o reforço ( <strong&gt; Figura 3A). A gama razoável de espessura reforço é de 20-100 m. Recomenda-se que a largura do reforço ser de 20-30 mM menor do que a largura da sonda, o que ajuda a evitar transbordamento do adesivo a partir do interface de ligação com a ponta da sonda. Primeiro, os canais de capilaridade são seco-gravadas utilizando o processo de Bosch padrão (Figura 3B). Em seguida, a geometria de reforço está definido por uma erosão mais que pára sobre a camada de óxido enterrado (Figura 3C). Finalmente, os reforços são libertados por molhado de gravura a camada de óxido enterrado em 49% de ácido fluorídrico (Figura 3D). Depois de uma minuciosa lavagem dos reforços, mergulhe-os em água deionizada por 15 min. </li><li> Coloque um sedimento de polietileno glicol (PEG) de peso molecular de 10.000 g / mol para dentro do reservatório (Figura 4). Aquecer o reforço para 65 ° C, de modo que o PEG derrete e pavios para dentro do canal, por acção capilar. Em seguida, arrefecer até à temperatura ambiente para solidificar. </li&gt; <li> A Figura 5 mostra um diagrama esquemático do chip Bonder aleta configurado. Coloque o reforço de cabeça para baixo no palco base do bonder flip chip, em seguida, pegar o reforço com a cabeça da ferramenta. Coloque a sonda de cabeça para baixo no palco base. Usando o bonder flip chip, alinhar o reforço ea sonda e abaixe o reforço e coloque-a na sonda. </li><li> A fase de base do Bonder flip chip deve ter um elemento de aquecimento para aplicar calor para o substrato. Após a colocação do reforço, aquecer o conjunto, mais uma vez a 65 ° C. Permitir um minuto para o PEG a refusão e começam a encher na interface entre a sonda e reforço. Legal para solidificar. </li><li> Vire o conjunto mais e inspecionar a partir do topo. Reaquecimento conforme necessário para permitir que o PEG para encher completamente a interface entre a sonda e o reforço. Isto pode ser avaliado visualmente uma vez que a sonda é transparente. Como o conjunto é sentado no aquecedor superior (sonda-) para cima, coloque manualmente 1-3 epelotas xtra de PEG sólido para o separador de modo a que elas derretem sobre a sonda, proporcionando um reforço adicional nesta região (Figura 6). Finalmente, permitir que o conjunto esfriar para que o PEG solidifica. Neste ponto, o conjunto está pronto para inserção cirúrgica. </li></ol> 2. Inserção e Extração <ol><li> Montar o conjunto de sonda de reforço a um micromanipulador, tal como ilustrado na Figura 7A, aderindo a parte de trás do esticador para o braço micromanipulador na região do separador. Isto pode ser feito com fita dupla face ou de cimento, mas tome cuidado para não entrar em contato com a sonda com adesivo. Temporariamente fixar a extremidade do conector da sonda para o micromanipulador com um pequeno pedaço de massa de vidraceiro de adesivo de tal modo que ela pode ser facilmente removida com pouca força. </li><li> Posicione o conjunto da sonda sobre o alvo e introduzir a sonda com a velocidade de inserção desejado. Velocidades de inserção de 0,13-0,5 mm / s foram utilizados no desenvolvimento deste protocolo. &lt;/ Li&gt; <li> Remover imediatamente a extremidade do conector da sonda do micromanipulador delicadamente e colocá-la sobre uma superfície próxima, como um segundo braço manipulador (Figura 7B). Isto deve ser feito antes de o PEG começa a dissolver-se, para evitar o deslocamento da sonda. </li><li> Dê tempo para PEG para dissolver. Este período de tempo dependerá do peso molecular do PEG e a área de contacto entre a sonda e reforço. Por exemplo, com o PEG de peso molecular de 10.000 g / mol, uma sonda microeléctrodo cerca de 6 mm e um reforço correspondente, que é de 306 um de largura, 15 min foi encontrado para ser uma quantidade de tempo adequada. Seção 3 do protocolo apresenta um método para testar o tempo de dissolução necessário. Durante este tempo, aplicam-se tampão fosfato salino (PBS), utilizando um conta-gotas em torno do ponto de guia e inserção para dissolver qualquer PEG que é acima do alvo (Figura 7C). </li><li> Usando um microposicionador motorizado, começam a extracção do reforço através da aplicação de um deslocamento100 mM a uma velocidade de 5 mm / seg. Este movimento rápido inicial ajuda a superar qualquer atrito estático e minimizar o deslocamento da sonda. Em seguida, completar a extracção de reforço a uma velocidade mais lenta de aproximadamente 0,1 mm / segundo (Figura 7D). </li><li> No caso de uma cirurgia real, continuar com os procedimentos normais de aplicação de gel, de silicone, e / ou acrílico dental no local de inserção para fixar e proteger a sonda, tal como demonstrado no 21. </li></ol> 3. Agarose Gel Teste Esta seção do protocolo descreve um procedimento estabelecido e examinar a extração do reforço em um gel de agarose a 0,6%, que aproxima as propriedades mecânicas em massa, pH e salinidade do tecido cerebral 17,22. Uma vez que o gel é quase transparente por meio de distâncias curtas, a separação de reforço e deslocamento da sonda pode ser observado. <ol><li> Prepara-se uma solução de 0,6% de agarose em tampão fosfato salino (PBS). Misture a um elementovada temperatura para dissolver completamente o pó de agarose. Despeje a solução em uma caixa de acrílico rasa; gel deve ser 3/4- 1 em profundidade. Permitir que o gel repousar à temperatura ambiente durante uma hora. </li><li> Certifique-se de que o gel endurecido é saturada com PBS de modo a que não seque, e aquecer o gel a 37 ° C. </li><li> Configurar o micromanipulador, caixa de gel de agarose, e um sistema de câmara microscópica, como mostrado na Figura 8. </li><li> Insira uma referência de vidro fiducial na caixa de gel deslizando-o entre o gel e o lado da caixa (Figura 8). Use uma pick dental a quadratura as características do fiducial referência ao campo de visão do microscópio digital. </li><li> Montar o conjunto de sonda para o micromanipulador, tal como descrito na etapa 2.1. </li><li> Posicione o conjunto da sonda sobre o gel cerca de 1 mm por trás do fiducial referência. </li><li> Inserir a sonda em gel, utilizando a câmera para guiá-la a uma profundidade desejada no campo de visão. &lt;/ Li&gt; <li> Mover-se imediatamente a extremidade de ligação da sonda para descansar sobre uma superfície próxima. </li><li> Faça os ajustes necessários para a imagem da câmera para focar a sonda (os recursos fiduciais de referência pode ser um pouco fora de foco). Tome um instantâneo do local da sonda. </li><li> Permitir PEG para dissolver (este tempo pode variar, e na verdade pode ser um parâmetro a ser testado). Aplicar PBS perto da guia para dissolver o PEG que é acima do gel. </li><li> Iniciar captura vídeo, se desejado, e começar a extracção do reforço tal como descrito na etapa 2.5. Quando a extração for concluída, tirar um instantâneo final localização da sonda. </li><li> Use as ferramentas de processamento de imagens para comparar as imagens antes e depois da extração de reforço. Use os recursos do fiducial de referência que são visíveis no campo de visão para se registrar (alinhar) as imagens. Calibrar a escala da imagem com base no tamanho dos elementos conhecidos na sonda. Meça a distância de deslocamento da sonda. </li></ol>

