<p class="jove_content"&gt; RN foi parcialmente financiado por uma Marie Curie Europeia concede Re-integração (ERG) do Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia, número do projeto 268324.</p&gt;

1. Isolamento dos PMNs a partir de sangue humano por centrifugação de densidade <ol><li> Desenhe 5 9 tubos ml de sangue venoso heparinizado. </li><li> Preparar gradientes de Ficoll dupla camada (4 gradientes para 5 tubos de sangue) do seguinte modo: 12 ml de Despeje a g / ml de solução de 1,119 densidade Ficoll num tubo de 50 ml e cuidadosamente camada de 10 ml de uma g / ml de solução de densidade Ficoll 1.077 no topo. </li><li> Dilui-se o sangue com um volume igual de PBS. </li><li> Camada do sangue diluído cuidadosamente sobre o gradiente de Ficoll de dupla camada; 20-25 ml por gradiente. </li><li> Centrifugar 20 min a 396 x g num rotor de balde oscilante, 22 ° C sem travagem. </li><li> Prepara RPMI frio contendo 0,05% de Albumina de Soro Humano (RPMI-HSA). Também preparar 9 ml estéril deionizada H 2 O. Pré-cool tanto o meio RPMI e H2O em gelo. </li><li> Aspirar a camada de Ficoll topo contendo plasma (de cor amarela) e PBMC, e a segunda camada de Ficoll (cor branca) com a utilização de uma bomba de vácuo (colocar uma ponta de pipeta esterilizada ema pipeta). </li><li> Recolha as PMNs em tubos de 50 ml, utilizando uma pequena pipeta de plástico (1 tubo para as frações PMN de cada 2 gradientes), e colocá-los no gelo. </li><li> Adicionar RPMI-HSA fria até um volume total de 50 ml e centrifugar durante 10 minutos a 249 xg, a 4 ° C. </li><li> Tira-se o sobrenadante com o uso de uma bomba de vácuo e do vortex suavemente o sedimento (eritrócitos e PMN). </li><li> Adicionar 9 ml deionizada estéril H 2 O e iniciar o temporizador. Parar o choque osmótico hiper após 30 seg exatamente, adicionando 1 ml 10 vezes concentrado PBS. Nota: a 30 segundos são muito críticas. </li><li> Adicionar RPMI-HSA fria até um volume total de 50 ml e centrifugar durante 10 minutos a 249 xg, a 4 ° C. </li><li> Tira-se o sobrenadante com o uso de uma bomba de vácuo e recolher o sedimento em 1 PMN tubo com um volume definido (1-2 ml) RPMI-HSA. </li><li> Determinar a quantidade de células e ajustar a concentração de 1,10 a 7 células / ml. Dependendo do dador, o rendimento isolado de PMN estarão entre nípt 5 x 10 6 e 3 x 10 7 PMNs de cada 9 ml tubo de sangue </li></ol> 2. Por citometria de fluxo para avaliação da mobilização de cálcio em PMNs humanos <ol><li> As células de carga (5 x 10 6 células / ml) com 2 uM Fluo-3-AM em RPMI-HSA e incubar durante 20 min à temperatura ambiente lentamente de balanço, utilizando, por exemplo, um agitador de plataforma oscilante, protegido da luz. </li><li> Entretanto preparar uma diluição em série (por exemplo, 3 vezes) do estímulo a 10x a concentração final. PSMα3 é usado neste protocolo, no entanto qualquer estímulo GPCR, que actua sobre os neutrófilos é adequado. </li><li> Prepara 10x concentrado inibidor do receptor em RPMI-HSA. Quando o inibidor actua no estímulo (eg HDL em PSMα3) pré-incubado 25 ul estímulo com um volume igual de inibidor, durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Lave as células por adição de 10 ml de RPMI-HSA e centrifugar durante 249 xg à temperatura ambiente. Suspenda as células a 5 x10 6 células / ml. </li><li> Imediatamente antes do ensaio, diluir as células a 2x10 6 células / ml em RPMI-HSA e adicionar 200 ul por tubo de células FACS. PMNs diluído são muito frágeis. Mantê-los por muito tempo a esta concentração levará à auto-ativação, o mesmo vale para agitar vigorosa ou pipetagem. </li><li> Fixe o tubo com o citômetro de fluxo, espere 3 segundos e começar a aquisição. Depois de um período de tempo fixo (por exemplo, 8 sec), tire o tubo e adicionar rapidamente 50 mL de estímulo à amostra. Imediatamente voltar a ligar o tubo no suporte da amostra e continuar a aquisição. </li><li> Comece com o menor e terminam com a maior concentração de estímulo. Lava-se a agulha de citómetro de fluxo regularmente após cada ensaio com RPMI-HSA. </li><li> Analisar os dados com software de análise de citometria de fluxo. Comparar o sinal de fluorescência média, antes da adição do estímulo para que, após a adição do estímulo e usar os controlos positivos e negativos adequados para calcular a corrente alternadavação força medida para cada diluição. </li></ol> Alternativamente, quando o inibidor actua sobre os receptores pré-incubar as células com o inibidor. 3. A análise por microscopia de fluorescência de expressão de GFP bactérias após fagocitose por PMNs <ol><li> Crescer S. estirpes de Staphylococcus que contêm uma construção repórter de interesse durante a noite em caldo (com antibióticos quando necessário para manter o plasmídeo repórter). Neste caso MW2 estirpe contendo uma construção repórter da GFP é utilizado 10 PSMα, cultivadas em um tubo de plástico de 50 ml com 5 ml de meio de cultura LB. </li><li> Para remover toda a GFP a partir de O / N expressão, dilui-se as culturas a DO660 de 0,01 e crescer a DO660 de 0,1. Redilute esta cultura 1:30, e monitorar o crescimento até a cultura atingir uma DO660 de 0,1. Recolher as bactérias por centrifugação e lavar uma vez em DPBS. Ressuspender em 1:10 do volume original para se obter uma DO 660 de 1,0 ou roughly 5.10 8 UFC / ml. </li><li> Misturar as bactérias (1,10 7 / ml) com PMN isoladas de fresco (1,10 6 / ml) em RPMI-HSA (proporção de 10:1) num microtubo de 1,5 mL e adicionar soro humano a uma concentração final de 10%. Agitar numa plataforma de agitação durante 10 min a 37 ° C para estimular a fagocitose. Diluir as PMNs carregados com bactérias para 5,10 5 PMN / ml e pipeta de 250 mL em um poço de oito bem compartimentado lamínula. </li><li> Imagem dos PMNs com bactérias em um microscópio. Um microscópio invertido equipado com uma objectiva de NA 40X/0.85 funciona bem e deverá ser encerrada em um ambiente escuro da câmara para manter o ambiente de forma estável, a 37 ° C. Adquirir imagens para uma série de posições pré-definidas utilizando a câmara a cada 5-10 min em ambos os campos luminosos e do canal de GFP para acompanhar a produção da GFP no tempo. </li></ol>

