We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.

Zebrafish foram mantidos nas instalações do Instituto de Toxicologia e Genética (ITG) em Karlsruhe Institute of Technology (KIT) peixes. Experimentos em animais foram realizados de acordo com as normas alemãs de proteção animal e foram aprovados pelo Governo de Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Alemanha (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 &#39;Adulte Neurogenese&#39;). 1. Gerando uma facada no telencéfalo <ol><li> Anestesia <ol><li> Para preparar uma solução de estoque de tricaína (éster etílico do ácido 3-amino, também chamado de acetato de 3-aminobenzoato) utilizar 400 mg de pó tricaina e dissolvê-lo em 97,9 ml de água e 2,1 ml de tampão Tris 1 M / HCl (pH 9). Ajustar o pH a 7. Faça alíquotas de 5 ml e armazená-las a -20 ° C até utilização. </li><li> Transferir um número adequado de peixe-zebra 0,5-1 anos de idade a partir de seus tanques em gaiolas de plástico do mouse. Nota: O crânio de um peixe-zebra adulto em cerca de 12meses de idade é ainda relativamente macios e podem ser facilmente perfurado com uma agulha (ver secção 1.2.3 e Figura 1A). </li><li> Para anestesiar o peixe-zebra adultos, combinar 5 ml tricaína (solução estoque) numa gaiola de plástico com cruzamento ~ 100 ml de água do tanque de peixes limpo (concentração final de tricaina 0,02% (w / v) tricaina). </li><li> Incubar os peixes nos anestésicos até que eles não se movem mais (45-60 seg.) </li></ol></li><li> Lesão telencéfalo <ol><li> Local indivíduo anestesiado zebrafish em uma fenda em um bloco de espuma encharcada de tricaina. </li><li> Sob um microscópio de dissecação com a luz do alto segurar delicadamente o peixe com uma mão e orientá-la de uma forma que permite o acesso à cabeça de cima. </li><li> Com a outra mão empurrar uma seringa de 30 G (seringa de insulina com agulha integrado) verticalmente através do crânio na região medial de um hemisfério telencefálico (Figuras 1A-1B). Os hemisférios do telencéfalo de umre visível através do crânio. Certifique-se de que a lesão não é introduzido mais profundo do que 2 mm (Figura 1C). Nota: É altamente recomendado para introduzir a lesão sempre no mesmo hemisfério para facilitar a identificação do local da lesão quando dissecar o cérebro fora do crânio. </li><li> Depois de apresentar a lesão telencefálico, coloque o peixe em água de peixe fresco. Mantenha-se 10 peixes em uma gaiola de 2 L rato cheio de peixes de água para a recuperação e se conectar a gaiola do rato para um sistema de fluxo de água. Nota: A taxa de sobrevivência é geralmente ~ 97% se os peixes estão saudáveis ​​e sem outros experimentos foram realizados com o peixe antes. A adição de antibióticos para o peixe de água não é necessária. Após a recuperação, os peixes se comportam normalmente: eles nadam, alimentação, e companheiro. </li></ol></li></ol> 2. Analisando o efeito da lesão telencefálico <ol><li> Cérebro Dissecção e Fixação <ol><li> Re-anestesiar os peixes recuperados em diferentes pontos de tempo após a lesão (typically, 1, 3, 5, e 14 dias após a lesão (DPL)) com 0,02% (w / v) tricaina como acima e eutanásia, colocando-os em água gelada durante 5 minutos. </li><li> Coloque o peixe em um lenço de papel embebido em tampão fosfato (PBS) e separar a cabeça do corpo, cortando atrás das guelras com uma tesoura afiada. </li><li> Manter as cabeças em 1x PBS, durante 5 minutos, a fim de permitir que o sangramento. Nota: Este drena o sangue do tecido, o que pode perturbar outras medidas no protocolo. </li><li> Fixar as cabeças durante a noite a 4 ° C em paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS ou 4 horas à temperatura ambiente (RT). </li><li> Lavar as cabeças fixas duas vezes com PBS 1x numa placa de petri. </li><li> Dissecar cérebros cuidadosamente em 1x PBS sob um microscópio de dissecação 23. A lesão é normalmente visível sob o microscópio de dissecação. Cérebros sem lesão visível deve ser descartada. </li><li> Transferir os cérebros em dois tubos de reacção ml cheios com 1,5 ml de 100% de metanol (MeOH) e inverter os tubos antes da incubação de 5xlas a -20 ° C durante pelo menos 16 horas. Nota: Os cérebros pode ser mantido durante vários meses em MeOH à temperatura de -20 ° C até serem necessários para a imuno-histoquímica, ou hibridação in situ. </li></ol></li><li> Preparação de tecidos para Imunohistoquímica <ol><li> Re-hidratar os cérebros através de uma série descendente de metanol em 2 ml de tubos de plástico (sequencialmente 75% MeOH (1 x PBS, 0,1% de Tween-20 = PTW);. De 50% de MeOH, 25% de MeOH Incubar os cérebros (15 cérebros / 2 ml com tubos de reacção ) durante 5 minutos em cada solução. </li><li> Lave os cérebros em PTW durante 5 min. Repita 4x com fresco PTW. </li></ol></li><li> Incorporação dos cérebros para Seccionamento <ol><li> Para a incorporação, transferir os cérebros a partir do tubo de reacção de 2 ml em PTW para dentro das cavidades de um tabuleiro de copo de moldagem de polietileno com uma pipeta de transferência (5 mm de diâmetro). </li><li> Prepare a 2% de agarose (grau de ADN) em 1x PBS num frasco de Erlenmeyer. Aqueça no microondas a 600 W até que a agarose é dissolvido completamente. Preparar 50 ml de 10 cérebros. Vamos