Agradecemos C. Montojo, J. Reyes, e M. Armour para aconselhamento e assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por Institutos Nacionais de Saúde dos EUA concessão F31 NS063550 (para DAL), um prêmio Basil O&#39;Connor Iniciado Scholar e subvenções do Fundo Klingenstein e NARSAD (a SB). SB é um WM Keck Distinguished Scholar Jovem em Pesquisa Médica.

Uso animal Obter a aprovação do Comitê Animal Care e Use institucional para tratamento padrão e de uso de protocolos. O protocolo corrente foi desenvolvido para estudos de irradiação focais sobre 5.5-10 semanas de idade adultos ratinhos C57BL6 / J, tal como descrito anteriormente (Figura 2) 2. No entanto, outras idades e de pequenas espécies animais (ratos, hamsters, esquilos, etc) também podem ser usados, desde que os protocolos de anestesia efetivos e um atlas de referência radiográficas que permitam identificar a região de interesse (ROI) estão disponíveis. 1. Calibração de Plataforma Radiológica CT-guiada Realizar calibrações baseadas em filme para a dose de radiação na plataforma radiológico com antecedência para cada tamanho de colimador e tipo de filtro tubo de raios-X usados. A fim de atingir um raio de arco de irradiação no local de destino desejado, use o software de planejamento de dose de radiação 49 available na maioria das plataformas comerciais de radiação para calcular tempo de entrega exigido com base na dose de radiação, a profundidade da região de interesse (ROI) com base em tomografias computadorizadas do mouse, ea velocidade de rotação da plataforma robótica; detalhes sobre este são deixados de fora deste protocolo como eles diferem entre as plataformas de radiação. Para efeitos de visualização do hipotálamo ventrobasal 2 (Figura 3), com imagens de RM, operar o tubo de raios-X com um ponto focal de 0,4 mm e a energia do feixe de 100 kVp, com 1 milímetro Al filtração. Para irradiação focal da ZAP, opere o tubo de raios-X a 225 kVp, 13 mA, e um ponto focal de 1 mm com filtração de 0,15 milímetros Cu, para entregar 10 Gy de radiação a uma profundidade de tecido de 0,6 centímetros ao longo de um tratamento tempo de 4,6 minutos. Segmentação entre diferentes ROIs exigirá cálculo diferentes parâmetros. <ol><li> Se estudar os efeitos da dieta rica em gordura sobre a neurogênese na eminência mediana, como descrito anteriormente 2, obter quatro semanas de idade, do sexo feminino C57BCamundongos L6 / J de laboratórios Jackson mouse e casa quatro ratos por gaiola. Interruptor de alimentos a partir de ração normal para uma dieta de alto teor de gordura às cinco semanas de idade. Permitir camundongos se adapte à nova moradia e alimentação. Realizar tratamento CFIR em 5,5 semanas de idade. Transporte submete à sala de operação que contém a plataforma radiológica. Minimizar os níveis de estresse durante a transferência. Prepare isoflurano câmara de anestesia gás. Em seguida, adicione um único rato na câmara. Em paralelo, preparar almofada de aquecimento (baixa definição) para o pós-tratamento. </li><li> Uma vez que o mouse está sob e não mais respondendo a compressão pé-almofada, trazer o assunto para a plataforma radiológica e coloque na cama imobilização da fase robótico. Coloque a boca do sujeito no copo anestesia nariz-cone, e dentes no guarda mordida (Figura 1D). Colocar o plano do mouse em cima da cama de imobilização e verificar para ver se ele continua a manter apatia. Se assim for, fita para baixo do mouse para a cama com fita de gaze. Enquanto gravando o mouse para a cama, Certifique-se o chefe é nivelado a um plano horizontal. Isto pode ser determinado, puxando para cima das orelhas e ver se eles estão niveladas. Uma vez que o mouse está na posição correta, feche o escudo protetor de chumbo. </li><li> Adquirir a verificação do computador-tomografia usando software on-board de plataforma radiológico do experimentador (isto irá variar entre plataformas), que irá proporcionar uma varredura estrutural anatômica tridimensional do assunto mouse. Verifique se a cabeça do rato é nivelado ao plano horizontal. Se não, repita os passos de 1,2-1,3 até a cabeça do sujeito é nivelado. </li><li> Identificar ROI imagem CT by. Calcular a distância de ROI para a superfície do crânio com um ângulo de 45 ° em relação ao plano horizontal, como mostrado na Figura 3E. </li><li> Usando o software on-board, tirar um raio-X do assunto rato por cima, como mostrado na Figura 4A. Em seguida, retire do mouse a partir da plataforma radiológica, colocar almofada de aquecimento, e monitorar até ativa. </li><li> A partir das imagens coronais CT, calcular a profundidade média ROI anatómica de pelo menos três ratos a fim de determinar a dosagem