Marie Curie Fellowship International Outgoing (acordos da União Europeia FP/2007-2013 Grant # 221834 e 254780), JD McDonnell Foundation, NSF Grant SBE 0542013, National Institutes of Health Grant NS034994, National Institute of Mental Health Grant MH5467 e do Howard Hughes Medical Institute (Janelia Research Farm Campus de subvenção).

1. Construção do microdrive Todas as unidades são feitos dos mesmos elementos básicos: uma parte móvel, que leva o eletrodo e uma parte fixa, que está ancorado ao crânio. Um microdrive ideal permite lisa mas longo de viagem suficiente do eléctrodo em múltiplos pequenos passos, é suficientemente robusta para impedir o movimento acidental do eléctrodo, fácil de manipular pelo experimentador, sem interferir com o comportamento do animal, de tamanho pequeno e um peso leve. Como um resultado destes requisitos concorrentes, Suite unidades diferentes aplicações diferentes. Apenas 4 peças são necessárias para construir a nossa unidade básica: a de bronze parafuso de cabeça plana, uma porca de correspondência, uma ponte de plástico preparado a partir de um único cabeçalho linha pinos e duas placas de corte de metal personalizado. <ol><li> Quebre um pedaço de 3 pinos do cabeçalho </li><li> Puxe o pino do meio. </li><li> Ampliar o buraco perfurando-o com um tamanho de broca # 55. </li><li> Corte um dialer usando a torneira 00-90. </li><li> Corte dois pedaços da placa de bronze. </li><li> Arquivar os bordos das placas com uma dremmel. </li><li> Perfurar um furo no meio de ambas as peças, utilizando um tamanho de broca # 65. </li><li> Monte as peças de unidade, para que as placas de latão estão tocando os pinos. Para conseguir isso, inserir o parafuso de bronze através, sucessivamente, a placa de latão, o furo roscado cabeçalho pino, a placa de latão segundo, ea porca. Aperte o parafuso com cuidado para que o conjunto se torna estável. </li><li> O pino de solda termina às placas de latão. </li><li> Ficheiro a extremidade saliente do parafuso. </li><li> Solda a porca para o parafuso. Tenha cuidado para não soldar a porca para a placa de bronze. </li><li> Testar o movimento da unidade: girar o parafuso dos ponteiros do relógio para elevar a ponte de plástico. </li></ol> 2. Preparação da sonda de silício Antes de fixar a sonda para a unidade, adicionar isolamento extra para a área de ligação da sonda para evitar cerebrospinal fluido (CSF) ou umidade de produzir curto-circuitos: <ol><li> Pesar e misturar os componentes elastoméricos Sylgard numa proporção de 10:1. </li><li> Usando um aplicador de algodão afiada, aplicar o Sylgard até a extremidade superior da sonda. </li><li> Deixar secar num forno pré-aquecido a 60 ° C durante 2 horas. </li></ol> Para garantir que os locais de gravação são desprovidos de quaisquer detritos, as pontas de prova necessitam de ser limpos: <ol start="4"><li> Prepara-se uma diluição de 4% de detergente Contrad. </li><li> Deixe a sonda embeber no detergente a 63 ° C durante pelo menos 2 horas. </li><li> Lavar o detergente fora por meio de imersão a sonda repetidamente em água destilada. </li></ol> Antes de fixar a sonda para a unidade, a impedância de cada local de gravação devem ser verificados: <ol start="7"><li> Mergulhe a sonda em solução salina 0,9%, e conectá-lo a uma impedância metros. Se os sites de gravação muitos têm impedância incorreta, repita os passos de 2,4-2,6 ou considere o uso de uma sonda diferente.Aqui usamos um módulo de condicionamento de Impedância de Frederick Haer, Co. (FHC), combinado com um seletor de canais caseiro. Alternativamente, um niPOD por NeuroNexus, Inc. ou NanoZ por Neuralynx, Inc. permite a monitorização