Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Instituto Médico Howard Hughes e da National Science Foundation para RG, e os fundos atribuídos a SM pelos Institutos Nacionais de Saúde (Grant R01-HL98416) e da American Heart Association (Grant 09BGIA2450014).

1. Cultura de uma monocamada de células em inserções Transwell <ol><li> Em uma estéril, o nível de biossegurança 2 célula cultura capuz, coloque 0,8 milímetros de poros PET transwell inserções em uma placa de 24 poços (4 poços por condição, para significância estatística) com uma pinça. Todos os materiais que entram na capa deverá ser esterilizada com etanol. </li></ol> Nota: O tamanho do poro do filtro deve ser escolhido de acordo com o tamanho médio da NC usado, para permitir o transporte através da membrana. Além disso, para obter resultados estatisticamente significativos, cada condição experimental requer um mínimo de quatro repetições (poços) dentro da mesma experiência, e um mínimo de três experiências independentes. <ol start="2"><li> Preparar o meio de cultura de células contendo meio DMEM suplementado com 4,5 g / L de glicose, 15% de soro fetal bovino e 1% Pen Strep, e aquecer a 37 ° C em um banho de água. </li><li> Diluir adenocarcinoma colorretal epitelial humano (Caco-2) células em meio celular e lugar200-400 uL da solução das células na (apical) câmara da inserção transwell superior, a uma densidade de 1,5 x 10 5 células / cm 2. Encha a câmara inferior (basolateral) com 700-900 mL de meio de celular. </li><li> As células de cultura a 37 ° C, 5% de CO 2, e 95% de humidade durante 16-21 dias, substituindo o meio na câmara superior e inferior em cada 3-4 dias, utilizando os volumes indicados no passo 1.3. Substituir meio da seguinte forma a manter a pressão acima (em vez de seguir) a monocamada de células: aspirar o meio a partir da câmara inferior, aspirar o meio a partir da câmara superior, encher a câmara superior com meio fresco, e preencher a câmara inferior com meio fresco. </li></ol> 2. Validação do GI permeabilidade da barreira epitelial Usando resistência elétrica transepitelial (TEER) e imunocoloração de junções apertadas <ol><li> Para o armazenamento de curto prazo (menos de 2 semanas), submergir eletrodos STX100 em uma solução eletrolíticação (0,1-0,15 M KCl ou NaCl). Ligue o cabo do eléctrodo para o eléctrodo de porta no medidor EVOM volt-ohm, de modo que o sistema é internamente em curto-circuito e o eléctrodo é mantido simetria. Para o armazenamento a longo prazo, lavar com dH 2 O e armazenar em uma condição seca, escura. </li><li> Para esterilizar os eletrodos, imerso em etanol por 15 minutos e deixar secar ao ar por 15 s. Em alternativa, os eléctrodos podem ser armazenados em uma capa de UV. Lave os eletrodos em uma solução estéril eletrólito (solução salina tampão fosfato, PBS) ou 0,1-0,15 solução M KCl ou NaCl, antes de cada medição de resistência. </li><li> Com o medidor volt-ohm para definir a configuração da resistência, colocar verticalmente eléctrodos num poço contendo o inserto transwell, com o curto eléctrodo na câmara superior e a longo eléctrodo na câmara inferior de tocar no fundo do poço. Uma vez que a leitura EVOM estabiliza, registre o valor da resistência (dada em ohms; Ω) para cada poço. </li><li> Calcule resistividade (resisce normalizada para a área; Ω × cm 2) de amostras subtraindo resistência fundo (TEER de inserções transwell sem células) e multiplicando por área de superfície da membrana. Os valores da resistividade são mais frequentemente descritos na literatura. (Ver discussão) </li><li> Repetir a medição a cada 1-2 dias, até que os valores TEER origem a um patamar máximo e, indicando a formação de uma barreira de permeabilidade, o que normalmente demora de 2-3 semanas a partir do momento do plaqueamento das células. Valores e tempo necessário para atingir a integridade da barreira Planalto Teer pode variar de acordo com o número de passagens celular. </li><li> Para verificar a presença de junções apertadas em monocamadas de células com elevado TEER (igual ou superior ao valor limiar para a formação da barreira), fixar as células por incubação com frio de paraformaldeído a 2% durante 15 min. Em