de entrega. Como um exemplo de um estudo anterior em que 2 10 Gy de radiação foi administrada para o hipotálamo ventrobasal, a profundidade da ROI do crânio (a partir de um ângulo de 45 °) é de 0,66 cm (Ver Figura 3E). Sabendo disso, os pesquisadores usaram o software de planejamento de dose (DPS) instalado em sua plataforma radiológica para calcular a velocidade de rotação adequado e duração do tratamento para atingir dose desejada para o ROI. </li><li> Após a determinação da duração do tratamento e da velocidade de rotação da fase robótico com o software de dose-planeamento, medir distribuições de dose dos parâmetros calculados com películas sensíveis à radiação GAFchromic incorporados num modelo simulado-rato de plástico equivalente de água. Para fazer isso, incorporar três filmes sensíveis à radiação GAFchromic entre quatro empilhadas verticalmente blocos de plástico equivalente de água 29 comomostrado na Figura 4B. </li><li> Coloque modelo de simulação do mouse contendo filmes GAFchromic no palco robótico, e executar o feixe de irradiação focal com os parâmetros recém-calculados. Por exemplo, para visar a ventrobasal hipotálamo, introduzir os parâmetros de filtro de 0,15 milímetros de Cu, 225 kVp, 13 mA, 1 mm de diâmetro do feixe de radiação ambiente, 45 ° de ângulo de pórtico, 1,3 ° / s de rotação, e de 4,6 min para se obter um ROI a dose radiológica de 10 Gy. </li><li> Após a irradiação, verifique filmes para padrão e intensidade da dose de radiação. Para um ângulo de rotação de 360 ​​°, com os parâmetros listados para atingir o hipotálamo ventrobasal, um anel escuro na película acima isocentro, uma pequena mancha nítida no filme isocentro, e um anel mais leve na película abaixo do isocentro correspondente para o cone administração do feixe de irradiação serão observados (Figura 4B). </li><li> Sobreponha isocentro filme GAFchromic sobre os raios-X de objetos do rato a partir do qual os parâmetros foram callada. O ponto focal irradiado no isocentro deve sobrepor-se com a região de ROI desejada, como mostrado na Figura 4C. </li></ol> Método alternativo: Se a dificuldade em atingir o ROI cérebro persistir, utilize contraste iodado injetado por via intratecal para melhorar a visualização dos ventrículos em imagens de CT. Por uma questão de brevidade, este procedimento é deixado de fora deste protocolo, mas é descrito anteriormente 35, 50. Contraste de iodo irá fornecer marcos ventriculares adicionais (Figura 5A). 2. Determinar a precisão de irradiação Além disso confirmar a precisão do feixe CFIR pela visualização direta do feixe de radiação no tecido 2, 35, 51. Para fazer isso, execute imunohistoquímica para detectar γH2AX 51, uma proteína histona e um marcador precoce de rupturas de filamentos duplos de DNA. Assuntos do mouse deve ser transcardially perfundidos e fixados dentro de uma hora de irradiação. Após irradiation, reparo do DNA rapidamente se segue, e os níveis de ΥH2Ax diminuir significativamente 35. <ol><li> Repita os passos de 1,1-1,3. </li><li> Depois que o alvo é identificado no CT, o tema do mouse é movido sob controle robótico para alinhar esta meta com o feixe de radiação entrega. Entrada parâmetros calculados (velocidade de rotação e tempo de tratamento para atingir dose desejada) a partir do passo 1.6 em software dose de planejamento e começar o tratamento. O tratamento é entregue com o pórtico apontou para 45 ° em relação à vertical, enquanto o mouse gira sobre um eixo orientado verticalmente. </li><li> Após a irradiação, realizar perfusão transcardial sobre assuntos do mouse. Realize perfusão dentro de uma hora 52. Após perfusão, correção imersão cérebros em PFA 4% / PBS e abane durante a noite a 4 ° C. </li><li> Na manhã seguinte, lavar 5 min em PBS, 3x para remover paraformaldeído fixador. Em seguida, imerso em 30% de sacarose em PBS 1x num agitador a 4 ° C. </li><li> Agite suavemente a 4 ° C (usdualmente 12-16 h), até que o cérebro se afunda até o fundo do tubo. Isto serve como um passo crioproteção. Uma vez que os cérebros afundar, remova cérebro com uma colher perfurada para evitar excesso de 30% sucrose/1x transferência PBS. Rapidamente incorporar no congelamento médio em gelo seco. Agitar meio de congelamento com ponteira e alinhar cérebro em moldes de plástico. </li><li> Uma vez completamente congelado, transferir blocos de cérebro de -20 ° C congelador para armazenamento. </li><li> No dia em que será realizada imuno-histoquímica, a secção coronal em 40 mM de espessura, e flutuam em uma placa de 24 poços contendo PBS com um pincel fino. Seções devem ser mantidos em ordem serial correta para a imunocoloração para determinar a cobertura de irradiação da