Agradecemos Angela Kralemann-Köhler para excelente suporte técnico. O trabalho experimental aqui descrito foi realizado em nosso laboratório e foi apoiado por subsídios do Conselho Alemã de Pesquisa (DFG) para CK e BK e uma concessão do Ministério alemão da Educação e Pesquisa (BMBF) para BK.

Declaração de Ética Este estudo foi realizado em estrita conformidade com os regulamentos do animal e uso de cuidados comitê governamental, LANUV do estado Renânia do Norte-Vestfália, (Düsseldorf, Alemanha). Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo LANUV, Düsseldorf sob o número de licença 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento e o número de animais necessários para o estudo. 1. Animal Care e Habitação <ol><li> Todos os animais utilizados nos protocolos aqui descritos devem ser mantidos em condições livres de patógenos específicos, conforme definido pela Associação Federação Europeia Laboratory Animal Science (FELASA). </li><li> Os ratos devem ser mantidos em gaiolas padrão numa sala de temperatura e humidade controladas (22 ° C) sob condições diurnas (12 horas de luz / escuridão) com ar filtrado HEPA. </li><li> Comida padronizada e água devem ser fornecidas ad libitum. &lt;/ Li&gt; <li> Se IkB / tTA e IkB / - murganhos de controlo são utilizados, genotipagem baseada em PCR deve ser efectuada para cada animal, tal como descrito em 7, 18. </li><li> Animais do sexo masculino com uma diferença de idade de menos de quatro dias devem ser usadas para reduzir a variabilidade individual. </li><li> (Opcional): Para as experiências de reactivação de NF-kB, a doxiciclina pode ser administrado na água de beber (2 mg / ml com 2,5% de sacarose) durante pelo menos 14 dias. </li></ol> 2. Padrão espacial Separação-Barnes Maze (SPS-BM) <ol><li> Todos os testes de comportamento deve ser realizada de acordo com as diretrizes internacionais e locais. </li><li> IMPORTANTE! Use apenas camundongos machos com idade de seis meses ou mais. A diferença de idade entre os animais de uma série de testes deve ser inferior a quatro dias. O teste deve ser realizado pelo mesmo operador para cada uma das séries. Os ratos devem receber uma dieta padrão antes do teste para aumentar ainda mais a motivação parcialmente conduzido por quantorecompensa alimentar weet. </li><li> Defina-se uma placa circular branco feito de plástico duro (120 centímetros de diâmetro, ver Figura 5A) em um e humidade ambiente com temperatura controlada (22 ° C), iluminado com pelo menos 4 x 80 W e 3 x 215 lâmpadas fluorescentes W néon . IMPORTANTE! Garantir a iluminação correta é usado, como a motivação dos ratos para entrar nas casas dos alimentos é parcialmente impulsionado por sua aversão a brilhantes, locais expostos. </li><li> Configure o sistema de vídeo-monitoramento. A câmara deve ser colocado 115 centimetros acima do centro da placa (ver Figura 5A). </li><li> Anexar multicoloridas pistas extra-labirinto (CEM) em um pano de cor branca em posições facilmente visíveis para os animais, cerca de 100 cm da borda da placa (ver Figura 5A). </li><li> Limpe cuidadosamente a placa com um desinfectante rápido que pode remover qualquer odor do experimental set-up. </li><li> Coloque sete casas idênticas amarelas de alimentos (12 cm x 7 cm x 8 cm, ver Figura 5A </strong&gt;) na placa branca. As posições devem ser marcadas de forma inequívoca (ver Figura 5A). </li><li> Coloque doces recompensas da pelota de alimentos (um quarto de uma casa Froot Curva / comida Kellogs `s) dentro de todas as casas de comida em posições definidas (ver Figura 5A), com apenas uma casa comida definido ser de livre acesso ao animal (localização F, ver figura 5A ). Feche as casas de alimentos não-alvo com folha transparente. </li><li> Antes do ensaio, realizar habituação (um dia antes de iniciar o trabalho). Fazer todos os estabelecimentos de comida livremente acessível e permitir que os ratinhos a explorar livremente o labirinto e para recuperar uma recompensa alimentar pelete (10 min / animal). </li><li> Ligue o computador ea câmara e iniciar o software do sistema de vídeo-monitoramento. </li><li> Inicie a gravação. </li><li> Colocar o animal no ponto inicial definida na placa circular (Figura 5A, S: a posição de partida) e permitir que os ratinhos procurar a casa comida alvo durante 10 min. </li><li> Stop-tracking o vídeo. </li><li> IMPORTANTE! Limpe a placa circular e as casas de comida depois de cada ensaio com desinfectante rápido. </li><li> Repetir o teste diariamente durante sete dias consecutivos (por