ªe agarose a arrefecer durante 3 minutos à temperatura ambiente antes do uso. Manter a agarose sobre um bloco de aquecimento pré-aquecida (60 ° C), enquanto que a incorporação de cérebro, a fim de evitar a solidificação. </li><li> Remover o PBS 1x do molde contendo um cérebro utilizando uma pipeta de Pasteur (1 mm de diâmetro). Tenha cuidado para não danificar o cérebro. </li><li> Despeje agarose no molde e preenchê-lo completamente. Em seguida, use uma agulha de dissecção a girar o cérebro da agarose para lavar o PTW, tornando mais fácil para incorporar o cérebro. </li><li> Oriente o cérebro de bolor lado ventral para baixo, lado dorsal para cima e colocá-lo em linha reta. </li><li> Deixe o agarose esfriar. Para resfriamento mais rápido, coloque o molde no gelo. Repetir passos. </li><li> Repetir 2.3.3-2.3.6 para todos os cérebros. </li></ol></li><li> Corte do Bloco de agarose <ol><li> Usando uma agulha de dissecação, retire o bloco de agarose. </li><li> Com uma lâmina afiada, corte a agarose na extremidade posterior do cérebro. Certifique-se que este plano é paralelo ao telencephalon. </li><li> Cortar a agarose na extremidade anterior do cérebro. Em seguida, virar o bloco de modo que esteja no plano posterior. </li><li> Remover o excesso de agarose por corte em paralelo com dorsal do cérebro e lados ventral. Em seguida, virar o cérebro de volta para que ele fique do seu lado ventral. </li><li> Cortar o bloco a um triângulo truncado, em que o telencéfalo está localizado no plano menor (Figura 2). </li></ol></li><li> Preparando o Vibratome para Seccionamento <ol><li> Prepare vibratome acordo com as instruções do fabricante. Use uma nova lâmina de barbear e substituí-lo após 10 cérebros. </li><li> Encher o banho tampão com 1x PBS para um nível que apenas atinge o fundo da lâmina. </li><li> Coloque um pequeno ponto de supercola sobre o topo do disco de amostra de vibratome. </li><li> Com cuidado, coloque o avião que está localizado posterior ao cérebro sobre a supercola. A cola vai endurecer logo que ele se encontra em contacto com o 1x PBSo banho de tampão vibratome. </li><li> Insira o disco de amostra com a amostra na bandeja de tampão usando o manipulador do micrótomo. </li><li> Use o manipulador para rodar o disco de amostra para a posição desejada. Orientar o bloco no banho de tampão de uma maneira que localiza o telencéfalo logo abaixo da superfície, com a parte dorsal da cabeça voltado para a lâmina. Em seguida, aperte o SCRW com uma chave Allen de 3 mm e remova o manipulador. Nota: O parafuso de fixação ou de um dos dispositivos de fixação não deve estar localizado sobre a abertura no disco de amostra; nestas posições de aperto do disco de amostra não é possível. </li></ol></li><li> Seccionamento do Cérebro <ol><li> Prepare uma placa de 24 poços para recolher as seções. Por cérebro a ser seccionado, preencher uma cavidade com 1 mL de tampão de bloqueio (0,1% (v / v), 10% de Tween-20, 0,2% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA), 1% (v / v) dimetil-sulfóxido (DMSO) em PBS). </li><li> Comece o corte em 50 mM espessura, 1mm / s de velocidade e freqüência de 70 Hzutilizando um micrótomo de vibração. </li><li> Use uma escova sintética (1 mm) para pegar as fatias finas de agarose como eles saem da lâmina e coletá-los na placa de 24 poços. </li></ol></li><li> Imunohistoquímica em Vibratome Seções <ol><li> Bloquear sítios de ligação não específicos durante 1 h à TA, em tampão (0,1% (v / v), 10% de Tween 20, 0,2% (w / v) de BSA, 1% (v / v) de DMSO em PBS) de bloqueio. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 250 ul de anticorpo diluído em tampão de bloqueio, durante a noite a 4 ° C. Alternativamente, a incubação do anticorpo primário durante 2 horas à temperatura ambiente. Em seguida, lave 3x por 10 min em PTW. Nota: Para a coloração PCNA usar uma diluição 1:400 (mouse anti-PCNA Para mais detalhes veja a tabela de materiais.). Os anticorpos primários múltiplos podem ser incubadas, ao mesmo tempo. </li><li> Incubar as secções em anticorpo secundário durante 2 h à RT, em seguida, lavar 3x durante 10 minutos em PTW. Nota: 1:1.000 diluição em PTW, para o detalhe veja tabela de materiais. Anticorpos secundários múltiplos podem ser incubadas, ao mesmo tempo. </li><li&gt; Opcional: Os melhores resultados são observados quando as secções são mantidas em PTW durante a noite a 4 ° C, a fim de permitir uma lavagem de anticorpos secundários não-especificamente ligadas. Neste caso, substitua o PTW, mais uma vez antes da montagem. </li></ol></li><li> RNA cérebro adulto in situ Hybridization (alternativamente para imuno-histoquímica) <ol><li> Cérebro Dissecção e Fixação (mesmo procedimento que para imuno-histoquímica): <ol><li> Hibridização de sonda. </li><li> Rehidratar cérebros em dois tubos de reacção ml como descrito por imuno-histoquímica. </li><li> Incubar cérebros em proteinase K (ProtK;. 