da impedância de todos os canais sonda simultaneamente. </li></ol> 3. Aposição da sonda para o microdrive <ol><li> Usando uma lâmina de barbear, cortar sulcos múltiplas na ponte para criar uma superfície áspera. </li><li> Appose a sonda para a ponte da unidade. Este procedimento é melhor realizada sob um microscópio de operação, mantendo a unidade com uma pinça e ajustando a sonda por um micromanipulador de modo que as hastes são perfeitamente paralelo com o parafuso de accionamento. Isso garante que durante o avanço, a sonda movimento hastes no tecido do cérebro sem &quot;cortar&quot; por ele. A profundidade exacta das pontas de sonda em relação à base de a unidade deve ser determinada nesta fase, tendo em consideração a profundidade da estrutura de destino a partir da superfície docrânio. </li><li> A sonda é então fixado à ponte com cimento aderência. </li><li> Opcional: para a visualização da faixa sonda no cérebro, DiI solução (1-2% diluído em etanol) pode ser aplicado à parte de trás da sonda nesta fase. </li></ol> 4. Preparando o crânio Antes da cirurgia, os eletrodos de referência e terra, e as partes da gaiola de Faraday head-on são preparados: <ol><li> Corte dois pedaços 2 &quot;de comprimento de fio de cobre, e terminar uma solda de cada fio de cobre isolado por cerca de 1 mm. </li><li> Utilizando uma agulha, raspar a cabeça de um 00-90, 1/8 &quot;parafuso de aço inoxidável e solda um pedaço de fio de cobre a ele. Solda tais aço inoxidável de terra de parafuso-eléctrodos requer um fluxo adequado (por exemplo, N-3 Todas as finalidades fluxo de La-Co) e elevadas temperaturas ponta de solda. cuidadosamente evitar qualquer solda de fluir para dentro da ranhura do parafuso. Isto irá ser utilizado como o eléctrodo de terra. Repita com outro parafuso e um fio de cobre para prepararo eletrodo de referência. </li><li> Corte pedaços trapeziodal de malha de cobre. Estas peças serão montados para proteger o headstage. </li></ol> Os instrumentos cirúrgicos e preparação são o mesmo que o utilizado em muitas cirurgias de pequenos animais. Toda a cirurgia é feita sob anestesia isoflurano profunda, usando condições assépticas, de acordo com as diretrizes do NIH aprovados. Por favor, note que a cirurgia (falso) mostrado neste vídeo é apenas para demonstração. Para fins apropriados visibilidade e filmagem, várias etapas preparatórias, precauções e procedimentos cirúrgicos de pós-operatório não são mostradas / visível ou discutido. Antes da cirurgia, todos os componentes e materiais devem ser esterilizados, seguindo procedimentos adequados (consulte Diretrizes para Cirurgia Rodent sobrevivência; http://oacu.od.nih.gov/ARAC/surguide.pdf~~HEAD=NNS). Durante a cirurgia, um campo esterilizado no crânio é preparado e isolado por cortinas estéreis. No final da cirurgia, um antibiótico de largo espectro é umapplied localmente e um analgésico de longa acção é administrado por via intramuscular (por exemplo, a buprenorfina, [Buprenex] 0,05 mg / kg). Além disso, analgésico (por exemplo, ibuprofeno) é fornecido na água de beber em cerca de 60 mg/kg/24 h durante 5 dias. Para próprios procedimentos cirúrgicos e de anestesia, consultar fontes adequadas 12. <ol start="4"><li> Instale o animal no aparelho estereotáxico, fazer a barba e limpar o couro cabeludo 13. </li><li> Corte a pele ao longo da linha média e afastar o couro cabeludo. Retire o periósteo, limpar e secar o crânio. </li><li> Medir a localização ea distância entre bregma e lambda, e determinar as coordenadas x e y do local de implantação da sonda de acordo com um atlas estereotáxico 14. Marcar o local raspando uma cruz no crânio com um