cada animal). </li><li> Analisar os resultados (latência, distância percorrida e erros) usando o software estatísticas apropriadas. Definir erros como se aproximar da casa comida errada e / ou contato com a caixa adequada, sem entrar e recuperar a recompensa pellet alimentos. Para a análise agrupada usar two-way ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni. </li><li> (OPCIONAL) Sacrifício dos ratinhos e analisar o hipocampo, como descrito abaixo. </li></ol> 3. BrdU Labeling <ol><li> Injectar por via intraperitoneal de 50 mg / kg ip de BrdU uma vez por dia durante 3 dias (análise de diferenciação e integração) ou ip de 200 mg / kg para uma única injecção (análise de proliferação). </li><li> Sacrifício dos animais, dissecar o hipocampo e preparar 40 mM secções, conforme descrito abaixo. </li><li> Desnaturar asecções com 2 M de HCl durante 10 minutos e incubar em tampão de borato 0,1 M durante 10 min. </li><li> Rotular uma série de um em doze dos 40 mM secções (240 uM) para além de cada animal imuno-histoquímica, tal como descrito a seguir, utilizando anticorpos dirigidos contra a BrdU. </li><li> Quantificar as células marcadas por análise de microscopia confocal em toda a extensão do rostro-caudal da camada de células granulares e zona subgranular. Multiplica os números resultantes por 12 para obter o número total estimado de células marcadas com BrdU por hipocampo e dividir por dois, para obter o número total de células marcadas por DG. </li></ol> 4. Remoção dos cérebros e Preparação de Cortes congelados de Nonperfused Animais <ol><li> Observe os procedimentos aprovados localmente para eutanásia de animais. Os ratinhos podem ser directamente submetidos à eutanásia por deslocamento cervical. </li><li> (Opcional) Os animais podem ser anestesiados antes de eutanásia de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais, por exemplo, inje intraperitonealcção de 0,8 ml Avertin para um 33 g de rato (feito recentemente pela mistura de 150 ml de solução estoque feito de 2,2 mg de 2,2,2-tribromoetanol em 1 ml de etanol isoamyl com 1,85 ml de tampão de soro fisiológico ou). </li><li> Esterilizar a cabeça com Betadine (10% iodopovidona)-gaze embebida e cotonete posteriormente com gaze embebida em álcool 70%. </li><li> Decapitar o animal usando uma tesoura cirúrgica apropriados e puxar a pele de lado. </li><li> (Opcional) Fixadores pode ser aplicada para evitar a dobragem para trás da pele retardado. </li><li> Faça uma incisão na linha média no crânio e puxe cuidadosamente os fragmentos do crânio de lado. </li><li> Retire cuidadosamente todo o cérebro através de um instrumento cirúrgico apropriado (por exemplo, Moria Colher). </li><li> Precool 25 ml de 2-metilbutano numa proveta de 50 ml (por exemplo, Duran de Schott) a -30 a -40 ° C em gelo seco. Nota: Para a coloração de livre flutuação das seções &quot;grossas&quot;, que são ideais para a microscopia confocal a laser, remova cérebro, lavar 3vezes, em tampão e armazenar a 4 ° C em tampão fosfato solução de sacarose a 30% em 50 ml tubo até cérebro afundado para baixo (tipicamente durante a noite). </li><li> Com cuidado, coloque cérebro em um pedaço de Nescofilm (Parafilm) e cubra com uma ampla quantidade de composto TissueTek outubro, congelar em Nescofilm em 2-metilbutano, armazenar a -80 ° C até o uso. Nota: Para o armazenamento de longo prazo a -20 ° C em armazenamento de 9% de sacarose, 7 mM de MgCl2, 50 mM de tampão fosfato, 44% de glicerol. </li><li> Corte o cérebro em 10-12 mm de espessura sobre cryomicrotome apropriado. Nota: Para, seções flutuantes grossas, congelar cérebro em cryotome fase de cryotome apropriado (por exemplo Reichert Jung, Frigomobil.) E corte 40 mM seções horizontais a -20 ° e - 25 ° C. Colete seções de faca com pincel fino e recolher em tampão ou manter em solução de armazenamento (passo 4.9) a -20 ° C para armazenamento de longo prazo. </li><li> Monte cuidadosamente duas fatias em lâminas de microscópio simples. A nóse de lâminas Superfrost Ultraplus é altamente recomendado para maximizar a adesão das seções. </li><li> Secam-se as lâminas durante 5 min à temperatura ambiente. As lâminas podem ser armazenadas a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol> 5. Preparação das Seções de perfusão Animais <ol><li> Anestesiar os animais como descrito acima (passo 4.2). </li><li> Aspergir cuidadosamente o animal transcardialmente com tampão fosfato salino (PBS) contendo heparina (0,025 g/100 ml de PBS) e procaína (0,5 g/100 ml de PBS) durante 2-4 