10 ug / ml de concentração final) em PTW durante 30 min. Após o tempo de incubação remover ProtK / PTW e fixar os cérebros novamente durante 20 min em BT-Fix (PFA a 4%, 4% de sacarose, 0.12 mM de CaCl2, 77 mM de Na 2 HPO 4, 23 mM de NaH 2 PO 4). </li><li> Lavar cérebros 5x durante 5 minutos em PTW (0,1% (v / v) de Tween-20 em PBS). </li><li> Remover PTW e lave o cérebro em 500 mLTampão HYB (50% (v / v) de formamida desionizada, 5x SSC, 500 ug / ml de tRNA de levedura, 50 ug / ml de heparina, 0,1% de Tween-20, 9 mM citricacid). Espere até que o cérebro afundar para o fundo do tubo, em seguida, descartar o sobrenadante e adicionar 500 ul de tampão HYB limpo e incubar a 65-70 ° C durante 3-4 horas. </li><li> Dilui-se a sonda de RNA de 1:200 ou 1:400 (dependendo da sonda) em 400 ul de volume final de tampão HYB. Aquece-se a sonda de RNA diluído a 70 ° C durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante a partir de cérebros e adicionar a sonda de RNA, incuba-se a 65-70 ° C (S / N). Todas as soluções-tampão de lavagem deve ser pré-aquecida e mantida a 70 ° C. </li></ol></li><li> Labeling <ol><li> Lave os cérebros a 65-70 ° C (durante todas as quatro fases de lavagem) com 500 ul de tampão de lavagem 1 (50% de formamida, 1 x SSC, 0,05% Tween 20), duas vezes, durante 30 min. Substituir um tampão por tampão de 2 (2 x SSC, 0,1% de Tween 20), e incubar durante 15 min. Remover o tampão de lavagem 2 e cérebros em tampão 3 (0,2 x SSC, 0,1% de Tween 20) for 30 min, repita este passo 2 duas vezes. Substituir tampão 3 por intermédio 4 (0,1 x SSC, 0,05% de Tween 20 em PTW), incubar durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante e lava-se durante 5 minutos em 500 ul de PTW à TA. </li><li> Cérebros incorporar em agarose a 2% (em PBS 1x) e cortar secções vibratome (50-100 um), como descrito para a imuno-histoquímica. </li><li> Lavar 1x durante 5 minutos em 500 ul de tampão de bloqueio (1 x PBS, 0,1% de Tween-20, 0,2% (w / v) de BSA, 1% (v / v) DMSO). </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 500 ul de tampão de bloqueio durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 300 ul de anti-Dig anticorpo acoplado a AP diluída 1:4.000 em tampão de bloqueio. </li><li> Incubar o / n, a 4 ° C. </li></ol></li><li> NBT / BCIP Coloração <ol><li> Lavar 5x durante 15 min com tampão de PTW à TA. </li><li> Lavar 1x em tampão de coloração. Lavar duas vezes 5 min em tampão de coloração (100 mM Tris / HCl pH 9,5, 50 mM de MgCl 2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20). </li><li> Remover o sobrenadante e mancha com 500 μl solução de coloração (3,5 ul de cloreto de tetrazólio 4-Nitroblue (NBT) e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) por 1 ml de tampão de coloração). </li><li> Pare de coloração de lavagem 3 a 5 vezes com PTW. </li></ol></li></ol></li><li> Montagem das Seções <ol><li> Montar as seções em slides usando um meio de montagem não fluorescente solúvel em água (consulte a tabela de materiais). </li><li> Mantenha os slides na geladeira a 4 ° C. Nota: A coloração é estável durante várias semanas ou mesmo meses. </li><li> Analisar os slides no âmbito de um composto ou um microscópio confocal. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+brain:+significant+answers+and+significant+questions.">Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions.</a> Neuron. 70, 687-702 (2011).</li><li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Dev Neurobiol. 72, 429-461 (2012).</li><li>Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem+cell+potential+of+glia:+lessons+from+reactive+gliosis.">The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis.</a> Nat Rev Neurosci. 12, 88-104 (2011).</li><li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation.">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32, 638-647 (2009).</li><li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult.">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Dev. 8, 3 (2013).</li><li>Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+neuronal+regeneration+in+the+central+nervous+system+of+teleost+fish.">Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the central nervous system of teleost fish.</a> Eur J Neurosci. 34, 917-929 (2011).</li><li>Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teleost+fish+as+a+model+system+to+study+successful+regeneration+of+the+central+nervous+system.">Teleost fish as a model system to study successful regeneration of the central nervous system.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 367, 193-233 (2013).</li><li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon.">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Dev Biol. 295, 278-293 (2006).</li><li>Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain:+origin,+proliferation+dynamics,+migration+and+cell+fate.">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate.</a> Dev Biol. 295, 263-277 (2006).</li><li>Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+migration,+neuronal+differentiation,+and+long-term+survival+of+new+cells+in+the+adult+zebrafish+brain.">Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain.</a> J Comp Neurol. 488, 290-319 (2005).</li><li>Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+non-mammalian+vertebrates.">Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates.</a> Bioessays. 29, 745-757 (2007).</li><li>Hinsch, K., Zupanc, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+long-term+persistence+of+new+neurons+in+the+adult+zebrafish+brain:+a+quantitative+analysis.">Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis.</a> Neuroscience. 146, 679-696 (2007).</li><li>Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+composition+of+neurogenic+periventricular+zones+in+the+adult+zebrafish+forebrain.">The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain.</a> J Comp Neurol. 520, 2275-2316 (2012).</li><li>Marz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon.">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58, 870-888 (2010).</li><li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Dev Dyn. 240, 2221-2231 (2011).</li><li>Grandel, H., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+adult+neural+stem+cell+activity+in+vertebrates.">Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates.</a> Dev Genes Evol. 223, 131-147 (2013).</li><li>Ayari, B., El Hachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon.">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> J Neurotrauma. 27, 959-972 (2010).</li><li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon:+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis.">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60, 343-357 (2011).</li><li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury.">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Dis Model Mech. 5, 200-209 (2012).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+neurogenesis+from+neural+progenitor+cells+requires+injury-induced+expression+of+Gata3.">Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3.</a> Dev Cell. 23, 1230-1237 (2012).</li><li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138, 4831-4841 (2011).</li><li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338, 1353-1356 (2012).</li><li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish.">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (37), (2010).</li><li>Shin, J., Park, H. C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+cell+fate+analysis+in+zebrafish+using+olig2+BAC+transgenics.">Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics.</a> Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).</li><li>Armant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide,+whole+mount+in+situ+analysis+of+transcriptional+regulators+in+zebrafish+embryos.">Genome-wide, whole mount in situ analysis of transcriptional regulators in zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 380, 351-362 (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Descrevemos aqui um método para induzir uma lesão telencefálico empurrando uma agulha através do crânio do peixe-zebra adulto, e analisar a reação celular e molecular para esta lesão por imuno-histoquímica e hibridização in situ. A principal vantagem desta técnica em relação a outras abordagens existentes é a sua simplicidade, rapidez e eficiência de custos. Portanto, esta técnica, que permite a produção de muitos cérebros feridas num curto período de tempo, pode ser facilmente combinada com um grande escala na tela de hibridação in situ para identificar genes com um papel na regeneração e neurogenesis. A idade do peixe-zebra adultos em que a lesão é realizada é crucial. Se o peixe estiver com mais de 1,5 anos, o crânio é muito difícil e é possível que o crânio está sendo empurrada para baixo ou fraturado em vez de forma limpa perfurado. Em contraste, nos peixes mais jovens (menores de 4 meses), ainda há um monte de neurogênese em curso, o que pode lead a resultados falsos positivos em relação a neurogênese reativa. Outro passo fundamental nesta abordagem é verificar a eficiência da facada e de excluir que os dois hemisférios são feridos. Isto pode ser monitorizado através da coloração das secções com o anticorpo anti-PCNA. Em uma lesão introduzida correctamente, PCNA deve ser significativamente sobre-regulada em apenas um dos hemisférios. É importante ter em mente que a lesão mecânica induzida vai ter vários efeitos secundários, tais como a ablação não específica de células, o aumento da morte celular por causa da degeneração secundária, inflamação e destruição da barreira sangue-cérebro, e lesão da zona ventricular e quanto uma possível consequência de fluxo do fluido cerebrospinal para o parênquima cerebral. No entanto, os peixes feridos parecem sofrer muito pouco da lesão. Dentro de 2 min eles são natação livre novamente e comportamento normal de alimentação é restaurada dentro de cerca de 4 horas. Após 3 semanas, o injury não é morfologicamente mais visível. Em nossas mãos, a partir de várias centenas de cirurgias não perdemos um único peixe, apesar do fato de que nós tivemos uma taxa de lesões 100%, avaliada pela histologia em 5 dias após a lesão. Nos últimos anos, outras técnicas, tais como as abordagens transgénicas têm sido desenvolvidos em peixes-zebra para produzir tecido ou ablação específica de células tipo 2. Embora estas técnicas são muito elegante e minimamente invasivo que se baseiam na produção de construções de ADN complexas e a criação de várias linhas de peixes-zebra transgénicos estáveis ​​que podem ser muito tediosa e morosa. Portanto, abordagens mecânicas simples, tais como o ensaio descrito no presente protocolo permanecer uma ferramenta importante para estudar a neurogénese cérebro adulto e regeneração.