seguida, lavar as células com PBS e incubar durante 30 min à temperatura ambiente com 1 ug / mL de anti-occludin. Lavar as células novamente com PBS e incubar durante 30 min à temperatura ambiente com 7,5 ug / ml de fanticorpos secundários luorescently-rotulados. Use poços com baixo TEER como um controlo negativo para a formação da barreira. </li></ol> Observação: Como um substituto para o anti-ocludina, podem ser utilizados anticorpos para as proteínas de junção alternativos apertados. <ol start="7"><li> Extirpar cuidadosamente a membrana do filtro em que a monocamada fixo está ligado, e montar em lâminas para imagens utilizando epifluorescência ou microscopia confocal. </li></ol> 3. Avaliando Transepitelial transporte das companhias alvo <ol><li> Rotular o anticorpo (anticorpo monoclonal de rato contra ICAM-1, anti-ICAM, neste exemplo) a segmentação com 125 I, tal como descrito anteriormente 7. Use ensaio de Bradford para estimar a concentração de proteína e um contador gama para determinar o teor de 125I no anticorpo, em seguida, calcular a actividade específica, em contagens por minuto (CPM) / mg de anticorpo marcado. </li></ol> Nota: Para controlar a especificidade, reRepita o processo de etiquetagem por IgG do rato, que será utilizado para preparar CNs revestidos não-alvo. Para estudar o transporte de uma carga terapêutico, repetir o procedimento de etiquetagem de carga, por exemplo, alfa-galactosidase (α-Gal), neste exemplo. As alternativas podem ser utilizados para o agente de direccionamento, o controlo não específico, ou de carga terapêutico. Métodos alternativos podem também ser utilizados para marcar compostos e estimar a concentração dos homólogos marcados. <ol start="2"><li> Par o direccionamento do anticorpo marcado (anti-ICAM, no nosso exemplo) para a superfície de NCs. Neste exemplo, incubar nanobeads de poliestireno (diâmetro de 100 nm) durante 1 hora à temperatura ambiente com 125I-anti-ICAM para permitir a adsorção de superfície, como descrito 7. </li></ol> Nota: Para o controlo de não-específica utilizar 125I-IgG. Para rastrear o transporte de uma carga, use uma combinação de segmentação de anticorpos e 125 marcados com carga I (α-Gal no nosso exemplo). <ol start="3"><li> Centrifugar a 13.000 xg durante 3 min e remover os homólogos não-revestidos no sobrenadante por aspiração. Ressuspender o sedimento contendo CNs revestidos usando 1% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS por pipetagem, e sonicado de baixa potência para perturbar os agregados de partículas potenciais (20-30 breves pulsos). </li><li> Para caracterização, NC, medir o tamanho, polidispersidade e ζ potencial de partículas revestidas, utilizando dispersão de luz dinâmica (seguindo as instruções do fornecedor), e quantificar a quantidade de 125I-marcado alvo (por exemplo, moléculas de anticorpo anti-ICAM) na superfície da partícula usando um contador gama. </li></ol> Nota: Estes métodos podem ser repetidos para homólogos não-específicos e terapêuticos. O tamanho das partículas revestidas varia em torno de 200 nm. <ol start="5"><li> Adicionar 125 CNs I-anticorpo, (por exemplo, 125 I-anti-ICAM; NCs 56 nCi / ml) para a câmara superior por cima confluentes monocamadas Caco-2 com TEER &amp;# 8805; 350 Ω × cm 2 (ver discussão) sobre o fundo (16-21 dias pós-semeadura). Incubar a 37 ° C durante uma hora ou mais intervalos desejado. Meça TEER (Seção 2.3), antes e após a incubação para avaliar os efeitos de CNs na barreira de permeabilidade. </li></ol> Nota: Este procedimento pode ser repetido para homólogos não-específicos e terapêuticos. <ol start="6"><li> Recolha de meio, as câmaras superiores e inferiores e lavá-los uma vez com 0,5 ml de DMEM a 37 ° C (câmara superior) ou 1 ml de dH2O (câmara inferior). Recolher as lavagens para a medição do teor total de radioisótopo utilizando um contador gama. </li><li> Para a medição da fracção de células, excisar o filtro permeável, por exemplo, utilizando uma lâmina de barbear para cortar em torno das arestas, e incubam-se num contador gama com tubo de 1% de Triton X-100 durante 10 min (para libertar o conteúdo das células), antes de medir a célula -associado radioactividade