min, seguido por paraformaldeído a 4% em PBS durante 10-15 min . A perfusão é optimamente realizada irrigando através do ventrículo esquerdo e abertura do átrio direito com uma pressão hidrostática de cerca de 1,2-1,4 m ou utilizando uma bomba peristáltica definido para aproximadamente 15 ml / min. Resultados de perfusão ideal em um cérebro branco pálido, sem vasos sanguíneos vermelhos sendo visível. </li><li> Dissecar e pós-corrigir os cérebros em paraformaldeído a 4% a 4 ° C durante 24 hr. </li><li> Cryoproteger os cérebros em 30% de sacarose em PBS a 4 ° C durante pelo menos 24 horas. </li><li> Congelar os cérebros no palco cryotome. </li><li> Prepare 40 mM seções horizontais de forebrains inteiras usando uma cryotome apropriado. </li><li> As lâminas podem ser armazenadas em solução de crioprotector (tampão fosfato 0,1 M, 50% glicerol, 0,14% de MgCl 2, 8,6% de sacarose), a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol> 6. Imunohistoquímica de seções do cérebro de Nonperfused Animais <ol><li> Pós-corrigir os criocortes, preparadas como descrito acima, usando -20 ° C metanol frio durante 10 min. </li><li> Bloco com 5% de soro normal contendo 0,3% de Triton-X (a partir das espécies que foram utilizados para aumentar o anticorpo secundário) durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar 3x com PBS 1x e incubar com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar 3x com PBS 1x e incubar com anticorpos secundários, à temperatura ambiente durante uma hora. </li><li> Lavar 3x com PBS 1x </li><li> Counterstain seção de DNA usando SYTOX verde, ou DAPI (ou um corante DNA alternativa). </li><li> Lavar 3x com PBS 1x </li><li> Incorporar as seções em um meio aquoso a incorporação. </li><li> Deixe o meio incorporar polimerizar por pelo menos 48 horas. </li></ol> 7. Imunohistoquímica de seções do cérebro de animais perfundidos <ol><li> Bloco tal como descrito no passo 6.2 e subsequentemente incuba-se as secções de cérebro fixadas em solução de anticorpo primário diluído em PBS contendo 0,3% de Triton-X (flutuante) durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar três vezes com PBS 1x e incubar em solução de anticorpo secundário diluído em PBS contendo 0,3% de Triton-X (livre flutuante) à temperatura ambiente durante 3 hr. </li><li> Lavar 3x com PBS 1x </li><li> Contracorante seção de DNA usando SYTOX verde ou DAPI (ou um corante DNA alternativa). </li><li> Lavar três vezes com PBS 1x </li><li> Incorporar as seções em um meio aquoso a incorporação. </li><li> Deixe o meio de fixação para polimerizar umt menos de 48 horas. </li></ol> 8. Investigação de Projeções Mossy Fibra <ol><li> Sacrifício dos animais, preparar 40 mM secções coronais como descritos acima e manchar a secção de hipocampo utilizando o anticorpo para neurofilamento M. </li><li> Digitalizar as seções no comprimento de onda apropriado, usando um microscópio de varredura a laser confocal para visualizar fibras musgosas e núcleos. Inicie a digitalização em baixa ampliação. </li><li> Utilize as imagens de baixa ampliação para orientação e atingir o hipocampo com as projeções de fibras musgosas. </li><li> Digitalize as seções (z-seccionamento) em alta resolução e alta ampliação. </li><li> Analisar o aspecto morfológico e conectividade das fibras musgosas visualizadas através de coloração para NF-M. </li><li> (OPCIONAL) Analisar o tamanho e volume de lâminas do hipocampo. Usar o sinal de ADN para as medições. </li></ol> 9. Fluoro-Jade C Assay (Neuronal morte celular) <ol><li> Sacrificar os animais, dissecar o hippocAmpus, e preparar 12 mM secções como descritos acima. </li><li> Deixe as secções de secar durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Corrigir as seções em PFA 4% por 40 min em temperatura ambiente. </li><li> Lava-se rapidamente as secções 3 vezes com ddH 2 O. </li><li> Incubar as seções com 0,06% de permanganato de potássio (KMnO 4) por 10 min sob contínua agitação suave. </li><li> Lavar as seções 3x com DDH 2 O. </li><li> Incubar as secções com 0,002% Fluoro-Jade solução C, durante 20 minutos à temperatura ambiente. </li><li> (Opcional) para colorações nucleares simultâneas, uma solução de 0,002% Fluoro-Jade C pode ser suplementado com 10 ug / ml de DAPI. </li><li> Lava-se rapidamente as secções 3 vezes com ddH 2 O. </li><li> Deixe as secções de secar durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Incubar as seções com xileno (1 min) </li><li> Monte as seções usando um meio de montagem com base em xileno (DPX). </li></ol>