região de destino. </li><li> Pré-aquecer 0,01 M de solução de citrato de sódio a 80 ° C em banho de água em preparação para o passo de recuperação de antigénio. Simultaneamente, enquanto o citrato de sódio é o aquecimento, executar lavagens de 5 min 3x em 0,01 M de PBS. </li><li> Uma vez que uma solução de citrato de sódio é de 80 ° C, submergir secções cerebrais in a solução tampão de citrato de sódio. Deixar em banho de água a 80 ° C durante 1 hora. </li><li> Retirar secção e permita que a solução de citrato de sódio para atingir a temperatura ambiente, em seguida, executar três lavagens de 5 minutos em 0,01 M de PBS. </li><li> Bloquear secções do cérebro durante 1 h em PBS-Triton, contendo 5% de soro de cabra normal. </li><li> Incubar secções do cérebro durante a noite em PBS contendo Triton-5% de soro de cabra normal com concentração de 1:700 de ratinho anti-fosfo-H2AX anticorpo primário a 4 ° C. </li><li> No dia seguinte, 15 min executar lavagens 3x em PBS 0,01 M, Triton. </li><li> Incubar secções cerebrais PBS-Triton, contendo 5% de soro de cabra normal com anticorpo secundário de cabra anti-ratinho conjugada com 488 nm fluorphore na concentração de 1:500 durante 2 horas. </li><li> Execute 15 min lavagens 3x em 0,01 M PBS-Triton. </li><li> Realizar 4 &#39;(DAPI) mancha-diamidino-2-fenilindole ,6 (1:5000 em PBS) durante 10 min para visualizar núcleo. Em seguida, lavam secções do cérebro durante 5 min com PBS. </li><li> Montar em eletrostática chmicroscópio arged desliza por seção flutuante em PBS. Limpe o excesso de PBS e deixar as lâminas secar. Lamela as lâminas, utilizando o meio de montagem e de permitir que as lâminas seca no escuro e à temperatura ambiente durante a noite. </li><li> Tire fotos de cortes coronais de série com microscópio de fluorescência. ΥH2Ax immunostaining (verde) indica local de irradiação. DAPI (azul) é uma mancha nuclear (Figura 5B). </li></ol> 3. Preparação de Rato Assuntos para irradiação focal Examine os resultados de positividade ΥH2Ax. Uma vez satisfeito com a calibração e direcionamento do feixe de radiação, prosseguir com o experimento. Neste ponto, o tempo total necessário para tratar de um ratinho (a partir de instalação de animais para a conclusão de administração do feixe) é de aproximadamente 10-15 minutos para um tratamento de 10 Gy com um raio de 1 mm. <ol><li> Encomende quatro semanas de idade camundongos fêmeas C57BL6 / J de laboratórios Jackson do Mouse. Casa de quatro ratos por gaiola, e mudar comida de ração normala uma dieta de alto teor de gordura às cinco semanas de idade. Camundongos soco orelha para dar-lhes as marcas de identificação únicos. Monitorar a saúde dos ratos diariamente. Nota: marcadores metálicos não pode ser utilizado à medida que vai resultar em estrias artefactos no CT. </li><li> Pesar camundongos um dia antes de o tratamento de radiação ou farsa. Camundongos divididos em dois grupos de radiação ou tratamento placebo e garantir que não há diferença significativa de peso entre coortes. No dia do tratamento, quando os ratos estão seis semanas de idade, pesar novamente todos os ratos e registrar sua massa. Gentilmente transportar ambos os grupos para a plataforma radiológica. Tome cuidado para minimizar os níveis de estresse. </li><li> Prepare isoflurano câmara de anestesia gás. Anestesiar dois ratos, um no grupo irradiação pré-determinado, e outro no grupo controle farsa. Prepare almofada de aquecimento definido na baixa definição para o tratamento pós-operatório. </li><li> Siga os passos de 1,2-1,4 para o mouse para receber a irradiação. Para o mouse farsa, mantenha o mouse na câmara de anestesia enquanto o tratamento está acontecendo. Faça sure que câmara anestesia é perto da plataforma CFIR assim quaisquer efeitos sobre a radiação ambiente são tidos dentro Após o alvo é identificado na CT, mova o mouse assunto sob controle robótico para alinhar esta meta com o feixe de radiação entrega. Entrada de parâmetros (velocidade de rotação e duração do tratamento) calculado em software dose de planejamento. </li><li> Uma vez que o tratamento de irradiação for concluída, voltar tanto farsa e os ratos irradiados a almofada de aquecimento, e monitorar até que eles acordam. </li><li> Retornar tanto farsa e ratos irradiados para biotério. Monitorar todos os dias. Pesa-se a ratinhos cada meia semana. Para confirmar a irradiação da zona proliferativa hipotálamo alvo, administrar injeções intraperitoneais de BrdU (50 mg / kg), três dias após o tratamento e examinar a neurogênese entre grupos por colabeling de imuno-histoquímica para BrdU e um marcador neuronal de um mês após a exposição inicial BrdU (Figura 6) 2. </li></ol>