bisturi. </li><li> Perfurar o crânio com uma broca de cabeça redonda (tamanho ¼) e parafusos de apoio da unidade (de aço inoxidável, 000-120, 1/16 &quot;) na metade do osso, em diferentes placas ósseas na parte superior umnd no lado do crânio. Os parafusos irá fornecer âncoras com segurança vínculo chapelaria até o crânio. </li><li> Faça furos acima do cerebelo e inserir no chão e eletrodos de referência preparada no passo 4.2. Para a gravação locais potenciais de campo (LFP), a escolha do local de referência é crítica. Este site é escolhido porque LFP cerebelar é a menor de todas as regiões corticais e artefatos musculares são mínimas neste local na linha média. </li><li> Aplicar dentina activador (Metabond kit) usando uma escova pequena sobre toda a superfície do crânio. Lavar com soro fisiológico a 0,9%. </li><li> Aplique o cimento dental (Metabond kit; siga as instruções do fabricante para a mistura) no crânio, cobrindo cuidadosamente os parafusos de fixação e de terra e eletrodos de referência, mas deixando o local de implantação da sonda claro. </li><li> Garantir as abas de cobre quatro malhas (preparado na Fase 4.3) para o crânio. Para isso, cimentar a estreita base de cada um deles para as anteriores, lados esquerdo, direito, e posterior do crânio. Thcobre e nunca deve estar em contacto directo com o osso, mas sempre separados por uma camada de cimento. </li></ol> 5. Preparação da superfície do cérebro <ol><li> Usando um pouco de cabeça redonda broca, perfure ao redor do local de implantação em múltiplos estágios, enquanto frequentemente o osso irrigando com soro fisiológico. </li><li> Retire cuidadosamente o retalho ósseo e irrigar a superfície do cérebro. </li><li> Para a inserção de uma sonda de haste múltipla, uma tira larga de dura é removido. Duas ferramentas são necessários para remover a dura-máter: um bisturi e um gancho preparado a partir de uma agulha de insectos (alternativamente, um microeléctrodo de tungsténio padrão). Dobre a ponta da agulha empurrando contra uma superfície dura (lâmina de microscópio por exemplo, vidro), e anexá-lo a uma alça (aqui, um pedaço de madeira Q-tip, alternativamente, um porta-agulha microdissecting). </li><li> Levante a dura com o gancho, e cortá-lo com um bisturi. Cuidado especial é tomado para evitar danificar o pia, os vasos ea superfície do neocórtex. Pequeno sangramento pode ser resolvidopor irrigação salina. Se o sangramento ocorre maior ou o neocórtex é comprometida de qualquer forma, deve-se considerar terminar a cirurgia e preparando outro animal. </li></ol> 6. Implantar a sonda Nesta fase, a densidade ea orientação dos vasos superfície cortical são cuidadosamente avaliada. Coordenadas estereotáxicas deve ser ajustada, porque a sonda tem de penetrar no cérebro em uma área livre de vasos maiores. Para a implantação, a montagem da unidade pode ser realizada com um jacaré ligada ao titular estereotáxica. Visibilidade ininterrupta da superfície do cérebro e as pontas de sonda são críticos para a penetração de sucesso. <ol><li> Lentamente inferior a sonda para baixo a cerca de 1 mm acima do alvo pretendido, enquanto constantemente irrigando a craniotomia com solução salina. Para gravação neocortical, as pontas de prova são reduzidos para o córtex de aproximadamente 0,5 mm e levantada para trás perto da superfície. </li&gt; <li> Selar a craniotomia pela aplicação de uma mistura quente fundida de óleo de cera de parafina e através de uma agulha (10-20g de cera em óleo de parafina 10 mL, aquecida a 65 ° C). Antes da aplicação, arrefecer a mistura para 30 ° C e testar a densidade. Ele deve ser suave o suficiente para permitir o movimento da sonda