<ol>
	<li>Rigby, K. M., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+innate+host+defense+against+Staphylococcus+aureus+infections.">Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections.</a> Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+Mechanisms+Used+by+Staphylococcus+aureus+to+Avoid+Destruction+by+Human+Neutrophils.">Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).</li><li>Kobayashi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neutrophil+destruction+following+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus.">Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus.</a> J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).</li><li>DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community-associated+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> The Lancet. 375, 1557 (2010).</li><li>David, M. Z., Daum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community-Associated+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus:+Epidemiology+and+Clinical+Consequences+of+an+Emerging+Epidemic.">Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).</li><li>Kretschmer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Formyl+Peptide+Receptor+2+Senses+Highly+Pathogenic+Staphylococcus+aureus.">Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus.</a> Cell Host &amp; Microbe. 7, 463 (2010).</li><li>Prat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homolog+of+formyl+peptide+receptor-like+1+(FPRL1)+inhibitor+from+Staphylococcus+aureus+(FPRL1+inhibitory+protein)+that+inhibits+FPRL1+and+FPR.">A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR.</a> J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).</li><li>Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Staphylococcal+Anti-Inflammatory+Protein+That+Antagonizes+the+Formyl+Peptide+Receptor-Like+1.">A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1.</a> The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).</li><li>de Haas, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+inhibitory+protein+of+Staphylococcus+aureus,+a+bacterial+antiinflammatory+agent.">Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).</li><li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Staphylococcal+Phenol+Soluble+Modulins+by+Serum+Lipoprotein+Particles.">Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles.</a> PLoS Pathog. 8, e1002606 (2012).</li><li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Potential+New+Pathway+for+Staphylococcus+aureus+Dissemination:+The+Silent+Survival+of+S.+aureus+Phagocytosed+by+Human+Monocyte-Derived+Macrophages.">A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> PLoS ONE. 3, e1409 (2008).</li><li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+alpha-phenol+soluble+modulins+contribute+to+neutrophil+lysis+after+phagocytosis.">Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. , (2013).</li><li>Queck, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAIII-Independent+Target+Gene+Control+by+the+agr+Quorum-Sensing+System:+Insight+into+the+Evolution+of+Virulence+Regulation+in+Staphylococcus+aureus.">RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus.</a> Molecular Cell. 32, 150 (2008).</li><li>Baban, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+Bacterial+Imaging+In+Vivo.">Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (69), e4318 (2012).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nos métodos aqui descritos alguns passos são muito crítico. Vamos destacar estes aqui. Para o isolamento dos neutrófilos, por centrifugação em gradiente de densidade é importante para não perturbar as camadas, durante ou após os passos de centrifugação. Quando a aspiração dos neutrófilos utilizando uma pipeta de plástico, certifique-se de não apertar o balão, enquanto na camada de células, tal como ejectar líquido irá perturbar as camadas. Além disso, inspecione visualme...