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Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Neurogênese adulta, ea possibilidade de sua manipulação através da inibição do NF-kB nos neurônios, e sua reativação posterior através doxiciclina, oferece um sistema fascinante para as investigações sobre os neurônios recém-nascidos no cérebro adulto, bem como em neuronal de-e re-geração . A beleza desse sistema é que a inibição de NF-kB via de sinalização nos neurônios não só resulta em mudanças na morte neuronal, proliferação e migração de células progenitoras, e as mudanças estruturai...

Ontologicamente, o hipocampo é um dos mais antigos estruturas anatómicas cerebrais conhecidos. Ele é responsável por diversas tarefas complexas, tais como funções fundamentais na regulação da memória de longo prazo, a orientação espacial ea formação e consolidação da respectiva memória. Anatomicamente, o hipocampo é constituído por camadas de células piramidais (estrato piramidal), incluindo o cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3, e CA4) e regiões do giro dentado (gyrus dentatus), que contém as células granulares e alguns progenitores neuronais dentro da sua zona subgranular . As células granulares projectar em direcção à região CA3 através das ditas fibras musgosas (axónios de células granulares). Até o final do século passado, cérebro de mamíferos adultos se acreditava ser um órgão estático falta plasticidade celular e neurogênese. No entanto, durante as duas últimas décadas, uma quantidade crescente de evidências demonstra claramente a neurogênese adulta ocorrendo em pelo menosduas regiões do cérebro, da zona subventricular (SVZ) e a zona subgranular do hipocampo. Nossos estudos anteriores, e das de outros grupos, têm mostrado que o fator de transcrição NF-kB é um dos reguladores moleculares cruciais da neurogênese adulta, e que os seus resultados de-regulação em defeitos estruturais do hipocampo graves e deficiências cognitivas 1-6. NF-B é o nome genérico de um factor de transcrição indutível composto por diferentes combinações diméricos de cinco subunidades de ligação ao ADN: p50, p52, c-Rel, RelB, e p65 (RelA), o último dos quais tem três domínios de transactivação. Dentro do cérebro, a forma mais abundante encontrada no citoplasma é um heterodímero de p50 e p65, que é mantido sob uma forma inactiva, por inibidor de kappa B (IkB)-proteínas. Para estudar e manipular diretamente neurogênese NF-kB-driven, usamos modelos de camundongos transgênicos para permitir simples inibição de toda a subun NF-kBsua, especificamente no cérebro anterior 7 (ver Figura 1). Para este fim, nós Cruzado as seguintes linhas camundongo transgênico, IkB / - e -/tTA. O transgênico IkB / - linha foi gerada usando um mutante negativo trans-dominante do NF-kB-inibidor IκBa (super-repressor IκBa-AA1) 8. Em contraste com o do tipo selvagem IκBα, IκBα-AA1 tem dois resíduos de serina mutados para alaninas (V32 e V36), os quais impedem a fosforilação e subsequente degradação proteosomal do inibidor. Para prosencéfalo expressão específica do neurônio do IκBa-AA1-transgene, IkB / - ratos foram cruzadas com ratos abrigar uma quinase cálcio-calmodulina-dependente IIα (CAMKIIα)-promotor que pode ser conduzido por tetraciclina trans-ativador (ATT) 9. p65 camundongos knock-out ter um fenótipo letal embrionário, devido à maciça apoptose hepática 10, então a abordagem mostrada aqui fornece um método elegantepara investigar o papel do NF-kB em pós-natal e neurogênese adulta. O teste comportamental clássica para estudar a aprendizagem espacial ea memória foi descrita em 1980 por Richard Morris, um teste conhecido como a água-labirinto Morris (MWM) 11. Neste campo aberto água-labirinto, os animais aprendem a escapar da água opaca sobre uma plataforma escondida com base na orientação e extra-labirinto pistas. Uma variante de seco da MWM é o chamado labirinto Barnes (BM) 12. Este teste utiliza uma placa circular com 20 orifícios circulares dispostas na fronteira de uma placa com um furo definida como uma caixa de fuga, e visuais pistas extra-labirinto de orientação. Ambos os paradigmas experimentais dependem do comportamento de fuga induzido por um roedor `s aversão à água, ou espaços abertos, brilhantemente iluminados. Ambos os testes permitem que uma investigação de orientação espacial, eo desempenho da memória relacionada. Embora o hipocampo desempenha um papel em geral e fundamental na formação da memória espacial, o hipocampo rEGIÕES envolvidos diferem dependendo do teste aplicado. A memória testada em BM surge da atividade neuronal entre o córtex enthorinal (CE) e os neurônios piramidais localizados no CA1-região do hipocampo, sem uma contribuição da DG 13-16. Em particular, o clássico BM depende principalmente da sua navegação através da via temporo-ammonic monossináptico de CE III CA1 para CE V. Mais importante, o DG é crucialmente envolvido no chamado reconhecimento do padrão espacial 17, o que implica não só o tratamento de informação visual e espacial, mas também a transformação das representações ou memórias semelhantes em diferentes representações, não sobrepostas. Esta tarefa exige um circuito tri-sináptico funcional do CE II DG para CA3 para CA1 e CE VI, que não podem ser testados na BM 15. Para enfrentar esses desafios, nós planejamos SPS-BM como um teste comportamental para testar especificamente o desempenho cognitivo denteado dependente de giro em control animais, e no modelo de super-repressora de IkB / tTA a inibição do NF-kB. Importante, em contraste com a MWM ou o BM, o SPS-BM pode revelar déficits comportamentais sutis resultantes da diminuição da neurogênese. Desde espacial-padrão de separação é estritamente dependentes de um circuito funcional entre EC II e DG e CA3 e CA1 e CE VI, este teste é altamente sensível a mudanças potenciais