<ol>
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Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

O método descrito aqui fornece um processo bem controlado para anexar sondas de polímeros de película fina de reforços separadas com um adesivo biodissolvable. Também apresentado é o procedimento cirúrgico recomendado para implementar estes stiffeners removível e uma técnica para validar o processo in vitro para uma dada configuração da sonda-reforço. Uma vez que o reforço pode ser feito de forma arbitrária rígida, o método pode facilitar a inserção de sondas relativamente longas (&gt; 3 mm). ...

Matrizes de microeletrodos são uma ferramenta essencial em neurociência, bem como aplicações clínicas emergentes, como próteses. Em particular, penetrantes sondas micro-eletrodos permitem a estimulação e registro da atividade neuronal através do contato próximo com as células do cérebro, medula espinhal e nervos periféricos. Um grande desafio para as sondas neurais implantados é a estabilidade e longevidade das funções de estimulação e gravação. Os estudos de modelação e experimentais da interacção entre sondas de microeléctrodos e tecido neural sugeriram que um mecanismo de degradação é micro-rasgamento do tecido neural devido a um ligeiro movimento relativo entre a sonda e o tecido 1-3. Uma solução é fabricar sondas flexíveis que correspondem mais de perto as propriedades de rigidez em massa de tecido neural, a fim de minimizar micromovimento relativa. Como tal, polímeros biocompatíveis película fina, como poliimida e parylene foram adotados como substratos favoráveis ​​para microeleceléctrodo investiga 4-8. Uma troca de sondas flexíveis é que eles são difíceis de inserir no tecido neural. Os investigadores têm tido abordagens diferentes para facilitar a inserção de sondas flexíveis enquanto preserva as propriedades mecânicas desejáveis. Uma classe de projetos modifica a geometria da sonda polímero para aumentar a rigidez em determinadas seções ou eixos, mantendo a conformidade em outras partes. Isto foi conseguido através da incorporação de nervuras ou camadas de outros materiais de 9,10. Outra abordagem integra um canal 3-D para o desenho da sonda de polímero que é enchido com material biodegradável 11. Esta sonda pode ser endurecido temporariamente, e depois da inserção do material em dissolver o canal de saída e de esgotos. No entanto, os métodos como estes que modificam permanentemente a geometria do dispositivo final implantado pode comprometer algumas das características desejáveis ​​da sonda flexível. Um método que faz not alterar a geometria da sonda final é para encapsular o dispositivo de polímero com material biodegradável para endurecer temporariamente o dispositivo de 12-14. No entanto, os materiais biodegradáveis ​​típicos têm pedidos de módulos de Young de grandeza menor do que a de silício e, por consequência, necessitam de maior espessura para conseguir a mesma rigidez. Adequadamente revestimento da sonda pode resultar em uma ponta mais arredondada ou cega, fazendo inserção mais difícil. Além disso, uma vez que os revestimentos que se dissolvem são expostos, há um risco de se dissolver imediatamente ao entrar em contacto, ou mesmo grande proximidade, com o tecido. Uma outra classe de métodos utiliza materiais de substrato novo teste que reduzem a rigidez depois de ser implantado no tecido. Tais materiais incluem polímeros de memória de forma 15 e um nanocompósito adaptativo mecanicamente 16. Estes materiais são capazes de diminuir o módulo de elasticidade significativamente após a inserção, e pode resultar em que as sondas mais intimamente MatCh as propriedades mecânicas do tecido neural. No entanto, a gama possível de rigidez ainda é limitado, portanto, podem não ser capazes de fornecer muito elevada rigidez equivalente ao silício ou tungstênio fios. Assim, no caso de sondas flexíveis, que são muito longo (por