Mamíferos têm uma capacidade muito limitada para gerar novos neurônios durante a vida adulta, e neurogênese adulta no cérebro é mais restrita a duas regiões telencefálicos situados na zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais, ea zona subgranular (SGZ) do dentado circunvolução do hipocampo 1. Mamíferos também não pode reparar os danos do cérebro causada por doenças neurodegenerativas, acidente vascular cerebral ou lesões, de forma eficiente. Neurónios perdidos não são substituídos e, em vez da proliferação de diferentes tipos de células gliais, incluindo os astrócitos, micróglia, oligodendrócitos e é observado. Como consequência deste processo proliferativo chamado gliose reactiva, o tecido cerebral ferido é vedada pela formação de uma cicatriz glial, que inibe a regeneração axonal neuronal e 2-4. Em contraste com os mamíferos, peixes teleósteos, como o peixe-zebra formar novos neurônios abundantemente em estágios adultos e têm um alto regenerativa e proliferative potencial para reparar lesões do sistema nervoso central 2,5-7. O cérebro adulto zebrafish contém 16 nichos de células estaminais neurais distintos que geram um grande número de novos neurónios, durante toda a vida de 8-11. Neurônios nascidos nessas zonas específicas de proliferação do cérebro adulto zebrafish migrar para suas áreas-alvo, onde eles vão amadurecer e integrar as redes neuronais existentes 8,10,12-15. Entre as zonas de progenitoras identificados em peixes-zebra adultos, a zona ventricular telencefálicos é um dos nichos de células estaminais neuronais, mais estudados. Células neste nicho progenitor pode ser classificada em três tipos distintos quanto à sua morfologia, a taxa de divisão e expressão de diferentes marcadores glial ou neuronal. Tipo I e tipo II são células da glia radial como células que possuem processos longos. Eles expressam marcadores de células-tronco, incluindo GFAP, nestin e S100β. O tipo I de células não proliferam enquanto que células do tipo II proliferate lentamente, como evidenciado pela sua expressão de marcadores de proliferação, tais como antigénio de proliferação celular nuclear (PCNA) e a incorporação de análogos desoxythymidine. As células do tipo III estão rapidamente dividindo células que estão empenhados em tornar progenitores neurais e expressar genes marcadores neurais, tais como PSA-NCAM 5,16. Embora as capacidades regenerativas de peixes teleósteos estão bem documentados, apenas poucas publicações têm descrito e investigado em detalhe os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na regeneração neuronal no telencéfalo adulto em resposta à lesão 15,17-22. Para decifrar os mecanismos implicados no adulto zebrafish regeneração do sistema nervoso central e reparação e para entender as semelhanças e as diferenças entre a neurogênese constitutiva e regenerativa, desenvolvemos um modelo de peixe-zebra de lesão telencefálico adulto. Aqui, vamos descrever visualmente como gerar uma lesão em um dos hemisph telencefálicoeres com a ajuda de uma agulha de seringa, mantendo a lateral não lesionado contralateral como controlo interno. Também vamos mostrar como monitorar mudanças sobre lesão na proliferação celular e expressão gênica por imuno-histoquímica e em ensaios de hibridização in situ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="782">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">335.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x DPBS (-/-)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14200-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30 G syringe (Omnican 40)</td>
			<td>B.Braun Melsungen</td>
			<td align="right">916162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene molding cup tray&#160;</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>17177C-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PeqGOLD Universal Agarose&#160;</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>35-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>W 2835919108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aqua Poly/Mount</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td align="right">9127.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection needle</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KX93.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td align="right">335.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Loctite 414</td>
			<td>Sch&#246;ffler und W&#246;rner</td>
			<td><a href="http://62.157.117.162/BP2NAV500/ItemDetail_NAV.aspx?ItemID=06%201362%200020">06 1362 0020</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass slides</td>
			<td>Labonord</td>
			<td align="right">5305103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slips 24 x 60 mm</td>
			<td style="width:163px;">Labonord</td>
			<td align="right">5305060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes 94 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td align="right">632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcons 15 ml</td>
			<td style="width:163px;">Greiner bio-one</td>
			<td align="right">188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td align="right">662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-S100 (1:500)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z031101-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-PCNA (1:400)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M087901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-GFP (1&#160;:1000)</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Dig AP-coupled antibody&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td align="right">11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP)&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td align="right">1383221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT)&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td align="right">1383213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1092766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene molding cup tray&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">17177C-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome VT1000S</td>
			<td>Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope Sp5 DM6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope Nikon SMZ 645</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well flat bottomed tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Falcon catalog&#160;</td>
			<td align="right">353226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Student Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Danio rerio Tg(olig2:EGFP)</td>
			<td align="right">24</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Danio rerio WT strains (e.g. AB2O2)</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration

Peixe-zebra adulto tem uma incrível capacidade de regenerar seu sistema nervoso central após a lesão. Para investigar a resposta celular e os mecanismos moleculares envolvidos no peixe-zebra adulto sistema nervoso central (SNC) de regeneração e reparo, foi desenvolvido um modelo de peixe-zebra de lesão telencefálico adulto. Nesta abordagem, podemos gerar manualmente uma lesão, empurrando uma seringa de agulha de insulina para o telencéfalo adulto zebrafish. Em diferentes dias de lesões post, peixe são sacrificados, seus cérebros são dissecados e corados por imuno-histoquímica e / ou hibridização in situ (ISH) com marcadores apropriados para observar a proliferação celular, gliogenesis e neurogênese. O hemisfério contralateral não lesionado serve como um controle interno. Este método combinado, por exemplo, com RNA profundo seqüenciamento pode ajudar a tela de novos genes com um papel em zebrafish neurogênese adulta telencéfalo, regeneração e reparo.

Usando o fluxo de trabalho descrito neste artigo, a lesão foi introduzido no hemisfério direito do telencéfalo adulto zebrafish (Figuras 1A-1B). Um ferimento correcta leva a um canal que se estende a partir da lesão dorsal para ventral através de todo o palio do telencéfalo (Figura 3C). A lesão deve ser limitada a um dos hemisférios e não devem atravessar o ventrículo medial. O canal lesão é visível com microscopia de campo claro (Figura 3C) e será curado após aproximadamente 35 dias 15. Foi anteriormente demonstrado que após o ferimento uma sobre-regulação de proliferação celular do antigénio nuclear (PCNA, Figura 3A) e S100β (Figura 3B) em 3 a 7 DPL é detectável por imuno-histoquímica 15. A coloração de PCNA e S100β é sobreposta, indicando a proliferação de células gliais radiais. Furthermore, a fim de visualizar as células precursoras de oligodendrócitos (OPCs), um ensaio de facada ferida foi realizada na Tg (olig2: EGFP) de peixe 24. Após a coloração com um anticorpo anti-GFP, a acumulação de OPCs em estreita proximidade com o canal de lesão é detectável (Figura 3D). Esse acúmulo é transitória, e os clusters OPC não são mais observadas em 35 dpl 15. Se a lesão não foi introduzida correctamente, o canal lesão não será visível, e aumento da regulação do PCNA e S100β ou acumulação de OPCs não será detectável. PCNA é o marcador mais sensível para lesões cerebrais. A fim de verificar a eficiência da facada e de excluir que os dois hemisférios são feridos, é altamente recomendável para sempre manchar as seções com um anticorpo anti-PCNA. Em uma lesão introduzida correctamente, PCNA deve ser significativamente sobre-regulada (até 4 vezes 15) em apenas um dos hemisférios. Embora na maioria dos casos, ésuficiente para usar apenas o lado não lesionado contralateral como controle interno para monitorar mudanças na expressão gênica, é altamente recomendável para comparar a expressão gênica no hemisfério controle com a expressão em hemisférios telencefálicos de cérebros de tipo selvagem. Deste modo, quaisquer efeitos sistémicos da lesão na expressão do gene que iria afectar os dois hemisférios podem ser detectados. O ensaio de golpe de feridas em combinação com uma tela de expressão sistemática de reguladores da transcrição (TRs) (25 e Schmidt et al., Não publicado) pode também ser utilizado para identificar genes de TR, com um possível papel na neurogénese e regeneração (Figuras 4A-4C). Esta abordagem foi identificado um número de factores que são expressos no telencéfalo e cuja expressão é especificamente sobre-regulada, em resposta a uma lesão (Figura 4A-C). <imgalt = &quot;Figura 1&quot; fo: Content-width = &quot;5 polegadas&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51753/51753fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 1. Representação esquemática do adulto zebrafish ferimento facada telencefálico. A) Uma agulha de seringa de insulina é empurrado através do crânio de um peixe-zebra adultos de gerar uma lesão telencefálica. A linha branca tracejada representa a fronteira entre os dois hemisférios telencefálicos ea cruz verde indica a posição do Vista dorsal facada. B) de um cérebro de peixe-zebra adulto. As principais áreas do cérebro são indicados. A cruz verde indica a posição da lesão induzida. C) A ponta da agulha, o que serve para induzir a lesão telencefálica, mede de 2 mm. Bulbo olfatório (OB), telencéfalo (tel) e tecto óptico (OT). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Srepresentação chematic de um cérebro de peixe-zebra adulto em um bloco de agarose aparadas pouco antes vibratome corte. anterior é para cima. Bulbo olfatório (OB), telencéfalo (tel), tecto óptico (ot), cerebelo (CB) e medula (m). Barra de escala: 500 mm. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Respostas regenerativas para apunhalar lesão ferida. AD) Adulto cérebro de peixe-zebra em 5 dias após a lesão (DPL). AB) O PCNA proliferativa marcador (A) e o marcador glial radial S100β (B) são sobre-regulada na zona ventricular (setas) após ferimento por arma branca. (C) O canal de lesão é visível sob iluminação de campo claro (setas). A zona ventricular é indicada pela linha verde. (D) as células precursoras de oligodendrócitos (olig2: EGPF +) se acumulam no local da lesão (setas). Barra de escala: 200 um. Em todos os painéis, o hemisfério direito é o hemisfério lesionado. Dorsal é para cima. A linha tracejada na A a D indica a fronteira entre o Pálio ea subpallium. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. Um exemplo de genes up-regulados em resposta a esfaquear lesão. Observe o forte aumento da regulação (setas) de eomesa (A, B) e sox4a (C) expressão de mRNA no hemisfério telencefálico direita (hemisfério esfaqueado) como monitorado por hibridação in situ em 5 DPL. O hemisfério esquerdo é ileso e serve como controle. (B) mostra uma maior ampliação da região telencefálico dorsal de A. Dorsal é para cima. Barra de escala: 200 mm para A e C e de 55 mm para B. Olinha tracejada na A e C indica a separação entre o Pálio ea subpallium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table><tbody><tr><td colspan="2"> SIGLAS </td></tr><tr><td> AP </td><td> Fosfatase Alcalina </td></tr><tr><td> BCIP </td><td> 5-bromo-4-cloro-3&#39;-indolyphosphate </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Albumina de soro bovino </td></tr><tr><td> CNS </td><td> Sistema nervoso central </td></tr><tr><td> Escavação </td><td> Digoxigenina </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Dimetil sulfóxido </td></tr><tr><td> dpl </td><td> Dias após a lesão </td></tr><tr><td> eomesa </td><td> Eomesodermin homólogo um </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Proteína ácida fibrilar glial </td></tr><tr><td> hr </td><td> Hora </td></tr><tr><td> HYBamortecedor </td><td> Tampão de hibridação </td></tr><tr><td> ISH </td><td> a hibridação in situ </td></tr><tr><td> MeOH </td><td> Metanol </td></tr><tr><td> NBT </td><td> Nitro-azul de tetrazólio </td></tr><tr><td> OPCs </td><td> As células precursoras de oligodendrócitos </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Salina tamponada com fosfato </td></tr><tr><td> PCNA </td><td> Antígeno nuclear de proliferação celular </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Paraformaldeído </td></tr><tr><td> ProtK </td><td> Proteinase K </td></tr><tr><td> PSA-NCAM </td><td> Molécula de adesão celular neuronal polissialilados </td></tr><tr><td> PTW </td><td> PBS, 0,1% de Tween-20 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> Ácido ribonucléico </td></tr><tr><td> RT </td><td> A temperatura ambiente </td></tr><tr><td> SGZ </td><td> Zona subgranular </td></tr><tr><td> sox4a </td><td> SRY-box contendo 4a gene</td></tr><tr><td> SSC </td><td> Citrato de sódio salino </td></tr><tr><td> ZSV </td><td> Zona subventricular </td></tr><tr><td> TRs </td><td> Reguladores de transcrição </td></tr></tbody></table>