na neurogênese, modificações da via fibra de musgo ou alterações de homeostase do tecido dentro do DG. Tecnicamente, a configuração do nosso teste baseia-se no estudo de Clelland et al., Em que o padrão de separação espacial foi testado utilizando uma madeira de 8 braços do labirinto radial do braço (RAM) 19. Em nossa modificado set-up, os oito braços foram substituídos por sete casas amarelas idênticas alimentos. Em resumo, os métodos mostrados aqui, incluindo a análise de células que expressam doublecortin (DCX +) dentro do hipocampo, as projeções de fibras musgosas, neuronal de células deatletas e, particularmente, o SPS-BM apresentado aqui, pode ser aplicado a investigações de outros modelos de mouse incorporando transgenes que têm um impacto sobre a neurogênese adulta. Outras aplicações podem incluir o estudo de agentes farmacológicos e medir o seu impacto sobre a separação padrão DG e espacial.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="872">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Moria MC17 Perforated Spoon&#160;</td>
			<td style="width:127px;">FST</td>
			<td style="width:132px;">10370-18</td>
			<td style="width:167px;">removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi SV8</td>
			<td>removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical scissors&#160;</td>
			<td style="width:127px;">FST</td>
			<td>14084-08</td>
			<td>removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical scissors&#160;</td>
			<td style="width:127px;">FST</td>
			<td>14381-43</td>
			<td>removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 forceps</td>
			<td style="width:127px;">FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">SuperFrost Slides</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td align="right">1879</td>
			<td>slides for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">TissueTek OCT compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td style="width:132px;">1004200018</td>
			<td>embedding of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:447px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:127px;">Jackson Immunolabs</td>
			<td style="width:132px;">005-000-001</td>
			<td>blocking in IHC</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:447px;">Normal Rabbit Serum</td>
			<td style="width:127px;">Jackson Immunolabs</td>
			<td style="width:132px;">011-000-001</td>
			<td>blocking in IHC</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td style="width:127px;">Jackson Immunolabs</td>
			<td style="width:132px;">017-000-001</td>
			<td>blocking in IHC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Neurofilament-M antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>2H3</td>
			<td>IHC, Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-doublecortin&#160;antibody</td>
			<td>sc-8066</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>IHC, Dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">anti-GFP antibody</td>
			<td>ab290</td>
			<td>abcam</td>
			<td>IHC, Dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">anti-BrdU antibody</td>
			<td>OBT0030G</td>
			<td>Accurate Chemicals</td>
			<td>IHC, Dilution 1:2000&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Fluoro Jade-C</td>
			<td>FJ-C</td>
			<td>HistoChem</td>
			<td>Determination of neuronal cell death</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Betadine</td>
			<td style="width:127px;">&#160;MUNDIPHARMA</td>
			<td>D08AG02&#160;</td>
			<td>disinfectant</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cryomicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1900</td>
			<td>preparation of brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">H3393</td>
			<td>perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm)</td>
			<td style="width:127px;">lab made</td>
			<td style="width:132px;">none</td>
			<td>plate for SPS-BM, diameter 120cm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buraton rapid disinfectant&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Sch&#252;lke &#38; Mayr</td>
			<td style="width:132px;">113 911</td>
			<td>disinfectant</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2</td>
			<td>tse systems</td>
			<td style="width:132px;">302050-SW-KIT</td>
			<td>tracking and analysis of SPS-BM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>permeabilisation/IHC</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:447px;">cryotome</td>
			<td style="width:127px;">Reichert&#160; Jung/Leica</td>
			<td style="width:132px;">Frigomobil 1206</td>
			<td>preparation of 40&#181;m brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Mowiol 4-88</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth&#160;</td>
			<td>Art.-Nr. 0713</td>
			<td>embedding of the slides</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">SYTOX green</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td>S7020</td>
			<td>Nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Food pellets (Kellog`s Froot Loops)</td>
			<td>Kellog`s</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>SPS-BM</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:447px;">Prism, Version 3.0</td>
			<td style="width:127px;">Graph Pad Software, San Diego, USA&#160;</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>Statistical evaluation of SPS-BM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Zen 2008 or Zen 2011 Software</td>
			<td style="width:127px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>Software (Confocal microscope)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">D.P.X</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">317616</td>
			<td>mounting medium for Fluoro Jade C staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the modulation and analysis of nf-&#954;b-dependent adult neurogenesis