exemplo,&gt; 3 mm) ou que têm extremamente baixa rigidez, pode ainda ser necessário um método de fixar temporariamente um reforço mais rígidas. Ainda um outro método promissor relatado é para revestir um serviço de transporte de enrijecimento com um auto-montagem monocamada permanente (SAM) para personalizar a interação de superfície entre o ônibus ea sonda flexível 17. Quando seca, a sonda adere ao transporte revestido eletrostático. Após a inserção, a água migra para a superfície hidrofílica, separando a sonda do ônibus para que o transporte pode ser extraído. Foi demonstrada a extração de Transporte com o deslocamento da sonda reduzida (85 mm). No entanto, com apenas interacções electrostáticas que prende a sonda de tele shuttle, há algum risco de derrapagem sonda em relação ao transporte, antes e durante a inserção. Desenvolvemos um método em que a sonda flexível é ligada a um reforço com um material adesivo temporário biodissolvable que prende firmemente a sonda durante a inserção. As sondas utilizadas foram feitas de poliamida, que tem um módulo de elasticidade da ordem de 2-4 GPa. O reforço foi fabricado a partir de silicone, com um módulo de elasticidade de 200 GPa ~. Quando ligada, a rigidez do silício domina, facilitando a inserção. Uma vez inserido no tecido, o material adesivo se dissolve e o reforço é extraído para restaurar a sonda para a sua flexibilidade inicial. Foram selecionados de polietileno glicol (PEG) como o material adesivo biodissolvable. PEG tem sido usada em aplicações de implantados, tais como sondas neurais, engenharia de tecidos, e 11,18,19 a entrega da droga. Algumas evidências sugerem que o PEG pode atenuar resposta neuroinflammatory no cérebrotecido 18,20. Em comparação com outros materiais possíveis, incluindo sacarose,-co-ácido glicólico ácido poli (PLGA), e álcool polivinílico (PVA), o PEG tem um tempo de dissolução em fluidos biológicos, que é de uma dimensão adequada para muitas cirurgias de implante (na ordem de dezenas de minutos, dependendo do peso molecular). Além disso, é sólido à temperatura ambiente e líquido a temperaturas variando 50-65 ° C. Esta propriedade faz com que seja particularmente adequado para o nosso processo de montagem de precisão. Além disso, semelhante à descrita no SAM 17, o PEG é dissolvido hidrofílica, facilitando a extracção do reforço. Esta abordagem vantajoso é ativado por um projeto reforço novela e processo de montagem metódica que garantir a cobertura adesiva uniforme e alinhamento preciso e repetível. Em adição ao processo de montagem, que apresentam o método de aplicação do reforçador removível durante a cirurgia, bem como um processo in vitro para avaliar a extracção do stiffener. O protocolo aqui apresentado assume que o utilizador possua uma sonda microeléctrodo de polímero flexível. A parte do protocolo relativo a fabricação do reforço e a montagem desta sonda para um enrijecedor assume acesso a ferramentas comuns encontradas em instalações de microfabricação. O protocolo relativo à inserção e extração provavelmente seria realizado em um laboratório orientada a neurociência.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Polyethylene glycol, 10,000 g/mol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>309028</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Flexible Sub-micron Die Bonder</td>
			<td>Finetech</td>
			<td>Fineplacer lambda</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1760-61</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digital Microscope</td>
			<td>Hirox</td>
			<td>KH-7700</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dual Illumination Revolver Zoom Lens</td>
			<td>Hirox</td>
			<td>MXG-2500REZ</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Precision Motorized Actuator</td>
			<td>Newport</td>
			<td>LTA-HS</td>
			<td>w/ CONEX-CC controller</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