JW tem um financiamento e de consulta de pesquisa acordos com Xstrahl, Inc.

Irradiação focal CT-guiada (CFIR) é uma abordagem nova e completa do sistema capaz de fornecer campos de radiação a alvos em pequenos animais sob controle robótico usando CT-orientação 32. A capacidade de CFIR para entregar vigas altamente concentrado para pequenos modelos animais proporciona novas oportunidades de pesquisa para colmatar pesquisas de laboratório e tradução clínica. Este artigo descreve a abordagem CFIR para entrega radiação preciso para atingir especificamente uma população pr...

Descobertas recentes demonstraram que o cérebro de mamíferos adultos pode ser submetido a um notável grau de plasticidade. Neurônios-nascido adultas são gerados durante a vida adulta em nichos especializados do cérebro dos mamíferos 1. Qual é a função desses neurônios nascido de adultos? E mais ainda, que eles desempenham um papel na fisiologia e comportamento? Estudos sobre o tema têm, tradicionalmente focada na zona subventricular dos ventrículos laterais ea zona subgranular do hipocampo, no entanto, estudos recentes têm caracterizado a neurogênese em outras regiões do cérebro, como o hipotálamo dos mamíferos 2. Neurogenesis foi avaliado no pós-natal e adulto hipotálamo 2-10, e a função destes neurónios hipotalâmicos-nascidos ainda uma área activa de investigação. A caracterização funcional de neurônios nascido de adultos continua a ser um desafio significativo para o campo da neurociência em geral. Inibição seletiva de especificaçãoIFIC populações progenitoras neurais permanece limitada pela falta de marcadores moleculares disponíveis, que são únicas para populações progenitoras neurais individuais 11. Assim, a eliminação seletiva dos neurônios nascido de adultos destes progenitores neurais através de segmentação genética continua difícil. Da mesma forma, a entrega viral para atingir os neurônios nascido de adultos sofre de potenciais variáveis ​​de confusão, tais como a introdução de lesão e inflamação no ambiente 12. Novas ferramentas radiológicos estão surgindo, no entanto, que permitem contornar essas confunde e investigar essas questões por meio da segmentação anatômica exato e preciso em pequenos animais. A radiação ionizante inibe o nascimento e diferenciação de novos neurônios, e permite que um método não invasivo para atingir populações progenitoras neurais 13-15. Recentemente, descrevemos uma região germinal da eminência mediana do hipotálamo dos mamíferos (ME) que denominou a zona proliferativa hipotálamo (ZAP) 2 </sup&gt;. Descobrimos que quando ratos jovens adultos do sexo feminino receberam uma dieta rica em gordura (DFH), os níveis de neurogênese em ratos HFD-alimentados foram substancialmente mais elevadas do que a sua comida normal (NC) controles alimentados nesta região ME 2. Para testar se a neurogênese adulta dentro do ME hipotálamo regula o metabolismo e do peso, buscou-se interromper esse processo. A eminência mediana é uma pequena estrutura unilateral na base do terceiro ventrículo a partir do qual as hormonas reguladoras são libertados. A fim de inibir a proliferação e neurogênese posterior sem alterar as outras funções fisiológicas desta região do cérebro, desenvolvemos uma técnica de irradiação focal não-invasivo para inibir seletivamente o nascimento de neurônios adultos recém-nascidos na eminência mediana do hipotálamo 2. Vários grupos têm utilizado a radiação para suprimir a neurogênese em regiões canônicas 14-28. No entanto, as abordagens radiológicos anteriores geralmente alvo de grandes áreas, ou often involuntariamente também alvejado várias áreas do cérebro onde foi reportado a neurogênese, o que torna difícil para associar de forma inequívoca quaisquer defeitos comportamentais observadas com defeitos em populações específicas progenitoras neurais. A capacidade de irradiação mais direcionado é fornecido pelo plataformas radiológicos que combinam c omputer imagem guiada por tomografia com f ocal ir feixe de radiação (CFIR) entrega para permitir anatômica mira de precisão 29-36. Feixes de radiação tão pequenas quanto 0,5 mm de diâmetro estão disponíveis para atingir populações progenitoras neurais específicos 35. Esta metodologia permite-nos atingir o ME hipotálamo e prender proliferação e bloqueiam a neurogênese em pequenos animais. Após o tratamento radiológico nestas populações progenitoras, testes fisiológicos e comportamentais podem ser realizados para esclarecer a função potencial de células-nascido adultos. Segmentação focal é especialmente importante para a nossa aplicação, desde oglândula pituitária está localizado perto da eminência mediana do hipotálamo; irradiação da hipófise pode afetar a função hormonal e, posteriormente, confundir os resultados. A base biológica para a supressão da neurogênese após irradiação ainda permanece obscuro. Estudos de radiação anteriores têm contado com grandes vigas área, e concluíram que a supressão da neurogênese é mediada através de uma resposta inflamatória 14, 37. Como tal, não está claro se a irradiação altamente focal poderia suprimir a neurogênese, uma vez que não evocar uma resposta inflamatória substancial. No entanto, estudos recentes do nosso grupo do clássico região neurogénica no hipocampo têm demonstrado que a irradiação altamente focal com uma dose de 10 Gy, pode suprimir a neurogénese durante pelo menos 4 semanas após a irradiação 35. Para interrogar a função dos neurônios do hipotálamo nascido de adultos na eminência mediana, usamos uma radiação precisão device capaz de fornecer imagens CT em combinação com feixes de radiação de pequeno diâmetro para inibir a neurogênese ME. Utilizando um tubo de raio-X acoplado a um pórtico