O hipocampo desempenha um papel fundamental na formação e consolidação de memórias episódicas, e na orientação espacial. Historicamente, o hipocampo adulto foi visto como uma região anatómica muito estático do cérebro de mamíferos. No entanto, resultados recentes demonstraram que o giro denteado do hipocampo é uma área de grande plasticidade em adultos, que envolva não apenas modificações de circuitos neuronais existentes, mas também a neurogénese adulto. Esta plasticidade é regulada por redes complexas de transcrição, em que o factor de transcrição NF-kB desempenha um papel proeminente. Para estudar e manipular neurogenesis adulto, um modelo de ratinho transgénico para-específica do cérebro anterior inibição neuronal da actividade de NF-kB pode ser usado. Neste estudo, são descritos métodos para a análise da neurogénese NF-kB-dependentes, incluindo os seus aspectos estruturais, apoptose neuronal e a proliferação de células progenitoras, e significância cognitiva, which foi especificamente avaliada através de um giro denteado (DG) dependente teste comportamental, o padrão de separação espacial-Barnes labirinto (SPS-BM). O protocolo SPS-BM poderia ser simplesmente adaptados para uso com outros modelos animais transgênicos destinados a avaliar a influência de genes específicos em neurogênese adulta. Além disso, o SPS-BM poderia ser usado em outras configurações experimentais com vista a investigar e manipular aprendizagem DG-dependentes, por exemplo, por meio de agentes farmacológicos.