insertion of flexible neural probes using rigid stiffeners attached with biodissolvable adhesive

Matrizes de microeléctrodos para dispositivos de interface neurais que são feitas de polímero biocompatível de película fina são esperados ter estendido vida funcional, porque o material flexível pode minimizar a resposta adversa do tecido causado por micromovimentos. No entanto, a sua flexibilidade impede que eles sejam precisamente inserida no tecido neural. Este artigo demonstra um método para fixar temporariamente uma sonda flexível de microeletrodos para um reforço rígido usando polietileno glicol biodissolvable (PEG) para facilitar a inserção preciso, cirúrgico da sonda. Um design único reforço permite a distribuição uniforme do adesivo PEG ao longo do comprimento da sonda. Ligação Virar-chip, uma ferramenta comum usada em microeletrônica embalagem, permite o alinhamento e fixação da sonda precisa e repetível para o reforço. A sonda e de reforço são implantados cirurgicamente em conjunto, em seguida, o PEG é deixado dissolver-se de modo que o reforço pode ser extraído, deixando a sondano lugar. Por fim, um método de ensaio in vitro é utilizado para avaliar a extracção de reforço num modelo de gel de agarose de tecido cerebral. Esta abordagem à implantação provou ser particularmente vantajoso para as sondas mais flexíveis (&gt; 3 mm). Ele também proporciona um método viável para a implantação de sondas flexíveis de dupla face. Até à data, a técnica tem sido utilizada para obter vários dados in vivo de gravação a partir do córtex de rato.

Esta técnica de inserção foi usado em conjunto com LLNL sondas de poliimida de película fina, os quais passaram ISO 10993 padrões de biocompatibilidade e são destinados à implantação crónica. Uma sonda típica poliimida de película fina é ilustrada na Figura 1, juntamente com um fixador de silício que é de aproximadamente 10 mm de comprimento na região estreita. Este reforço tem um canal de capilaridade que corre ao longo do seu comprimento, como mostrado na Figura 2. Figura 3</s...

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Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

A inserção de sondas de microeletrodos neurais flexíveis está habilitado, anexando sondas para reforços rígidos com polietileno glicol (PEG). Um processo de montagem exclusiva garante uniforme e apego repetível. Após a inserção no tecido, o PEG se dissolve e o reforço é extraído. Um método de ensaio in vitro, avalia a técnica em gel de agarose.

Inserção de Flexible Neural Sondas Usando Reforços rígidos anexados com Biodissolvable Adhesive

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

insertion-flexible-neural-probes-using-rigid-stiffeners-attached-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.6K visualizações.  Lawrence Livermore National Laboratory.  A inserção de sondas de microeletrodos neurais flexíveis está habilitado, anexando sondas para reforços rígidos com polietileno glicol (PEG). Um processo de montagem exclusiva garante uniforme e apego repetível. Após a inserção no tecido, o PEG se dissolve e o reforço é extraído. Um método de ensaio in vitro, avalia a técnica em gel de agarose. 

Vídeo: Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) technique), make use of various surface modification techniques, that can, for example, prevent surface fouling, tune the hydrophobicity / hydrophilicity of the surface, adapt to a variety of electronic environments, and most frequently, induce specificity towards a target of interest.1-5 These techniques extend the functionality of otherwise highly sensitive biosensors to real-world applications in complex environments, such as blood, urine, and wastewater analysis.2,6-7 While commercial biosensing platforms, such as Biacore, have well-understood, standard techniques for performing such surface modifications, these techniques have not been translated in a standardized fashion to other label-free biosensing platforms, such as Whispering Gallery Mode (WGM) optical resonators.8-9
WGM optical resonators represent a promising technology for performing label-free detection of a wide variety of species at ultra-low concentrations.6,10-12 The high sensitivity of these platforms is a result of their unique geometric optics: WGM optical resonators confine circulating light at specific, integral resonance frequencies.13 Like the SPR platforms, the optical field is not totally confined to the sensor device, but evanesces; this "evanescent tail" can then interact with species in the surrounding environment. This interaction causes the effective refractive index of the optical field to change, resulting in a slight, but detectable, shift in the resonance frequency of the device. Because the optical field circulates, it can interact many times with the environment, resulting in an inherent amplification of the signal, and very high sensitivities to minor changes in the environment.2,14-15
To perform targeted detection in complex environments, these platforms must be paired with a probe molecule (usually one half of a binding pair, e.g. antibodies / antigens) through surface modification.2 Although WGM optical resonators can be fabricated in several geometries from a variety of material systems, the silica microsphere is the most common. These microspheres are generally fabricated on the end of an optical fiber, which provides a "stem" by which the microspheres can be handled during functionalization and detection experiments. Silica surface chemistries may be applied to attach probe molecules to their surfaces; however, traditional techniques generated for planar substrates are often not adequate for these three-dimensional structures, as any changes to the surface of the microspheres (dust, contamination, surface defects, and uneven coatings) can have severe, negative consequences on their detection capabilities. Here, we demonstrate a facile approach for the surface functionalization of silica microsphere WGM optical resonators using silane coupling agents to bridge the inorganic surface and the biological environment, by attaching biotin to the silica surface.8,16 Although we use silica microsphere WGM resonators as the sensor system in this report, the protocols are general and can be used to functionalize the surface of any silica device with biotin.