Watch this Scientific Journal Video about Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration at JoVE.com

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Stab ferida ferimento do peixe-zebra adulto Telencéfalo: Um método para investigar Vertebrados Cérebro Neurogênese e Regeneração

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

stab-wound-injury-zebrafish-adult-telencephalon-method-to-investigate

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

The Nervous System and Nervous Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

15.3K visualizações.  Karlsruhe Institute of Technology. To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Vídeo: Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

Cirurgia estereotáxica para lesão excitotóxica de áreas específicas do cérebro do rato adulto

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Neurociência

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Micromanipulação de expressão gênica no cérebro adulto Zebrafish Usando microinjeção Cerebroventricular de Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Interrogatório funcional do Adulto Hypothalamic Neurogenesis com Focal Radiológica Inibição

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization of various cell types. These typically proceed with the application of antibodies to bind antigens and identify cells with characteristics that are a function of the inherent biology and development. Adult hippocampal neurogenesis is a sequential process wherein a quiescent neural stem cell can become activated and proceed through stages of proliferation, differentiation, maturation and functional integration. Each phase is distinct with a characteristic morphology and upregulation of genes. Identification of these phases is important to understand the regulatory mechanisms at play and any alterations in this process that underlie the pathophysiology of debilitating disorders. Our heat-induced antigen retrieval approach improves the intensity of the signal that is detected and allows correct identification of the progenitor cell type. As discussed in this paper, it especially allows us to circumvent current problems in detection of certain progenitor cell types.