Os neutrófilos (PMN) são fagócitos profissionais que desempenham um papel chave na resposta imune inata contra Staphylococcus aureus 1. A constante batalha entre o anfitrião eo micróbio levou a uma corrida armamentista de ambos. Recentemente, comunidade-associado (CA) das cepas de S. meticilina resistente aureus (MRSA) surgiram que parecem ser muito eficiente na neutralização de neutrófilos assassinato 2,3. Modulin produção excessiva solúvel fenol (PSMs) de MRSA-CA foi associada a uma maior virulência 4,5. Os neutrófilos humanos pode reconhecer estas PSMs através FPR2 que levam à activação deste acoplado à proteína G do receptor 6. Um dos primeiros eventos é a mobilização das reservas intracelulares de cálcio (Ca2 +). Ca 2 + actua como um mensageiro secundário para uma variedade de funções efectoras incluindo desgranulação de PMN e fagocitose 7. Portanto Ca2 + é um indicador muito sensível dacapacidade funcional dos PSMs para ativar PMNs. Para estudar os efeitos dos PSMs para os neutrófilos, os neutrófilos são isolados frescos e carregado com um corante que fluoresce na mobilização do cálcio. Numa experiência de citometria de fluxo, este rápido mobilização pode ser medido. Usando este método, é possível estudar os efeitos directos de componentes tóxicos e de outros para os neutrófilos, e determinar a concentração mais baixa à qual estes estão activas. Para nós, é uma ferramenta muito útil para estudar o efeito de muitas proteínas produzidas por S. aureus envolvidos na evasão imune, como FPR2 proteína inibidora (FLIPR) 8, FLIPR-like 7 e Quimiotaxia proteína inibidora de Staphylococcus aureus (CHIPS) 9. Todas estas proteínas foram mostradas para inibir a mobilização de cálcio no número de neutrófilos por ligação ao receptor que reconhece o agonista. Recentemente, o nosso grupo descrito que os PSMs estão funcionalmente inibida por lipoproteínas séricas 10 &lt;/ Sup&gt;. Estas lipoproteínas estão abundantemente presentes no sangue e no tecido humano, o que indica que os PSMs exercer a sua função, principalmente no meio intracelular. A disponibilidade do ensaio de mobilização do cálcio nos permitiu medir com precisão o efeito de lipoproteínas do soro sobre a activação dos neutrófilos por os PSMs, indicado pela inibição considerável por concentrações muito baixas de soro. Uma vez que os PSMs estão funcionalmente inibida por soro, a hipótese de que existe uma função importante para os PSMs como toxinas intracelulares. Por isso, procuraram determinar o papel de PSMs após a fagocitose. Para investigar a expressão dos PSMs no espaço intercelular, construímos fusões repórter do promotor do operão psmα para GFP. Quando essas cepas repórter de S. aureus foram fagocitados pelos neutrófilos, indução de expressão foi observado por microscopia de fluorescência de 10. Obviamente, esta technique permite o estudo da expressão de um grande número de genes em S. aureus ou outros agentes patogénicos depois de fagocitose. Uma vez que para S. aureus sobreviver no nicho intercelular é muito importante para superar o sistema imune inato 11 10 12, estudando o papel dos genes ativados neste nicho é altamente relevante para a compreensão de sua virulência.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-3, AM</td>
			<td>Molecular Probes / Life Technologies</td>
			<td>F-1241</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5442-03</td>
			<td>density 1.077 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11191</td>
			<td>density 1.119 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>52400-025</td>
			<td>contains 25 mM HEPES and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, The Netherlands</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td>objective: HCX PL APO 40X/0.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying interactions of staphylococcus aureus with neutrophils by flow cytometry and time lapse microscopy