Biosensors interface with complex, biological environments and perform targeted detection by combining highly sensitive sensors with highly specific probes attached to the sensor via surface modification. Here, we demonstrate the surface functionalization of silica optical sensors with biotin using silane coupling agents to bridge the sensor and the biological environment.

Colocar Sondas Biológicas para Biossensores ópticos de sílica usando agentes de acoplamento de silano

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Bioengenharia

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration and cell-cell interactions. The two key parameters of cellular biomechanics are cellular deformability or stiffness and the ability of the cells to contract and generate force. Here we describe a quick and simple method to estimate cell stiffness by measuring the degree of membrane deformation in response to negative pressure applied by a glass micropipette to the cell surface, a technique that is called Micropipette Aspiration or Microaspiration.
Microaspiration is performed by pulling a glass capillary to create a micropipette with a very small tip (2-50 &mu;m diameter depending on the size of a cell or a tissue sample), which is then connected to a pneumatic pressure transducer and brought to a close vicinity of a cell under a microscope. When the tip of the pipette touches a cell, a step of negative pressure is applied to the pipette by the pneumatic pressure transducer generating well-defined pressure on the cell membrane. In response to pressure, the membrane is aspirated into the pipette and progressive membrane deformation or "membrane projection" into the pipette is measured as a function of time. The basic principle of this experimental approach is that the degree of membrane deformation in response to a defined mechanical force is a function of membrane stiffness. The stiffer the membrane is, the slower the rate of membrane deformation and the shorter the steady-state aspiration length.The technique can be performed on isolated cells, both in suspension and substrate-attached, large organelles, and liposomes.
Analysis is performed by comparing maximal membrane deformations achieved under a given pressure for different cell populations or experimental conditions. A "stiffness coefficient" is estimated by plotting the aspirated length of membrane deformation as a function of the applied pressure. Furthermore, the data can be further analyzed to estimate the Young's modulus of the cells (E), the most common parameter to characterize stiffness of materials. It is important to note that plasma membranes of eukaryotic cells can be viewed as a bi-component system where membrane lipid bilayer is underlied by the sub-membrane cytoskeleton and that it is the cytoskeleton that constitutes the mechanical scaffold of the membrane and dominates the deformability of the cellular envelope. This approach, therefore, allows probing the biomechanical properties of the sub-membrane cytoskeleton.

Here we describe a quick and simple method to measure cell stiffness. The general principle of this approach is to measure membrane deformation in response to well-defined negative pressure applied through a micropipette to the cell surface. This method provides a powerful tool to study biomechanical properties of substrate-attached cells.

Aspiração micropipeta de Células-substrato anexados para Estimar Rigidez celular

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Criando Gradientes adesivas e solúvel para a migração celular Imaging com Microscopia de Fluorescência