-Cruzamento das IkB / - linhas de camundongo transgênico e tTA leva à inibição condicional da atividade de NF-kB no hipocampo. Para investigar a expressão de a-AA1-IκBα transgene no ratinho transgénico duplo (Figura 1A), os cérebros foram isolados, cryosectioned e coradas utilizando um anticorpo contra a GFP (proteína fluorescente verde). A microscopia de varrimento de laser confocal revelou elevada expressão do transgene nas regiões CA1 e CA3, e...

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Methods for the Modulation and Analysis of NF-&amp;#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Os métodos para a manipulação e análise de NF-kB-dependente neurogenesis adulto hipocampo são descritos. Um protocolo detalhado é apresentado para o teste de comportamento dependente do giro dentado (denominado o padrão de separação espacial-Barnes labirinto) para a investigação dos resultados cognitivos em ratos. Esta técnica também deve ajudar a permitir investigações em outras configurações experimentais.

Os métodos para a modulação e Análise de NF-kB-dependente Adulto Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

methods-for-modulation-analysis-nf-b-dependent-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

14.2K visualizações.  University of Bielefeld.  Os métodos para a manipulação e análise de NF-kB-dependente neurogenesis adulto hipocampo são descritos. Um protocolo detalhado é apresentado para o teste de comportamento dependente do giro dentado (denominado o padrão de separação espacial-Barnes labirinto) para a investigação dos resultados cognitivos em ratos. Esta técnica também deve ajudar a permitir investigações em outras configurações experimentais. 