total. </li><li> Para medir 125 I rearrendadas de CNs durante o transporte ou devido a potencial degradação, primeira mistura 300 mL de amostra (das fracções superiores, inferiores, ou celulares), com 700 mL de 3% BSA em PBS e 200 mL de ácido tricloroacético (TCA). Incubar à temperatura ambiente durante 15 min. Entretanto, este tempo, medir a radioactividade total da amostra em um contador gama. </li><li> Centrifugar as amostras TCA a 3000 xg durante 5 minutos para separar a proteína intacta (pelete) a partir da proteína degradada ou 125I fracção (sobrenadante). Quantificar a radioatividade da fração livre de 125 I e subtrair esse valor de radioatividade total medido antes da centrifugação. Isto irá fornecer a quantidade de proteína marcada que não se degrada. </li></ol> 4. Mecanismo de Transepitelial Transporte de nanocarriers alvejados <ol><li> Etiqueta albumina com 125 I, como descrito na Seção 3.1 e relatado anteriormente 7. </li></ol> Nota: A albumina é um 66.5kDa e, por conseguinte, uma parte relativamente grande da substância. Embora um controle válido para o transporte passivo de objetos maiores (por exemplo, 200 CNs nm usado aqui), ele deve ser substituído por moléculas menores traçadores inertes quando se estuda o transporte de portadores de drogas menores (ver Discussão). <ol start="2"><li> Para avaliar o transporte paracelular usando vazamento paracelular albumina, de cultura de monocamadas Caco-2 em inserções Transwell como descritos acima. </li><li> Para o meio de câmara superior por cima da monocamada de células, adicionar ou 125I-albumina (controlo negativo que mostra o nível basal de vazamento), ou 125 CNs alvo-anticorpo I-albumina e não-marcados (como descrito na Secção 3.5). Incubar a 37 ° C para o intervalo selecionado de tempo (s), que deve coincidir com os examinados ao testar transporte NC. Meça TEER (Seção 2.3), antes, durante e após a incubação, em seguida, recolher todas as frações para total de 125 I e gratuitos 125 medições I, conforme indicado. na Seção 3 Nota: adição concomitante de 125 de controlo I-albumina e não radiomarcado CNs IgG pode ser usado como um controlo. </li><li> Como um controlo positivo para a abertura de junções intercelulares, adicionar meio celular contendo 5 mM de H 2 O 2 para as câmaras superiores e inferiores da inserção transwell, e incubar a 37 ° C durante 30 min. Em seguida, meça TEER (Seção 2.3) e adicionar 125 I-albumina para a câmara superior para os intervalos de tempo selecionados. Medir TEER em vários pontos de tempo ao longo da incubação para identificar o valor TEER deterioração causada por H 2 O 2-induzida abertura das junções celulares. </li><li> Em experiências paralelas, avaliar o transporte transcelular, também chamado transcitose, de 125 CNs I-alvejados por incubação confluentes monocamadas Caco-2 com 50 uM monodansylcadaverine (MDC; inibidor de endocitose mediada por clatrina), 1 ug / ml Filipin (inibidor de caveolar endocitose mediada), Wortmann 0,5 fiMem (inibidor de fosfatidilinositol 3-quinase [PI3K], envolvido em macropinocitose), ou 20 pM [5 - (N-etil-N-isopropil) amilorida] (EIPA, inibidor da macropinocitose e mediada por CAM endocitose 15). </li></ol> Nota: 125I-IgG CNs e 125I-albumina podem ser utilizados como controlos negativos para o efeito destes inibidores, e outros métodos (por exemplo, técnicas de siRNA) pode proporcionar a inibição mais selectiva. <ol start="6"><li> Medir TEER (secção 2.3), antes, durante e após a incubação de células com inibidores e materiais radioativos, como um controlo adicional para o efeito dos inibidores sobre a permeabilidade monocamada. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Utilizando os métodos discutidos acima, um modelo celular para estudar o transporte de CNs orientadas através das barreiras celulares pode ser estabelecida, tal como o exemplo dado para Caco-2 de células epiteliais, o que é relevante para a avaliação do transporte a partir do lúmen GI para a corrente sanguínea, no caso dos sistemas de distribuição de drogas orais. A cultura de monocamadas de células epiteliais GI em inserções transwell medição de TEER e fluorescência imunocoloração de junções apertad...

Barreiras celulares no corpo agir como um gateway entre o ambiente externo e compartimentos internos. Este é o caso para o forro epitelial que separa a superfície exterior exposta do tracto gastrointestinal (GI) e pela corrente sanguínea 1-3. Barreiras celulares também representar a interface entre o sangue e o parênquima e os componentes celulares de tecidos e órgãos. Este é o caso para o interior do forro endotelial nos vasos sanguíneos, tais como a barreira sangue-pulmão, a barreira sangue-cérebro, etc 1 A capacidade de ultrapassar estas barreiras celulares no corpo é crucial para a entrega eficaz dos agentes terapêuticos e de diagnóstico para a circulação e tecidos / órgãos onde é necessária intervenção. Para melhorar a entrega de agentes terapêuticos ou de diagnóstico, estes compostos podem ser carregados em nanocarriers sub-micrométricas (CN). Estes veículos de entrega de droga pode ser formulado com uma variedade dequímicas e estruturas para otimizar a solubilidade de drogas, proteção, farmacocinética, liberação, metabolismo e 4,5. CNs também pode ser funcionalizada com afinidade ou porções de direccionamento (por exemplo, anticorpos, péptidos, aptâmeros, açúcares, etc), para facilitar a aderência às áreas do corpo em que é necessária a acção terapêutica 2,6. Segmentação de CNs para determinantes expressas na superfície de barreiras celulares podem facilitar ainda mais o transporte para dentro e / ou através destes forros 2,6. O papel do transporte seletivamente substâncias entre dois ambientes exige certas características únicas entre as camadas de células. Uma tal característica é a polaridade da célula, pelo que a membrana apical voltada para o lúmen das cavidades varia de membrana basolateral orientada para o interstício de tecidos, no que diz respeito à morfologia e composição de lípidos, transportadores e receptores de membrana 2. Outra característica envolve junctio intercelularns conectam células adjacentes. Regulamento das proteínas que formam junções apertadas, moléculas de adesão particularmente juncional (compotas), occludins e claudinas, modular a função de barreira para permitir seletivamente ou não transporte de substâncias entre as células, conhecidas como transporte paracelular, permitindo a passagem de materiais do lúmen para o espaço basolateral 3. A ligação de vários elementos naturais e sintéticos (leucócitos, moléculas, partículas e sistemas de entrega de drogas) para barreiras celulares no corpo pode induzir a abertura de alvéolos-junção, que podem ser transiente e relativamente inócuo ou mais prolongada e, portanto, com o acesso de inseguro substâncias indesejáveis ​​através da barreira 2,5,7-9. Por conseguinte, esta via pode ser avaliada pela medição da resistência eléctrica transepitelial (TEER) e difusão paracelular passiva de moléculas (aqui chamado vazamento paracelular), pelo que diminui a resistência à passagem da corrente eléctrica ou aumento de vazamento paracelular de um inert composto no espaço basolateral indicar abertura de junções intercelulares, respectivamente 5,10,11. Para complementar estes métodos, qualquer uma das proteínas de junção apertadas listados acima podem ser coradas para avaliar a sua integridade, em que a coloração deve aparecer concentrada nas fronteiras célula-célula toda à volta da periferia da célula 5,10,12. Alternativamente, os sistemas de entrega de drogas que têm como alvo os determinantes da superfície celular específicos, tais como aqueles associados a poços revestidos por clatrina ou invaginações da membrana em forma de balão chamados caveolae, pode provocar absorção vesicular nas células por endocitose, proporcionando uma via para a entrega de drogas para compartimentos intracelulares 5, 13. Além disso, a endocitose pode levar ao tráfico de vesículas em todo o corpo da célula para a liberação no lado basolateral, um fenômeno conhecido como transyctosis ou transporte transcelular 14. Portanto, o conhecimento da cinética e mecanismo de endocitose podem ser utilizadas para explorar um intracelularnd entrega da droga para o espaço intracelular, o que oferece um modo relativamente seguro e controlado de entrega em comparação com a via paracelular. (Endocitose como é o caso da molécula de adesão celular (CAM) mediada) O mecanismo de endocitose podem ser avaliadas com moduladores de vias clássica (clathrin e endocitose mediada por caveolina e macropinocitose) ou rotas não-clássicos 5,13,15 . Considerando que o tráfico intracelular é frequentemente estudados em poços de padrão ou lamelas, a ausência de um compartimento basolateral opõe polarização celular e a capacidade para estudar o transporte ao longo das camadas de células. Para superar esse obstáculo, o transporte através monocamadas de células tem sido estudada usando transwell insere 10,11,16,17, que consistem em uma câmara superior (apical), uma membrana permeável poroso onde as células unir e formar uma monocamada apertado, e um menor (basolateral) câmara (Figura 1). Nesta configuração, o transporte pode ser medido noapical-para-basolateral direcção através da administração de um tratamento para a câmara superior, na sequência de transporte, através da monocamada de células e membrana porosa subjacente, e por fim recolhendo o meio na câmara inferior de quantificação de material transportado. De transporte na direcção basolateral-para-apical, também pode ser medido por administração inicial para a câmara inferior e subsequente recolha da câmara superior 5,10,12,16. Existem várias técnicas para verificar a formação da barreira de permeabilidade em transwells, incluindo TEER e ensaios de transporte paracelular, como descrito acima. Além disso, o filtro permeável no qual as células são cultivadas, pode ser removida para análise de imagens (por exemplo, por fluorescência, confocal, microscopia electrónica), como uma validação adicional do modelo de monocamada de células, bem como o mecanismo de transporte. A selecção do tipo de membrana, que está disponível em diferentes tamanhos de poros, os materiais, e áreas de superfície, depende de vários factors como o tamanho de substâncias ou objetos a serem transportados, tipo de célula, e método de imagem 16,18-20. Transwell inserções também facilitar a quantificação controlada e precisa de transporte em comparação com sistemas de mamíferos complexos, como os volumes das câmaras e área de superfície celular são constantes conhecidas. Embora muitos fatores envolvidos na in vivo de entrega são eliminadas, incluindo a presença de muco intestinal, tensão de cisalhamento, enzimas digestivas, células do sistema imunológico, etc, esta pequena escala modelo in vitro fornece informações preliminares úteis sobre transporte. Como exemplo para ilustrar a adaptação destes métodos para estudar o transporte NC através das barreiras celulares 10,11,16,17, descrevemos aqui um caso em que o potencial de transporte NC através do epitélio GI foi modelada por avaliar passagem de um modelo de entrega de drogas sistema através de uma monocamada de adenocarcinoma colorrectal epitelial humano (Caco-2), as células. Para este fim, cvaras foram cultivados em inserções Transwell, numa poro de tereftalato 0,8 mM de polietileno (PET) de filtro (6,4 mm de diâmetro), que é transparente e pode ser usado para geração de imagens de microscopia. O estado da barreira de permeabilidade é validada medindo TEER, transporte apical-para-basolateral de uma substância de controlo, albumina, e a visualização de microscopia de fluorescência de um elemento das junções apertadas, ocludina proteína. Um modelo de polímero alvo NF é usado, consistindo de 100 nm, as nanopartículas de poliestireno não-biodegradáveis. CNs são revestidas por adsorção de superfície com um anticorpo alvo sozinho ou uma combinação de um anticorpo e uma carga alvo terapêutico, em que um ou outro componente pode ser marcado com 125I, para um rastreio de radioisótopos. No exemplo escolhido, o anticorpo reconhece molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1), uma proteína expressa sobre a superfície de GI epitelial (e outros), as células, que foram mostrados para facilitar o transporte intracelular e o espaço intracelular<html> transportadores de drogas e suas cargas de f 21. A carga é alfa-galactosidase (α-Gal), uma enzima terapêutica utilizada para o tratamento da doença de Fabry, uma doença de armazenamento lisossómico genético 22. Os CNs revestidos, de cerca de 200 nm de tamanho, são adicionados à câmara de apical sobre a monocamada celular e incubados a 37 ° C durante diferentes períodos de tempo, depois do que 125 I em CNs podem ser detectados associados à monocamada de células e / ou transportada para a câmara inferior basolateral das células. Determinação adicional de 125 I livre permite a subtração da fração degradada e estimativa de transporte NC revestido. O mecanismo de transporte é avaliada por meio de análise de alterações na permeabilidade da barreira pertencente à via paracelular, através dos parâmetros descritos acima, enquanto que o transporte transcelular é determinada por análise de alterações no transporte quando modulando vias de endocitose e transcitose. ONTEÚDO &quot;&gt; Esses métodos fornecem informações valiosas sobre os modelos de barreira celular, a extensão ea taxa de transporte de um sistema de entrega de drogas, eo mecanismo desse transporte, permitindo completamente avaliação do potencial de liberação de fármacos através das barreiras celulares.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Transwell inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), 1x</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-37TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125Iodine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ033H002MC</td>
			<td>Radioactive hazard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Equitech Bio</td>
			<td>BAH-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulin G (IgG)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>015-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)</td>
			<td>Marlin 1987</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Galactosidase, from green coffee beans</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8507-25UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC latex beads, 100 nm</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>17150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>234729-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA433-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-27151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monodansylcadaverine (MDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wortmannin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Wizard2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volt-ohm meter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEER electrodes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>STX100</td>
			<td>Electrodes available for different well-plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Light Scattering (DLS)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nano-ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers

Portadores Sub-micrométricas (nanocarriers; CN) aumentar a eficácia de medicamentos, melhorando a solubilidade, estabilidade, tempo de circulação, segmentação, e solte. Além disso, atravessar barreiras celulares no corpo é crucial tanto para a administração oral de CNs terapêuticos para a circulação e transporte a partir do sangue para os tecidos, onde é necessária a intervenção. NC transporte através de barreiras celulares é conseguido por: (i) a via paracelular, através de disrupção transitória das junções que interligam as células adjacentes, ou (ii) a via intracelular, onde os materiais são internalizados por endocitose, transportado através do corpo da célula e secretados na superfície da célula oposta (transyctosis). Entrega através de barreiras celulares pode ser facilitada pelo acoplamento terapêutica ou dos seus transportadores com agentes de direccionamento que se ligam especificamente a marcadores da superfície celular envolvidas no transporte. Aqui, nós fornecemos métodos para medir a extensão e mecanismo de transporte NC através de uma barreira celular modelo, which consiste em uma monocamada de gastrintestinal (GI), as células epiteliais cultivadas em uma membrana porosa localizada em um transwell insert. Formação de uma barreira de permeabilidade é confirmado pela medição da resistência transepitelial elétrica (TEER), o transporte transepitelial de uma substância de controle e imunomarcação de junções apertadas. Como um exemplo, 200 ~ CNs polímero nm são utilizados, que transportam uma carga terapêutico e são revestidos com um anticorpo que tem como alvo um determinante da superfície celular. O anticorpo ou carga terapêutico é marcado com 125I, para um rastreio de radioisótopos e CNs marcadas são adicionadas à câmara superior sobre a monocamada de células durante períodos de tempo variáveis. CNs associados para as células e / ou transportadas para a câmara subjacente pode ser detectada. Medição de livre 125 I permite a subtração da fração degradada. A via paracelular é avaliada determinando mudanças potenciais causados ​​pelo transporte NC para os parâmetros de barreira descritos acima. Transcelular i transportes determinado, abordando o efeito de modular endocitose e transcitose caminhos.

Como validação do nosso modelo de célula para estudar o transporte transepitelial de CNs segmentados, a Figura 2 mostra que monocamadas Caco-2 de células plaqueadas a uma densidade de 1,5 x 10 5 células / cm 2 atingiram a confluência ~ Dia 12 e mantida a integridade monocamada até ao Dia 18, indicado por TEER (Figura 2A). Isto foi validado pela presença de junções apertadas occludin-positivo (Figura 2B) em monocamadas com alta TEER (390 ?...

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Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Muitas aplicações terapêuticas necessitam de transporte seguro e eficiente de transportadores de drogas e suas cargas através das barreiras celulares no organismo. Este artigo descreve uma adaptação de métodos estabelecidos para avaliar a taxa e o mecanismo de transporte da droga nanocarriers (NCS) através das barreiras celulares, tais como o tracto gastrointestinal (GI) epitélio.

Modelos e Métodos para avaliar Transporte de Drug Delivery Systems através das barreiras celulares

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

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46.0K visualizações.  University of Maryland.  Muitas aplicações terapêuticas necessitam de transporte seguro e eficiente de transportadores de drogas e suas cargas através das barreiras celulares no organismo. Este artigo descreve uma adaptação de métodos estabelecidos para avaliar a taxa e o mecanismo de transporte da droga nanocarriers (NCS) através das barreiras celulares, tais como o tracto gastrointestinal (GI) epitélio. 

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Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Determinação da taxa de transporte de xenobióticos e nanomateriais através da placenta usando o<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de perfusão da placenta humana

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Bioengenharia

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

In Vitro permeação de Ferritinas FITC-carregados através de um Rat barreira sangue-cérebro: um modelo para estudar a Entrega de Nanoformulated Moléculas

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, as well its ability to protect and subsequently release its payload in response to a trigger. While silk can be formulated into various material formats, silk nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems. Therefore, this article covers the procedures for reverse engineering silk cocoons to yield a regenerated silk solution that can be used to generate stable silk nanoparticles. These nanoparticles are subsequently characterized, drug loaded and explored as a potential anticancer drug delivery system. Briefly, silk cocoons are reverse engineered first by degumming the cocoons, followed by silk dissolution and clean up, to yield an aqueous silk solution. Next, the regenerated silk solution is subjected to nanoprecipitation to yield silk nanoparticles &#8211; a simple but powerful method that generates uniform nanoparticles. The silk nanoparticles are characterized according to their size, zeta potential, morphology and stability in aqueous media, as well as their ability to entrap a chemotherapeutic payload and kill human breast cancer cells. Overall, the described methodology yields uniform silk nanoparticles that can be readily explored for a myriad of applications, including their use as a potential nanomedicine.

Nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems for a broad range of indications. Here, we describe a simple yet powerful method to manufacture silk nanoparticles using reverse engineered Bombyx mori silk. These silk nanoparticles can be readily loaded with a therapeutic payload and subsequently explored for drug delivery applications.

Fabricação e entrega da droga Aplicações de seda Nanopartículas

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular cartilage impairs its load-bearing function substantially as it experiences tremendous chemical degradation, i.e. proteoglycan loss and collagen fibril disruption. One promising way to investigate chemical damage mechanisms during OA is to expose the cartilage specimens to an external solute and monitor the diffusion of the molecules. The degree of cartilage damage (i.e. concentration and configuration of essential macromolecules) is associated with collisional energy loss of external solutes while moving across articular cartilage creates different diffusion characteristics compared to healthy cartilage. In this study, we introduce a protocol, which consists of several steps and is based on previously developed experimental micro-Computed Tomography (micro-CT) and finite element modeling. The transport of charged and uncharged iodinated molecules is first recorded using micro-CT, which is followed by applying biphasic-solute and multiphasic finite element models to obtain diffusion coefficients and fixed charge densities across cartilage zones.

We propose a protocol to investigate the transport of charged and uncharged molecules across articular cartilage with the aid of recently developed experimental and numerical methods.

Um Experimental e Finite Element protocolo para investigar o transporte de solutos neutras e carregadas em toda a cartilagem articular

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Creating a Structurally Realistic Finite Element Geometric Model of a Cardiomyocyte to Study the Role of Cellular Architecture in Cardiomyocyte Systems Biology

With the advent of three-dimensional (3D) imaging technologies such as electron tomography, serial-block-face scanning electron microscopy and confocal microscopy, the scientific community has unprecedented access to large datasets at sub-micrometer resolution that characterize the architectural remodeling that accompanies changes in cardiomyocyte function in health and disease. However, these datasets have been under-utilized for&#160;investigating the role of cellular architecture remodeling in cardiomyocyte function. The purpose of this protocol is to outline how to create an accurate finite element model of a cardiomyocyte using high resolution electron microscopy and confocal microscopy images. A detailed and accurate model of cellular architecture has significant potential to provide new insights into cardiomyocyte biology, more than experiments alone can garner. The power of this method lies in its ability to computationally fuse information from two disparate imaging modalities of cardiomyocyte ultrastructure to develop one unified and detailed model of the cardiomyocyte. This protocol outlines steps to integrate electron tomography and confocal microscopy images of adult male Wistar (name for a specific breed of albino rat) rat cardiomyocytes to develop a half-sarcomere finite element model of the cardiomyocyte. The procedure generates a 3D finite element model that contains an accurate, high-resolution depiction (on the order of ~35 nm) of the distribution of mitochondria, myofibrils and ryanodine receptor clusters that release the necessary calcium for cardiomyocyte contraction from the sarcoplasmic reticular network (SR) into the myofibril and cytosolic compartment. The model generated here as an illustration does not incorporate details of the transverse-tubule architecture or the sarcoplasmic reticular network and is therefore a minimal model of the cardiomyocyte. Nevertheless, the model can already be applied in simulation-based investigations into the role of cell structure in calcium signaling and mitochondrial bioenergetics, which is illustrated and discussed using two case studies that are presented following the detailed protocol.

This protocol outlines a novel method to create a spatially detailed finite element model of the intracellular architecture of cardiomyocytes from electron microscopy and confocal microscopy images. The power of this spatially detailed model is demonstrated using case studies in calcium signaling and bioenergetics.

Criando um modelo geométrico de elementos finitos estruturalmente realista de um casos para estudar o papel da arquitetura celular em casos de biologia de sistemas

With the advent of three-dimensional (3D) imaging technologies such as electron tomography, serial-block-face scanning electron microscopy and confocal ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

Functionalization superfície de nanopartículas de vírus de hepatite E usando métodos de conjugação química

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

Avaliação global da eficácia e segurança de entrega de droga Placenta-alvo usando três métodos complementares

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

Análise 3D de respostas multicelulares a gradientes Quimioatrativos

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...