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an area of productive research with over 1,400 published animal studies in just the last 5 years. Numerous techniques have been developed for quantifying smooth muscle activity of the stomach, small intestine, and colon. In vitro and ex vivo techniques offer powerful tools for mechanistic studies of GI function, but outside the context of the integrated systems inherent to an intact organism. Typically, measuring in vivo smooth muscle contractions of the stomach has involved an anesthetized preparation coupled with the introduction of a surgically placed pressure sensor, a static pressure load such as a mildly inflated balloon or by distending the stomach with fluid under barostatically-controlled feedback. Yet many of these approaches present unique disadvantages regarding both the interpretation of results as well as applicability for in vivo use in conscious experimental animal models. The use of dual element strain gages that have been affixed to the serosal surface of the GI tract has offered numerous experimental advantages, which may continue to outweigh the disadvantages. Since these gages are not commercially available, this video presentation provides a detailed, step-by-step guide to the fabrication of the current design of these gages. The strain gage described in this protocol is a design for recording gastric motility in rats. This design has been modified for recording smooth muscle activity along the entire GI tract and requires only subtle variation in the overall fabrication. Representative data from the entire GI tract are included as well as discussion of analysis methods, data interpretation and presentation.

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

The in vivo measurement of smooth muscle contractions along the gastrointestinal tract of laboratory animals remains a powerful, though underutilized, technique. Flexible, dual element strain gages are not commercially available and require fabrication. This protocol describes the construction of reliable, inexpensive strain gages for acute or chronic implantation in rodents.

Fabricação e Implantação de miniatura de elemento duplo Medidores de tensão para medição<em&gt; In Vivo</em&gt; Gastrointestinal Contrações em roedores.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Usando Adhesive Padronização Construir 3D de papel microfluídicos

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing the complicated multi-bracket appliances to a simple two-bracket system for the purpose of force system evaluation will be the first step in this direction. However, much of the orthodontic biomechanics in this regard is confined to 2D experimental studies, computer modeling/analysis or theoretical extrapolation of existing models. The objective of this protocol is to design, construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the forces and moments generated by an archwire with a V-bend placed between two brackets. Additional objectives are to compare the force system generated by different types of archwires among themselves and to previous models. For this purpose, a 2 x 4 appliance representing a molar and an incisor has been simulated. An orthodontic wire tester (OWT) is constructed consisting of two multi-axis force transducers or load cells (nanosensors) to which the orthodontic brackets are attached. The load cells are capable of measuring the force system in all the three planes of space. Two types of archwires, stainless-steel and beta-titanium of three different sizes (0.016 x 0.022 inch, 0.017 x 0.025 inch and 0.019 x 0.025 inch), are tested. Each wire receives a single vertical V-bend systematically placed at a specific position with a predefined angle. Similar V-bends are replicated on different archwires at 11 different locations between the molar and incisor attachments. This is the first time an attempt has been made in vitro to simulate an orthodontic appliance utilizing V-bends on different archwires.

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

The method presented here is designed to construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the force system generated by different archwires with V-bends placed between two brackets. Additional objectives are to compare this force system with different types of archwires and to previous models.

Forçar o sistema com V-curvas verticais: uma avaliação 3D In Vitro de arcos retangulares elásticas e rígidas

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing ...

Rat Model of Adhesive Capsulitis of the Shoulder

This proposal aims to create an in vivo rat model of adhesive capsulitis for researching potential treatment options for this condition and other etiologies of comparable arthrofibrosis. The model includes extra-articular fixation of the shoulder in rats via scapular to humeral suturing, resulting in a secondary contracture without invading the intra-articular space and resulting in decreased rotational ROM and increased joint stiffness.
We used 10 Sprague-Dawley rats for the purpose of this study. Baseline ROM measurements were taken before glenohumeral immobilization. The rats were subjected to 8 weeks of immobilization before the fixation sutures were removed and changes in ROM and joint stiffness were evaluated. To evaluate whether immobilization resulted in a significant reduction in ROM, changes in kinematics were calculated. ROM was measured at each time point in the follow-up period and was compared to the baseline internal and external ROM measurements. In order to evaluate the stiffness, joint kinetics were calculated by determining the differences in torque (text and tint ) needed to reach the initial external rotation of 60&#176; and initial internal rotation of 80&#176;.
After the removal of the extra-articular suture fixation on follow-up day 0, we found a 63% decrease in total ROM compared to baseline. We observed continuous improvement until week 5 of follow-up, with the progress slowing down around a 19% restriction. On week 8 of follow-up, there was still an 18% restriction of ROM. Additionally, on follow-up day 0, we found the torque increased by 13.3 Nmm when compared to baseline. On week 8, the total torque was measured to be 1.4 &#177; 0.2 Nmm higher than initial measurements. This work introduces a rat model of shoulder adhesive capsulitis with lasting reduced ROM and increased stiffness.