fácil). Para facilitar a cobertura completa, a mistura pode ser derretido in situ por se aproximar a cera endurecido com a ponta de uma micro-cauterizer. </li><li> Fixe a parte inferior da unidade para o crânio com cimento aperto, tendo o cuidado de deixar a porca livre para girar. É de extrema importância para evitar qualquer &quot;colisão&quot; acidental da unidade, nesta fase, caso contrário, a sonda irá danificar o córtex. Depois que a unidade é fixada ao crânio, o movimento suave da sonda deve ser verificada. </li><li> Cimentar a parte do conector da sonda ao crânio. </li></ol> 7. Construindo o cabeça-de gaiola de Faraday <ol><li> Puxe para cima e montar os retalhos de malha de cobre em um cilindro de proteção em torno da sonda e drive. O cilindro também serve como um escudo elétrico contra o ruído ambiente e os artefatos de ondas lentas produzidas pelos bigodes carregadas em que o animal se comportar. </li><li> Ajustar a altura do cilindro cortando-se o excesso de material de modo a malha de cobre está nivelada com a parte superior do conector da sonda. </li><li> Soldar os fios a partir da referência de terra e os parafusos aos pinos apropriados do conector. Também solda retalhos de malha de cobre adjacentes em conjunto para garantir a sua continuidade elétrica e solda o fio terra para a malha de cobre. </li><li> Aplicar uma camada de cimento aderência à malha de cobre de o reforçar e para evitar qualquer contacto directo entre o metal ea pele do animal. Opcionalmente, aplicar uma camada de resina epóxi para reforçar ainda mais o arnês. </li><li> Testar o movimento do parafuso de accionamento. </li><li> Cobrir o topo do arnês com um corte peça a partir de uma luva de borracha. </li></ol> 8. Gravação no animal movimentando-se livremente <ol><li> Depois de aprocomeu cuidados pós-operatórios, conectar o animal ao sistema de gravação usando um headstage alta impedância e um leve, ultraflexible cabo multi-strand. Contrabalançar o peso do capacete. </li><li> Teste a qualidade de gravação de cada dia na homecage. A posição dos sítios de gravação é julgado por ambos os padrões de unidade de queima ea forma dos locais potenciais de campo. Diminuir gradualmente a sonda, rodando o parafuso por pequenos incrementos (tipicamente 1/8 a 1/4 de volta por dia, isto é, 35-70 micrómetros) até que a estrutura alvo é atingido. </li></ol> 9. Os resultados representativos Sinais electrofisiológicos (potencial de campo local e actividade da unidade) variam dependendo da estrutura gravada eo comportamento actual do animal. A Figura 1 mostra exemplos de gravações CA1 do hipocampo de 32 canais, enquanto o rato está explorando um campo aberto. Observe o proeminente 8 Hz oscilação (theta banda) do potencial de campo local durante a exploração, com apoioerimposed spiking em hastes múltiplas e Sítios (exemplos de pontos indicados por setas). Para analisar a atividade neuronal unidade, os picos são detectados e classificados em unidades individuais, utilizando análise de cluster da sua onda 15-16. <img src="/files/ftp_upload/3568/3568fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. CA1 do hipocampo gravações no rato comportando usando um 4 hastes x 8 sítios de sonda de silício. As gravações são de banda larga e amostrados a 20 000 Hz, o que permite estudar as duas oscilações de campo locais potenciais (por exemplo, &quot;teta&quot; banda 8 ritmo Hz) e atividade spiking neuronal. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3568/3568table1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3568/3568table1.jpg" alt="Tabela 1" /></a> Tabela 1. Alternativas para reagentes e equipamento utilizados.

<ol>
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Não há conflitos de interesse declarados.

Este filme ilustra o procedimento de implante de silicone de sondas para doenças crônicas de larga escala gravações no rato comportar. Passos essenciais para garantir qualidade gravações de atividade neuronal surgem a partir da fragilidade de ambos biológico (tecido cerebral) e silício (sonda) técnicas de materiais. Cuidados especiais devem ser tomados ao manusear a sonda para evitar qualquer contato de hastes com qualquer superfície remotamente &quot;hard&quot; (por exemplo, as canelas iria quebrar se alguém...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Tipo </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Silicon sonda Buzsaki32, 4 hastes x 8 sites. Embalagem: cabo de poliamida flexível </td><td> Material </td><td> NeuroNexus </td><td> Probe: buzsaki32 Embalagem: HC32 </td><td> Sonda de gravação </td></tr><tr><td> Parafuso de latão redondo, 00-90 x 1/2 Round parafusos de latão </td><td> Material </td><td> Jimorris </td><td> R0090B500 </td><td> Parte da unidade </td></tr><tr><td> Porca de bronze Hex, 00-90 </td><td> Material </td><td> Jimorris </td><td> N0090B </td><td> Parte da unidade </td></tr><tr><td> Latão C260 Strip, ASTM-B36 Espessura: de 0,025 &quot;, Comprimento: 12&quot;, Largura: 1/2 &quot; </td><td> Material </td><td> Peças pequenas </td><td> B000FMYU72 </td><td> Parte da unidade </td></tr><tr><td> Conector Header, campo de 2mm, male, única linha, straigt, 36 posições </td><td> Material </td><td> Digikey </td><td> 2163S-36-ND </td><td> Parte da unidade </td></tr><tr><td> 2 partes de elastômero de silicone Sylgard </td><td> Material </td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> SYLG184 </td><td> Para extra-isolar a sonda </td></tr><tr><td> Decon Contrad 70 Liquid Detergent </td><td> Reagente </td><td> Fisher Scientific </td><td> 04-355 Decon Laboratories N º: 1002 </td><td> Para limpar os locais de gravação </td></tr><tr><td> Módulo condicionado Impedância </td><td> Equipamento </td><td> FHC Inc. </td><td> 55-70-0 </td><td> Medidor de impedância </td></tr><tr><td> niPOD - 32 canais </td><td> Equipamento </td><td> NeuroNexus </td><td> niPOD -32 </td><td> Medidor de impedância </td></tr><tr><td> Punho de cimento classe industrial </td><td> Material </td><td> Caulk Dentsply </td><td> 675.571 (pó) 675572 (solvente) </td><td> Punho cemento </td></tr><tr><td> 1,1 &#39;-dioctadecil-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perclorato (&#39;DiI&#39;; DiIC18 (3)) </td><td> Reagente </td><td> Invitrogen </td><td> D282 </td><td> Para corar a faixa sonda no cérebro </td></tr><tr><td> Parafuso de aço inoxidável, cabeça redonda, Drive fenda, # 00-90, 1/8 &quot; </td><td> Material </td><td> Peças pequenas </td><td> MX-0090-02B </td><td> Chão e parafusos de referência </td></tr><tr><td> Fio magnético, 20G, revestimento de nylon poliuretano, MW80 </td><td> Material </td><td> Peças pequenas </td><td> B000IJYRP2 </td><td> Terra e fio de referência </td></tr><tr><td> Parafuso de aço inoxidável, de cabeça redonda com fenda Drive, # 000-120, 1/16 &quot; </td><td> Material </td><td> Peças pequenas </td><td> MX-000120-01B </td><td> Parafusos de ancoragem </td></tr><tr><td> N-3 todo o líquido Flux finalidade </td><td> Reagente </td><td> La-Co (Markal) </td><td> 23512 </td><td> Permite a solda de aço inoxidável </td></tr><tr><td> Microgrid Precision Expandido cobre </td><td> Material </td><td> Dexmet </td><td> 3 CU6-050 FA </td><td> Malha de cobre para a cabeça de gaiola de Faraday </td></tr><tr><td> C &amp; B-METABOND Rápida! Cimento System - Dentina Activator </td><td> Material </td><td> Parkell </td><td> S380 </td><td></td></tr><tr><td> C &amp; B-METABOND Rápida! Sistema de Cimento - o cimento dental </td><td> Material </td><td> Parkell </td><td> S380 </td><td></td></tr><tr><td> Agulha de tungstênio afiada ponto e titular </td><td> Ferramenta </td><td> Instrumentos cirúrgicos Roboz </td><td> RS-6064 e RS-6061 </td><td> Para fazer com que o gancho para levantar a dura-máter </td></tr><tr><td> Carbide Bur HP 1/4 </td><td> Ferramenta </td><td> Henry Schein </td><td> 9990013 </td><td></td></tr><tr><td> Parafina (grânulos) </td><td> Material </td><td> Fisher Scientific </td><td> P31-500 </td><td></td></tr><tr><td> Óleo Mineral, Light (NF / FCC) </td><td> Material </td><td> Fisher Scientific </td><td> O121-1 </td><td></td></tr><tr><td> GC ELECTRONICS 10-114 adesivo epóxi 2-Part </td><td> Material </td><td> Newark </td><td> 00Z416 </td><td></td></tr><tr><td> Tipo 1 Litz 21 AWG 40/36 Red Único de poliuretano Nylon-(MW80-C) para 0,041 &quot;+ / -0,002&quot; OD </td><td> Material </td><td> New England Fio Technologies Corporation </td><td> N28-36E-400-2 </td><td> Para fazer com que o cabo entre a headstage eo amplificador </td></tr><tr><td> 32-canal headstage Integração Very Large Scale, ganho de 20x </td><td> Equipamento </td><td> Plexon </td><td> HST/32V-G20 </td><td> Headstage </td></tr></tbody></table>