Nós apresentamos métodos para estudar o efeito de modulins solúveis fenol (PSMs) e outras toxinas produzidas e secretadas por Staphylococcus aureus, nos neutrófilos. Para estudar os efeitos dos PSMs de neutrófilos nos isolar neutrófilos frescos utilizando centrifugação em gradiente de densidade. Estes neutrófilos são carregadas com um corante que fluoresce na mobilização do cálcio. A activação dos neutrófilos por PSMs inicia um aumento rápido e transitório na concentração de cálcio intracelular livre. Numa experiência de citometria de fluxo, este rápido mobilização pode ser medida por monitorização da fluorescência de um corante pré-carregada, que reage com o aumento da concentração de Ca2 + livre. Usando esse método, podemos determinar a concentração PSM necessário para ativar os neutrófilos, e medir os efeitos de inibidores específicos e gerais da ativação de neutrófilos. Para investigar a expressão dos PSMs no espaço intracelular, we foram construídas fusões repórter do promotor do operão PSMα para GFP. Quando essas cepas repórter de S. aureus são fagocitados pelos neutrófilos, a indução da expressão pode ser observada por meio de microscopia de fluorescência.

Citometria de fluxo para análise da mobilização de cálcio em PMNs humanos A incubação de neutrófilos com uma série de concentração de PSMα3 sintéticos, resultando em activação rápida medida pelo fluxo de cálcio, o que é mostrado por um aumento no sinal em FL-1. Pré-incubação de PSMα3 sintético com 0,01%, 0,1% ou 1% de soro humano inibiu significativamente a capacidade de provocar fluxos de cálcio (Figura 1). Análise da expressã...

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Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Nós apresentamos métodos para estudar o efeito de PSMs e outras toxinas segregadas por<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Em neutrófilos utilizando citometria de fluxo e microscopia de fluorescência.

Estudo das interacções de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Com neutrófilos por citometria de fluxo e Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

studying-interactions-staphylococcus-aureus-with-neutrophils-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

13.0K visualizações.  University Medical Center Utrecht. Nós apresentamos métodos para estudar o efeito de PSMs e outras toxinas segregadas por Staphylococcus aureus Em neutrófilos utilizando citometria de fluxo e microscopia de fluorescência.