This protocol presents an in vivo rat model of adhesive capsulitis. The model includes an internal fixation of the glenohumeral joint with extra-articular suture fixation for an extended time, resulting in a decreased rotational range of motion (ROM) and increased joint stiffness.

Modelo do rato de capsulite adesiva do ombro

This proposal aims to create an in vivo rat model of adhesive capsulitis for researching potential treatment options for this condition and other ...

Increasing Durability of Dissociated Neural Cell Cultures Using Biologically Active Coralline Matrix

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high cell isolation and a controlled environment. However, the survival of hippocampal cells in vitro is compromised: most cells die during the first week of culture. It is therefore of great importance to identify ways to increase the durability of neural cells in culture.
Calcium carbonate in the form of crystalline aragonite derived from the skeleton of corals can be used as a superior, active matrix for neural cultures. By nurturing, protecting, and activating glial cells, the coral skeleton enhances the survival and growth of these cells in vitro better than other matrices.
This protocol describes a method for cultivating hippocampal cells on a coralline matrix. This matrix is generated by attaching grains of coral skeletons to culture dishes, flasks, and glass coverslips. The grains assist in improving the environment of the cells by introducing them to a fine three-dimensional (3D) environment to grow on and to form tissue-like structures. The 3D environment introduced by the coral skeleton can be optimized for the cells by grinding, which enables control over the size and density of the grains (i.e., the matrix roughness), a property that has been found to influence glial cells activity. Moreover, the use of grains makes the observation and analysis of the cultures easier, especially when using light microscopy. Hence, the protocol includes procedures for generation and optimization of the coralline matrix as a tool to improve the maintenance and functionality of neural cells in vitro.

Dissociated hippocampal cell culture is a pivotal experimental tool in neuroscience. Neural cell survival and function in culture is enhanced when coralline skeletons are used as matrices, due to their neuroprotective and neuromodulative roles. Hence, neural cells grown on coralline matrix show higher durability, and thereby are more adequate for culturing.

Aumentando a Durabilidade de Culturas de Células Neurais Dissociadas Usando Matriz Coralina Biologicamente Ativa

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high ...

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

Análise espacial bidimensional automatizada de sondas FRET de molécula única móvel

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many biological and biomedical applications. However, long-term time-lapse SRS imaging of live cells has not been widely adopted. SRS microscopy often uses a high numerical aperture (NA) water-immersion objective and a high NA oil-immersion condenser to achieve high-resolution imaging. In this case, the gap between the objective and the condenser is only a few millimeters. Therefore, most commercial stage-top environmental chambers cannot be used for SRS imaging because of their large thickness with a rigid glass cover. This paper describes the design and fabrication of a flexible chamber that can be used for time-lapse live-cell imaging with transmitted SRS signal detection on an upright microscope frame. The flexibility of the chamber is achieved by using a soft material - a thin natural rubber film. The new enclosure and chamber design can be easily added to an existing SRS imaging setup. The testing and preliminary results demonstrate that the flexible chamber system enables stable, long-term, time-lapse SRS imaging of live cells, which can be used for various bioimaging applications in the future.

We report a stage-top, flexible environmental chamber for time-lapse imaging of live cells using upright stimulated Raman scattering microscopy with transmitted signal detection. Lipid droplets were imaged in SKOV3 cells treated with oleic acid for up to 24 h with a 3 min time interval.

Uma câmara flexível para imagens de células vivas com lapso de tempo com microscopia de espalhamento Raman estimulada

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...