que gira ao longo de um intervalo de 360 °, que entregam arco de feixe do feixe de micro irradiação com o uso de uma fase de amostra controlado roboticamente, que permite a rotação de um sujeito animal durante o tratamento de radiação (Figura 1) . Uma maior resolução do detector de raios-X é utilizado para a aquisição de imagens, quando o pórtico está na posição horizontal 33. Para este estudo, imagens de TC foram reconstruídos com um tamanho de voxel isotrópico de 0,20 mm. No bordo de imagem CT permitiu a identificação de um alvo, enquanto o animal está na posição de tratamento. O alvo foi localizado usando o software de planejamento de dose de navegação CT, que foi incluído com a nossa plataforma radiológicos disponíveis comercialmente. Depois de localizar o nosso ROI por imagem CT, o animal foi movido para a posição de tratamento adequado pelo estágio espécime robótico que tem quatro grausRees de liberdade (X, Y, Z, θ). Através de uma combinação de ângulos de pórtico e estágio robô, vigas podem ser entregues a partir de quase qualquer direção em relação ao animal, e tratamentos de arco-like estereotáxica são possíveis 29. Para estes e todos os outros estudos de imagiologia, os ratos foram colocados num dispositivo de imobilização, que permite a libertação de gás anestésico de isoflurano durante a restringir o movimento. A cama de imobilização é CT compatível, e se conecta ao palco espécime robótico 34. Esperamos que CFIR proporcionará avanços conceituais em um número de áreas de investigação. Apesar de usarmos segmentação radiológica da eminência mediana do hipotálamo como prova de princípio desta técnica, CFIR pode ser usado para atingir qualquer região do corpo de qualquer modelo pequeno organismo em princípio. Nos ciências neurológicas, por exemplo, prever que esta técnica pode ser utilizada para avaliar a função de populações progenitoras activamente proliferativas que têm sido sugeridos para exist em outros órgãos circumventricular, tais como a área postrema 38, 39, 40 do órgão subfornical e na hipófise 41. Controvérsias de longa data sobre o papel funcional da neurogênese adulta e identificação de um papel causal no comportamento também pode agora ser melhor abordados. Em aves canoras, esta técnica pode abordar o papel da neurogênese adulta na manutenção do comportamento robusto e sazonal do canto dos pássaros 42, que tem sido dificultado pela capacidade de inibir seletivamente a neurogênese em regiões específicas do cérebro. Compreender este modelo comportamental robusto pode lançar uma nova visão sobre o papel da neurogênese adulta na regulação de outros comportamentos sexualmente dimórficos. Em alternativa, no campo metabólica, CFIR pode ser usada para explorar aspectos do papel de proliferação dos hepatócitos e o seu papel no metabolismo e no balanço de energia. A possibilidade de avanço conceptual em várias disciplinas de investigação é aumentada pela introdução desta técnica. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Neste artigo, vamos demonstrar as capacidades do CFIR para anatômica precisão direcionamento de um feixe de irradiação focal. Embora inicialmente desenvolvido esta plataforma de pesquisa de radiação de pequenos animais (SARRP) para os nossos estudos, outros dispositivos similares já estão comercialmente disponíveis que podem realizar irradiação semelhante guiada por TC focal 43, 44. Por isso, nós generalizamos este protocolo CFIR com passos necessários para todas as plataformas de pesquisa, em vez de os específicos para SARRP. As vantagens das abordagens mais CFIR radiológicos anteriores para inibir a neurogénese são que esta técnica permite a orientação da imagem volumétrica tridimensional para a localização e orientação da dose, a dose conformada minimiza a exposição de regiões cerebrais nontargeted, e geometria do feixe de alta precisão permite a distribuição da dose com conformado limites feixe afiadas. Nós delineamos como usar imagens CT-guiada para atingir a dose a uma região anatômica específica, e ao fazê-lo, como visualizar a radiaçãodose de distribuição diretamente no tecido usando coloração imuno-histoquímica para γ-H2AX, um marcador de DNA quebras de fita dupla 35, 45-48. A utilização desta abordagem para a irradiação seletiva de nichos neurogênicos podem ter implicações significativas na revelando o papel funcional de novos neurônios nascido de adultos sobre a fisiologia e doenças.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARRP research platform</td>
			<td>Xstrahl</td>
			<td>RS225A</td>
			<td><a href="http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm" target="_blank">http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARRP irradiation bunker</td>
			<td>Xstrahl</td>
			<td></td>
			<td>Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAF chromic film</td>
			<td>IPS</td>
			<td>GAFchromic ETB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse phantom</td>
			<td>Gammex</td>
			<td>457</td>
			<td>Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody</td>
			<td>Millipore, Inc.</td>
			<td>05-636</td>
			<td>clone JBW301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fat rodent diet</td>
			<td>Research Diets</td>
			<td>D12492i</td>
			<td>60% of the calories as fat, food should be irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>10019-360-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.01 M Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>nuclear counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vectashield or Gelvatol is preferred</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional interrogation of adult hypothalamic neurogenesis with focal radiological inhibition

A caracterização funcional de neurônios nascido de adultos continua a ser um desafio significativo. Abordagens para inibir adulto neurogenesis via entrega viral invasiva ou animais transgénicos têm potenciais confunde que tornam a interpretação dos resultados a partir destes estudos difícil. Novas ferramentas radiológicos estão surgindo, no entanto, que permitem que se investigue de forma não invasiva a função de selecionar grupos de neurônios nascido de adultos por meio da segmentação anatômica exato e preciso em pequenos animais. Radiação ionizante Focal inibe o nascimento e diferenciação de novos neurônios e permite a segmentação de regiões específicas progenitoras neurais. A fim de esclarecer o papel funcional potencial que a neurogênese adulta hipotálamo desempenha na regulação de processos fisiológicos, desenvolvemos uma técnica de irradiação focal não-invasivo para inibir seletivamente o nascimento de neurônios nascido de adultos na eminência mediana do hipotálamo. Nós descrevemos um método para C omputer guiada por tomografiaf ocal ir radiação (CFIR) entrega para permitir anatômico preciso e exato visando em pequenos animais. CFIR usa orientação imagem volumétrica tridimensional para a localização e orientação da dose de radiação, minimiza a exposição à radiação de regiões cerebrais nontargeted, e permite a distribuição da dose conformada com fronteiras nítidas feixe. Este protocolo permite fazer perguntas sobre a função dos neurônios nascido de adultos, mas também abre as áreas de perguntas em áreas de radiobiologia, biologia do tumor, e imunologia. Estas ferramentas radiológicos irá facilitar a tradução de descobertas no banco à cabeceira.

Avaliando Targeting CT-guiada e Precisão A calibração mecânica do sistema é crítico para assegurar que os feixes de vários ângulos todos se intersectam num ponto único. A calibração foi realizada com um método baseado na imagem semi-automático, onde a precisão do alinhamento extremidade-a-extremidade foi medido como sendo de 0,2 milímetros 29. Esta precisão é muito crítico que o volume da estrutura da eminência mediana do hipotálamo é pequeno 2. Para t...

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Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

A função dos neurônios de mamíferos nascido de adultos continua a ser uma área ativa de pesquisa. A radiação ionizante inibe o nascimento de novos neurônios. Usando computador guiada por tomografia irradiação focal (CFIR), segmentação anatômica tridimensional de populações específicas progenitoras neurais agora pode ser usado para avaliar o papel funcional da neurogênese adulta.

Interrogatório funcional do Adulto Hypothalamic Neurogenesis com Focal Radiológica Inibição

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

functional-interrogation-adult-hypothalamic-neurogenesis-with-focal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.1K visualizações.  California Institute of Technology.  A função dos neurônios de mamíferos nascido de adultos continua a ser uma área ativa de pesquisa. A radiação ionizante inibe o nascimento de novos neurônios. Usando computador guiada por tomografia irradiação focal (CFIR), segmentação anatômica tridimensional de populações específicas progenitoras neurais agora pode ser usado para avaliar o papel funcional da neurogênese adulta. 

Vídeo: Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the processing of simple sensory stimuli. We will use somatosensory stimuli to locate the hand somatosensory areas, auditory stimuli to locate the auditory cortices, visual stimuli in four quadrants of the visual field to locate the early visual areas. These type of experiments are used for functional mapping in epileptic and brain tumor patients to locate eloquent cortices. In basic neuroscience similar experimental protocols are used to study the orchestration of cortical activity. The acquisition protocol includes quality assurance procedures, subject preparation for the combined MEG/EEG study, and acquisition of evoked-response data with somatosensory, auditory, and visual stimuli. We also demonstrate analysis of the data using the equivalent current dipole model and cortically-constrained minimum-norm estimates. Anatomical MRI data are employed in the analysis for visualization and for deriving boundaries of tissue boundaries for forward modeling and cortical location and orientation constraints for the minimum-norm estimates.

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to map brain areas involved in the processing of simple sensory stimuli.

Mapeamento funcional com MEG e EEG em simultâneo

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Neurociência

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Respostas de imagem de cálcio nos neurônios GFP-tagged fatias de cérebro de rato Hipotalâmicos

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization of various cell types. These typically proceed with the application of antibodies to bind antigens and identify cells with characteristics that are a function of the inherent biology and development. Adult hippocampal neurogenesis is a sequential process wherein a quiescent neural stem cell can become activated and proceed through stages of proliferation, differentiation, maturation and functional integration. Each phase is distinct with a characteristic morphology and upregulation of genes. Identification of these phases is important to understand the regulatory mechanisms at play and any alterations in this process that underlie the pathophysiology of debilitating disorders. Our heat-induced antigen retrieval approach improves the intensity of the signal that is detected and allows correct identification of the progenitor cell type. As discussed in this paper, it especially allows us to circumvent current problems in detection of certain progenitor cell types.

During adult hippocampal neurogenesis, a distinct set of genetic markers are expressed when a quiescent neural stem cell sequentially progresses and develops into a functionally integrated neuron in the circuit. Using heat-induced antigen retrieval, progenitor cell types that are otherwise difficult to detect are identified with improved effectiveness.

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult hippocampus has been viewed as a very static anatomical region of the mammalian brain. However, recent findings have demonstrated that the dentate gyrus of the hippocampus is an area of tremendous plasticity in adults, involving not only modifications of existing neuronal circuits, but also adult neurogenesis. This plasticity is regulated by complex transcriptional networks, in which the transcription factor NF-&#954;B plays a prominent role. To study and manipulate adult neurogenesis, a transgenic mouse model for forebrain-specific neuronal inhibition of NF-&#954;B activity can be used.
In this study, methods are described for the analysis of NF-&#954;B-dependent neurogenesis, including its structural aspects, neuronal apoptosis and progenitor proliferation, and cognitive significance, which was specifically assessed via a dentate gyrus (DG)-dependent behavioral test, the spatial pattern separation-Barnes maze (SPS-BM). The SPS-BM protocol could be simply adapted for use with other transgenic animal models designed to assess the influence of particular genes on adult hippocampal neurogenesis. Furthermore, SPS-BM could be used in other experimental settings aimed at investigating and manipulating DG-dependent learning, for example, using pharmacological agents.

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&amp;#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the manipulation and analysis of NF-&#954;B-dependent adult hippocampal neurogenesis are described. A detailed protocol is presented for a dentate gyrus-dependent behavioral test (termed the spatial pattern separation-Barnes maze) for the investigation of cognitive outcome in mice. This technique should also help enable investigations in other experimental settings.

Os métodos para a modulação e Análise de NF-kB-dependente Adulto Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

Imagem Funcional do Cortex Auditivo em gatos adultos usando de alta campo fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Stab ferida ferimento do peixe-zebra adulto Telencéfalo: Um método para investigar Vertebrados Cérebro Neurogênese e Regeneração

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

Multi-photon intracelular de sódio Imagem Combinado com mediada por UV uncaging focal de glutamato em neurônios piramidais CA1

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

A imuno-histoquímica e Rotulagem múltipla com anticorpos da espécie hospedeira Mesmas para Estudar Adulto Hippocampal Neurogênese

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

Avaliando Neurogênese Primária em<em&gt; Xenopus</em&gt; Os embriões Usando Imunomarcação

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Online Transcranial Magnetic Stimulation Protocol for Measuring Cortical Physiology Associated with Response Inhibition

We describe the development of a reproducible, child-friendly motor response inhibition task suitable for online Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) characterization of primary motor cortex (M1) excitability and inhibition. Motor response inhibition prevents unwanted actions and is abnormal in several neuropsychiatric conditions. TMS is a non-invasive technology that can quantify M1 excitability and inhibition using single- and paired-pulse protocols and can be precisely timed to study cortical physiology with high temporal resolution. We modified the original Slater-Hammel (S-H) stop signal task to create a &#34;racecar&#34; version with TMS pulses time-locked to intra-trial events. This task is self-paced, with each trial initiating after a button push to move the racecar towards the 800 ms target. GO trials require a finger-lift to stop the racecar just before this target. Interspersed randomly are STOP trials (25%) during which the dynamically adjusted stop signal prompts subjects to prevent finger-lift. For GO trials, TMS pulses were delivered at 650 ms after trial onset; whereas, for STOP trials, the TMS pulses occurred 150 ms after the stop signal. The timings of the TMS pulses were decided based on electroencephalography (EEG) studies showing event-related changes in these time ranges during stop signal tasks. This task was studied in 3 blocks at two study sites (n=38) and we recorded behavioral performance and event-related motor-evoked potentials (MEP). Regression modelling was used to analyze MEP amplitudes using age as a covariate with multiple independent variables (sex, study site, block, TMS pulse condition [single- vs. paired-pulse], trial condition [GO, successful STOP, failed STOP]). The analysis showed that TMS pulse condition (p&#60;0.0001) and its interaction with trial condition (p=0.009) were significant. Future applications for this online S-H/TMS paradigm include the addition of simultaneous EEG acquisition to measure TMS-evoked EEG potentials. A potential limitation is that in children, the TMS pulse sound could&#160;affect behavioral task performance.

We describe an experimental procedure to quantify excitability and inhibition of primary motor cortex during a motor response inhibition task by using Transcranial Magnetic Stimulation throughout the course of a Stop Signal Task.

Protocolo de estimulação magnética transcraniana on-line para medir Cortical fisiologia associada com inibição de resposta

We describe the development of a reproducible, child-friendly motor response inhibition task suitable for online Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) ...