Vídeo: Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). Animal models are necessary for studying the etiopathology and potential therapies of cerebrovascular diseases. Imaging the vasculature in large animals is relatively easy. However, developing vessel imaging methods of murine brain disease models is desirable due to the cost and availability of genetically-modified mouse lines. Imaging the murine cerebral vascular tree is a challenge. In humans and larger animals, the gold standard for assessing the angioarchitecture at the macrovascular (conductance) level is x-ray catheter contrast-based angiography, a method not suited for small rodents.
In this article, we present a method of cerebrovascular casting that produces a durable skeleton of the entire vascular bed, including arteries, veins, and capillaries that may be analyzed using many different modalities. Complete casting of the microvessels of the mouse cerebrovasculature can be difficult; however, these challenges are addressed in this step-by-step protocol. Through intracardial perfusion of the vascular casting material, all vessels of the body are casted. The brain can then be removed and clarified using the organic solvent methyl salicylate. Three dimensional imaging of the brain blood vessels can be visualized simply and inexpensively with any conventional brightfield microscope or dissecting microscope. The casted cerebrovasculature can also be imaged and quantified using micro-computed tomography (micro-CT)1. In addition, after being imaged, the casted brain can be embedded in paraffin for histological analysis.
The benefit of this vascular casting method as compared to other techniques is its broad adaptation to various analytic tools, including brightfield microscopic analysis, CT scanning due to the radiopaque characteristic of the material, as well as histological and immunohistochemical analysis. This efficient use of tissue can save animal usage and reduce costs. We have recently demonstrated application of this method to visualize the irregular blood vessels in a mouse model of adult BAVM at a microscopic level2, and provide additional images of the malformed vessels imaged by micro-CT scan. Although this method has drawbacks and may not be ideal for all types of analyses, it is a simple, practical technique that can be easily learned and widely applied to vascular casting of blood vessels throughout the body.

In this article, we present a simple, practical technique for cerebrovascular casting that is easy to perform and can be utilized to image the vascular tree of the adult mouse brain.

Fundição vascular cerebral do rato adulto for Imaging 3D e Análise morfológica

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Neurociência

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Interrogatório funcional do Adulto Hypothalamic Neurogenesis com Focal Radiológica Inibição

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization of various cell types. These typically proceed with the application of antibodies to bind antigens and identify cells with characteristics that are a function of the inherent biology and development. Adult hippocampal neurogenesis is a sequential process wherein a quiescent neural stem cell can become activated and proceed through stages of proliferation, differentiation, maturation and functional integration. Each phase is distinct with a characteristic morphology and upregulation of genes. Identification of these phases is important to understand the regulatory mechanisms at play and any alterations in this process that underlie the pathophysiology of debilitating disorders. Our heat-induced antigen retrieval approach improves the intensity of the signal that is detected and allows correct identification of the progenitor cell type. As discussed in this paper, it especially allows us to circumvent current problems in detection of certain progenitor cell types.

During adult hippocampal neurogenesis, a distinct set of genetic markers are expressed when a quiescent neural stem cell sequentially progresses and develops into a functionally integrated neuron in the circuit. Using heat-induced antigen retrieval, progenitor cell types that are otherwise difficult to detect are identified with improved effectiveness.

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Stab ferida ferimento do peixe-zebra adulto Telencéfalo: Um método para investigar Vertebrados Cérebro Neurogênese e Regeneração

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

A imuno-histoquímica e Rotulagem múltipla com anticorpos da espécie hospedeira Mesmas para Estudar Adulto Hippocampal Neurogênese

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

Avaliando Neurogênese Primária em<em&gt; Xenopus</em&gt; Os embriões Usando Imunomarcação

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Analisando Synaptic Modulação da<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorreceptores após exposição à luz prolongada

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

O rombencéfalo Mouse como um modelo para o estudo embrionário neurogênese

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Análise metabólica do melanogaster da drosófila Larval e adulto cérebros

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Isolamento dos núcleos de adultos da medula espinhal para a sequenciação do ARN de Single-núcleo maciçamente paralelo

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...