large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents

Um dos grandes desafios da neurociência está ligando para o comportamento da atividade coletiva de montagens neurais. Entendimento de input-output relações de neurônios e circuitos requer métodos com a seletividade espacial e resolução temporal adequada para a análise mecanicista de conjuntos neurais em que o animal se comportar, ou seja, gravação de amostras representativas de grandes isolados neurônios individuais. Monitoramento conjunto da atividade neuronal tem progredido significativamente na última década em animais pequenos e grandes cérebros, incluindo seres humanos 1-11. De vários sites de gravação com dispositivos baseados em silício são particularmente eficazes graças à sua escalabilidade, volume pequeno e desenho geométrico. Aqui, descrevemos métodos para gravar vários neurônios individuais e potenciais de campo locais em comportar-se de roedores, usando comercialmente disponíveis sondas micro-usinados de silicone com componentes feitos sob encomenda de acessórios. Existem duas opções de base fou interface sondas de silício para pré-amplificadores: placas de circuito impresso e cabos flexíveis. Empresas Sonda Abastecimento ( <a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a> ; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a> ; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a> ) geralmente oferecem o serviço de ligação e entregar sondas ligados a placas de circuito impresso ou cabos flexíveis. Aqui, nós descrevemos a implantação de uma haste 4, sonda 32-site ligado ao cabo de poliimida flexível, e montado sobre um microdrive móvel. Cada passo da preparação da sonda, microdrive construção e cirurgia é ilustrado de modo a que o utilizador final pode replicar facilmente o processo.

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Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

Descrevemos os métodos de larga escala de gravação de várias unidades e potencial de campo local, comportando roedores com sondas de silício. Unidade de fabricação, o apego sonda para a unidade e os processos de implantação de teste são ilustrados em detalhes suficientes para a replicação fácil.

Em larga escala de gravação de Neurônios por sondas de silicone móveis em Comportando Roedores

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

large-scale-recording-neurons-movable-silicon-probes-behaving

Research

JoVE Journal

Neuroscience

34.5K visualizações.  University of New Jersey. Descrevemos os métodos de larga escala de gravação de várias unidades e potencial de campo local, comportando roedores com sondas de silício. Unidade de fabricação, o apego sonda para a unidade e os processos de implantação de teste são ilustrados em detalhes suficientes para a replicação fácil.