During adult hippocampal neurogenesis, a distinct set of genetic markers are expressed when a quiescent neural stem cell sequentially progresses and develops into a functionally integrated neuron in the circuit. Using heat-induced antigen retrieval, progenitor cell types that are otherwise difficult to detect are identified with improved effectiveness.

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult hippocampus has been viewed as a very static anatomical region of the mammalian brain. However, recent findings have demonstrated that the dentate gyrus of the hippocampus is an area of tremendous plasticity in adults, involving not only modifications of existing neuronal circuits, but also adult neurogenesis. This plasticity is regulated by complex transcriptional networks, in which the transcription factor NF-&#954;B plays a prominent role. To study and manipulate adult neurogenesis, a transgenic mouse model for forebrain-specific neuronal inhibition of NF-&#954;B activity can be used.
In this study, methods are described for the analysis of NF-&#954;B-dependent neurogenesis, including its structural aspects, neuronal apoptosis and progenitor proliferation, and cognitive significance, which was specifically assessed via a dentate gyrus (DG)-dependent behavioral test, the spatial pattern separation-Barnes maze (SPS-BM). The SPS-BM protocol could be simply adapted for use with other transgenic animal models designed to assess the influence of particular genes on adult hippocampal neurogenesis. Furthermore, SPS-BM could be used in other experimental settings aimed at investigating and manipulating DG-dependent learning, for example, using pharmacological agents.

Methods for the manipulation and analysis of NF-&#954;B-dependent adult hippocampal neurogenesis are described. A detailed protocol is presented for a dentate gyrus-dependent behavioral test (termed the spatial pattern separation-Barnes maze) for the investigation of cognitive outcome in mice. This technique should also help enable investigations in other experimental settings.

Os métodos para a modulação e Análise de NF-kB-dependente Adulto Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, photoreceptor degeneration triggers M&#252;ller glial cells to re-enter the cell cycle and produce transient-amplifying progenitors. These progenitors continue to proliferate as they migrate to the damaged area, where they ultimately give rise to new photoreceptors. Currently, there are two widely-used LIRD paradigms, each of which results in varying degrees of photoreceptor loss and corresponding differences in the regeneration response. As more genetic and pharmacological tools are available to test the role of individual genes of interest during regeneration, there is a need to develop a robust LIRD paradigm. Here we describe a LIRD protocol that results in widespread and consistent loss of both rod and cone photoreceptors in which we have combined the use of two previously established LIRD techniques. Furthermore, this protocol can be extended for use in pigmented animals, which eliminates the need to maintain transgenic lines of interest on the albino background for LIRD studies.

Multiple light damage protocols have been described to damage photoreceptors and consequently induce a retinal regeneration response in adult zebrafish. This protocol describes an improved method that can be used in pigmented animals and that damages the vast majority of rod and cone photoreceptors across the entire retina.

A Light Novel danos Paradigma para uso em estudos de regeneração da retina em Zebrafish Adulto

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Gravação eletrofisiológica no cérebro de Intacta Zebrafish Adulto

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies using Drosophila have contributed important breakthroughs in understanding neurological processes. Thus, with the goal of understanding the cellular and molecular basis of TBI pathologies in humans, we developed the High Impact Trauma (HIT) device to inflict closed head TBI in flies. Flies subjected to the HIT device display phenotypes consistent with human TBI such as temporary incapacitation and progressive neurodegeneration. The HIT device uses a spring-based mechanism to propel flies against the wall of a vial, causing mechanical damage to the fly brain. The device is inexpensive and easy to construct, its operation is simple and rapid, and it produces reproducible results. Consequently, the HIT device can be combined with existing experimental tools and techniques for flies to address fundamental questions about TBI that can lead to the development of diagnostics and treatments for TBI. In particular, the HIT device can be used to perform large-scale genetic screens to understand the genetic basis of TBI pathologies.

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Here we describe a method to inflict closed head traumatic brain injury (TBI) in Drosophila. This method provides a gateway to investigate the cellular and molecular mechanisms that underlie TBI pathologies using the vast array of experimental tools and techniques available for flies.

Um Método para infligir Cabeça Fechada Lesão cerebral traumático em<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Dorsal Root Injection gânglio da raiz dorsal e lesão por esmagamento como um modelo para Sensorial Axon Regeneração

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Stab ferida ferimento do peixe-zebra adulto Telencéfalo: Um método para investigar Vertebrados Cérebro Neurogênese e Regeneração

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo