Este protocolo pode ser usado para produzir nanopartículas lipídicas encapsuladas com alta reprodutibilidade e velocidade e baixos volumes. Os parâmetros de formulação podem ser ajustados para alcançar uma distribuição biológica desejada com base na aplicação clínica. O design padrão do herringbone do cartucho microfluido permite um fluxo laminar rápido, preciso e controlado durante a mistura.
O método é capaz de escalar e gera partículas uniformes e altamente encapsuladas. Com a maioria dos produtos de terapia genética aprovados comercialmente, baseando-se em métodos virais, este procedimento pode fornecer informações sobre a entrega de genes, já que sua abordagem não viral permite aplicações para as quais a dosagem repetida é necessária. Comece adicionando a quantidade apropriada de cada solução de estoque líquido a um frasco de vidro com vórtice intermitente.
conforme indicado na tabela, seguido pela adição de 200 etanol à prova de etanol a um volume final de 533 microliters. Em seguida, adicione a quantidade apropriada de estoque de mRNA e dilua com tampão de citrato para alcançar um volume final de 1,5 mililitros na concentração desejada. Para prime os canais microfluidos, primeiro digite o parâmetro de escorraça no software de instrumento, conforme descrito na tabela.
Em seguida, abra a tampa do instrumento e coloque um cartucho microfluido no bloco rotativo. Carregue pelo menos 500 microliters de etanol em uma seringa de 1 mililitro, cuidando que não há bolhas ou aberturas de ar na ponta da seringa e insira a seringa na entrada direita do cartucho. Carregue uma seringa de cinco mililitros com 1,5 mililitros de tampão citrato, tomando cuidado para que não haja bolhas de ar ou lacunas, e insira a seringa na entrada esquerda do cartucho.
Coloque dois tubos cônicos de 15 mililitros nos suportes de clipe para servir como recipientes de resíduos e clique em Ir"para misturar as soluções. Quando o instrumento parar de escorraçar conforme indicado pela luz azul inferior desligando, abra o atraso e descarte corretamente os tubos cônicos e seringas. Para formação de nanopartículas lipídicas, defina os parâmetros de formulação adequados conforme indicado na tabela e carregue uma seringa de 1 mililitro com uma mistura lipídica previamente preparada.
Remova quaisquer lacunas de ar ou bolhas na ponta da seringa e insira a seringa no lado direito do cartucho. Carregue a solução de ácido nucleico previamente preparada em uma seringa de 3 mililitros, cuidando que não há bolhas ou aberturas de ar na ponta da seringa, e insira a seringa na entrada esquerda do cartucho. Coloque um tubo cônico sem 15 mililitros RNAase rotulado com o nome da amostra no clipe do tubo esquerdo e coloque um resíduo de 15 mililitros cônicos no clipe do tubo direito.
Feche a tampa do instrumento e clique em Go.As soluções lipídicas e mRNA fluirão através do cartucho microfluido e a solução de nanopartículas lipídicas será coletada nos tubos cônicos. Retenha o tubo cônico no final do processo de formulação e, em seguida, dilua as nanopartículas lipídicas com 5 mililitros de PBS e um gabinete de segurança biológica. Para realizar uma troca de buffer, primeiro pré-lave um filtro ultracentrifuge tamanho poros de 100 kilodalton com 2 mililitros de PBS, centrífuga e, em seguida, esvazie o PBS do compartimento inferior.
Adicione as nanopartículas lipídicas diluídas ao compartimento superior do filtro de ultracentrifuuge pré-lavado para três lavagens centrífugas, descartando o fluxo através e adicionando 5 mililitros de PBS ao filtro ultracentrífuga após as duas primeiras lavagens. Após a última lavagem, pipeta a solução de nanopartículas lipídicas contra as paredes do filtro ultracentrífuga algumas vezes para minimizar a perda de nanopartículas antes de transferir a solução de nanopartículas para um frasco sem nuclease. Em seguida, adicione PBS para trazer a suspensão da nanopartícula à concentração experimental e volume necessários.
Para avaliar a eficiência de encapsulamento das nanopartículas lipídicas, primeiro preparem diluições serial duplas da solução de ácido nucleico em funcionamento na PBS para gerar uma curva padrão, partindo de 500 nanogramas por mililitro e fazendo pelo menos cinco diluições. Em seguida, prepare as diluições da amostra de nanopartículas na PBS para obter uma concentração teórica apropriada que fica ao redor do ponto médio da curva padrão. Em seguida, prepare o reagente RNA verde ribo para detectar a presença de RNA dentro e fora da nanopartícula lipídica misturando as quantidades apropriadas de reagente RNA, Triton X100 e PBS.
Em seguida, para detectar a presença de RNA fora da nanopartícula líquida, misture as quantidades apropriadas de reagentes de RNA e apenas PBS. Carregar réplicas do padrão nucleico de ácido e soluções de nanopartículas lipídicas em uma placa de poço 96 resistente à fluorescência negra, em seguida, adicionar um volume igual de reagente de quantificação de RNA com, e sem Triton X100 ao padrão e a amostra replica. Agite a placa no leitor de placas por cinco minutos à temperatura ambiente protegida da luz para obter uma mistura completa das amostras, em seguida, meça a fluorescência em um leitor de microplaca em um comprimento de onda de excitação de 480 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 520 nanômetros.
Para medir o tamanho hidrodinâmico e a poli dispersão das nanopartículas lipídicas, primeiro diluir a solução de nanopartículas 40 vezes em PBS e adicionar a solução a um semi micro cuvette. Carregue o cuvette no Zetasizer e selecione um procedimento operacional padrão para definir o instrumento para medir as nanopartículas de acordo com seu material, dispersante, temperatura e tipo de célula. Em seguida, clique em Iniciar"para medir o tamanho hidrodinâmico e a poli dispersão das nanopartículas lipídicas.
Para medir o potencial zeta de nanopartículas lipídicas, diluir a solução de nanopartículas 40 vezes em água sem nuclease e carregar a solução em um cuvette para a linha de enchimento. Coloque o cuvette em um analisador potencial Zeta, tomando cuidado para que os eletrodos façam contato com o instrumento, e defina o instrumento para medir o potencial zeta de acordo com a composição específica das nanopartículas lipídicas. Em seguida, clique em Iniciar"para medir o potencial de nanopartículas lipídicas zeta.
Nesta análise, vários lotes de nanopartículas lipídicas com a mesma formulação lipídica e razão de amina para fosfato foram desenvolvidos em dias separados para demonstrar a reprodutibilidade da técnica. Como observado, os lotes um e dois apresentaram distribuições de tamanho sobrepostas com uma poli dispersidade semelhante, sem diferenças significativas observadas no tamanho ou eficiência de encapsulamento entre os lotes. Normalmente, mudanças nos parâmetros de formulação induzem algumas pequenas, mas estatisticamente significativas diferenças.
Por exemplo, a diminuição da relação amina para fosfato resulta em uma redução de 4% na eficiência do encapsulamento, com um aumento concomitante no diâmetro hidrodinâmico das nanopartículas. As nanopartículas lipídicas formuladas com lipídios ionizáveis diferentes, mas a mesma razão amina para fosfato, apresentam uma mudança significativa na eficiência do encapsulamento, bem como pequenas diferenças no diâmetro das partículas. O encapsulamento do DNA plasmídeo resulta em partículas maiores em comparação com as nanopartículas lipídicas de encapsulamento mRA, embora ambos os tipos de nanopartículas demonstrem uma eficiência de encapsulamento semelhante.
Alterações no parâmetro do processo de fluxo, no entanto, não afetam o desenvolvimento de nanopartículas lipídicas. As nanopartículas lipídicas têm ótimas aplicações, sendo o exemplo perfeito as vacinas COVID-19 recentemente aprovadas. Esta técnica serve como um grande conjunto de ferramentas e abre caminho para aplicações futuras, permitindo a triagem de formulação de membros inferiores.