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Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

Gravação em grande escala Ensembles Neuronal com Sondas Silício na rato anestesiado

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Neurociência

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, including rats, hamsters, and mice, are active during the night and relatively inactive during the day. Many other behavioral and physiological measures also exhibit daily rhythms, but in rodents, running-wheel activity serves as a particularly reliable and convenient measure of the output of the master circadian clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. In general, through a process called entrainment, the daily pattern of running-wheel activity will naturally align with the environmental light-dark cycle (LD cycle; e.g. 12 hr-light:12 hr-dark). However circadian rhythms are endogenously generated patterns in behavior that exhibit a ~24 hr period, and persist in constant darkness. Thus, in the absence of an LD cycle, the recording and analysis of running-wheel activity can be used to determine the subjective time-of-day. Because these rhythms are directed by the circadian clock the subjective time-of-day is referred to as the circadian time (CT). In contrast, when an LD cycle is present, the time-of-day that is determined by the environmental LD cycle is called the zeitgeber time (ZT).
Although circadian rhythms in running-wheel activity are typically linked to the SCN clock6-8, circadian oscillators in many other regions of the brain and body9-14 could also be involved in the regulation of daily activity rhythms. For instance, daily rhythms in food-anticipatory activity do not require the SCN15,16 and instead, are correlated with changes in the activity of extra-SCN oscillators17-20. Thus, running-wheel activity recordings can provide important behavioral information not only about the output of the master SCN clock, but also on the activity of extra-SCN oscillators. Below we describe the equipment and methods used to record, analyze and display circadian locomotor activity rhythms in laboratory rodents.

Circadian rhythms in voluntary wheel-running activity in mammals are tightly coupled to the molecular oscillations of a master clock in the brain. As such, these daily rhythms in behavior can be used to study the influence of genetic, pharmacological, and environmental factors on the functioning of this circadian clock.

Registro e análise dos ritmos circadianos em Running rodas Atividade em Roedores

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the centrolateral/parafascicular; Cl/Pf nucleus). The activation of either the PPN or Cl/Pf nuclei in vivo has been described to induce the arousal of the animal and an increment in gamma band activity in the cortical electroencephalogram (EEG). The cellular mechanisms for the generation of gamma band oscillations in Reticular Activating System (RAS) neurons are the same as those found to generate gamma band oscillations in other brains nuclei. During current-clamp recordings of PPN neurons (from parasagittal slices from 9 - 25 day-old rats), the use of depolarizing square steps rapidly activated voltage-dependent potassium channels that prevented PPN neurons from being depolarized beyond -25 mV.
Injecting 1 - 2 sec long depolarizing current ramps gradually depolarized PPN membrane potential resting values towards 0 mV. However, injecting depolarizing square pulses generated gamma-band oscillations of membrane potential that showed to be smaller in amplitude compared to the oscillations generated by ramps. All experiments were performed in the presence of voltage-gated sodium channels and fast synaptic receptors blockers. It has been shown that the activation of high-threshold voltage-dependent calcium channels underlie gamma-band oscillatory activity in PPN neurons. Specific methodological and pharmacological interventions are described here, providing the necessary tools to induce and sustain PPN subthreshold gamma band oscillation in vitro.

The pedunculopontine nucleus (PPN) is located in the brainstem and its neurons are maximally activated during waking and rapid eye movement (REM) sleep brain states. This work describes the experimental approach to record in vitro gamma band subthreshold membrane oscillation in PPN neurons.

Gravação Gama Oscilações banda em pedunculopontino Núcleo Neurônios

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the ...

Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a comprehensive survey of the morphological characteristics observed among a selective neuronal population. Combination of these techniques constitutes a novel approach for the collection and analysis of neuroanatomical data. Together, these techniques enable large-scale, and therefore more comprehensive, sampling of selective neuronal populations and establish unbiased quantitative methods for describing morphologically unique neuronal classes within a population.
The protocol outlines the use of modified rabies virus to selectively label neurons. G-deleted rabies virus acts like a retrograde tracer following stereotaxic injection into a target brain structure of interest and serves as a vehicle for the delivery and expression of EGFP in neurons. Large numbers of neurons are infected using this technique and express GFP throughout their dendrites, producing &#34;Golgi-like&#34; complete fills of individual neurons. Accordingly, the virus-mediated retrograde tracing method improves upon traditional dye-based retrograde tracing techniques by producing complete intracellular fills.
Individual well-isolated neurons spanning all regions of the brain area under study are selected for reconstruction in order to obtain a representative sample of neurons. The protocol outlines procedures to reconstruct cell bodies and complete dendritic arborization patterns of labeled neurons spanning multiple tissue sections. Morphological data, including positions of each neuron within the brain structure, are extracted for further analysis. Standard programming functions were utilized to perform independent cluster analyses and cluster evaluations based on morphological metrics. To verify the utility of these analyses, statistical evaluation of a cluster analysis performed on 160 neurons reconstructed in the thalamic reticular nucleus of the thalamus (TRN) of the macaque monkey was made. Both the original cluster analysis and the statistical evaluations performed here indicate that TRN neurons are separated into three subpopulations, each with unique morphological characteristics.

This protocol describes large-scale reconstructions of selective neuronal populations, labeled following retrograde infection with a modified rabies virus expressing fluorescent markers, and independent, unbiased cluster analyses that enable comprehensive characterization of morphological metrics among distinct neuronal subclasses.

Reconstruções em larga escala e, Clustering imparcial independente baseado no morfológicas Métricas para classificar Neurônios no seletivos Populações

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced electrodes for large-scale electrophysiological recording of neuronal activity, but the procedures for their chronic implantation are still underdeveloped. The activity of hippocampal place cells is known to correlate with an animal&#39;s position in the environment, but the underlying mechanisms are still unclear. To investigate place cells, here we describe a set of techniques which range from the fabrication of devices for chronic silicon probe implants to the monitoring of place field activity in a cue-enriched treadmill apparatus. A micro-drive and a hat are built by fitting and fastening together 3D-printed plastic parts. A silicon probe is mounted on the micro-drive, cleaned, and coated with dye. A first surgery is performed to fix the hat on the skull of a mouse. Small landmarks are fabricated and attached to the belt of a treadmill. The mouse is trained to run head-fixed on the treadmill. A second surgery is performed to implant the silicon probe in the hippocampus, following which broadband electrophysiological signals are recorded. Finally, the silicon probe is recovered and cleaned for reuse. The analysis of place cell activity in the treadmill reveals a diversity of place field mechanisms, outlining the benefit of the approach.

We describe the diverse steps to implant chronic silicon probes and to record place cells in mice that are running head-fixed on a cue-enriched treadmill apparatus.

Implantação de sondas de silicone crônica e gravação de lugar Hippocampal células em um aparelho de esteira enriquecido

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Imagem de cálcio Ratiometric de neurônios individuais se comportando Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Construction of an Improved Multi-Tetrode Hyperdrive for Large-Scale Neural Recording in Behaving Rats

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems neuroscience. One key component of this technique consists of the precise placement of multiple electrodes into desired brain regions and the maintenance of their stability. Here, we describe a protocol for the construction of a 3D-printable hyperdrive, which includes eighteen independently adjustable tetrodes, and is specifically designed for in vivo extracellular neural recording in freely behaving rats. The tetrodes attached to the microdrives can either be individually advanced into multiple brain regions along the track, or can be used to place an array of electrodes into a smaller area. The multiple tetrodes allow for simultaneous examination of action potentials from dozens of individual neurons, as well as local field potentials from populations of neurons in the brain during active behavior. In addition, the design provides for simpler 3D drafting software that can easily be modified for differing experimental needs.

We present the construction of a 3D-printable hyperdrive with eighteen independently adjustable tetrodes. The hyperdrive is designed to record brain activity in freely behaving rats over a period of several weeks.

Construção de um Hyperdrive melhorado de multi Tetrode para gravação Neural em grande escala em comportar-se ratos

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

Preparações e protocolos para toda célula Patch Clamp gravação de neurônios Tectal Xenopus laevis

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...